Как защитить клетки почечных канальцев, пораженные гентамицин-индуцированным апоптозом?

Защитное действие Zhibai Dihuang Wan на клетки почечных канальцев, пораженных гентамицин-индуцированным апоптозом

Для получения дополнительной информации:ali.ma@wecistanche.com

Ключевые слова: Острый почкаболезнь, апоптоз, Гентамицин,Почечная тубулярная клетка, почка.

Абстрактный

Этнофармакологическая значимость: Zhibai Dihuang Wan (ZDW) — древняя традиционная китайская медицина, состоящая из восьми растительных ингредиентов, которая использовалась для лечения хронических заболеваний.почкавоспаления и диабета на протяжении тысячелетий. Тем не менее, влияние ZDW на остроепочкатравма до сих пор неизвестна. Мы намеревались определить влияние ZDW на рост клеток игентамицининдуцированное апоптотическое повреждение вклетки почечных канальцев.

Материалы и методы: Мы экстрагировали ZDW с искусственной кишечной жидкостью и лечили крыс.клетки почечных канальцев(NRK-52E) с различными концентрациями экстракции ZDW. Пролиферация клеток игентамицининдуцированныйапоптозклеток NRK-52E оценивали с использованием мониторинга пролиферации в реальном времени и окрашивания аннексином V соответственно. Вестерн-блоттинг использовали для оценки уровней экспрессии Bcl-2 и каспазы-3. Влияние ZDW нагентамицининдуцированныйпочкаПовреждение также отслеживали у мышей с помощью опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой биотинилированного мечения концов UTP (TUNEL) и измерения креатинина сыворотки и азота мочевины крови.

Результаты. Мы обнаружили, что ZDW в дозе 30 мкг/мл способствует пролиферации клеток крыс.клетки почечных канальцев. ZDW также проявлял дозозависимый защитный эффект противгентамицининдуцированныйапоптозв клетках. Предварительная обработка 3 мкг/мл или 30 мкг/мл ZDW максимально увеличила Bcl-2 и уменьшила расщепленную каспазу-3 вгентамицин-обработанные клетки NRK-52E. Среди растительных ингредиентов ZDW только Phellodendron amurense Rupr., кора (Cortex Phellodendri) и Anemarrhena asphodeloides Bunge, ризома ингибировали какгентамицин-индуцированное снижение Bcl-2 и увеличение количества расщепленной каспазы-3. Phellodendron amurense Rupr., кора и Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневище также ингибируетсягентамицининдуцированныйапоптозв определенных концентрациях; однако эти два ингредиента были менее эффективны, чем ZDW. В мышиной моделигентамицин-индуцированной нефропатии лечение ZDW значительно уменьшало апоптотические клетки в коре почек и улучшало функцию почек.

Выводы. Наши результаты показывают, что ZDW в адекватных дозах ослабляетгентамицининдуцированное апоптотическое повреждение вклетки почечных канальцева также защищаетпочкиизгентамицинИндуцированные травмы у мышей.

1. Введение

Травяные лекарства использовались для лечения различных заболеваний на протяжении многих веков, особенно в китайском обществе. В последнее время потенциальные побочные эффекты трав напочкасообщалось (Isnard Bagnis et al., 2004). В 1991 году нефрологи в Бельгии сообщили о многих молодых женщинах, которые принимали внутрь экстракты китайских трав, содержащих Aristolochia fang chi, в рамках диеты, у которых развилась почечная недостаточность различной степени (Vanherweghem et al., 1993). Было доказано, что воздействие непреднамеренно добавленного растения Aristolochia, содержащего аристолоховую кислоту (АК), является основной причиной повреждения почек, атипии уротелиальных клеток и карциномы (De Broe, 2012). Поскольку традиционная китайская медицина практикуется в основном на Тайване и в материковом Китае, нефропатия АА широко распространена в этих районах и представляет собой потенциальную проблему для общественного здравоохранения (Grollman, 2013). Большинство нефрологов Тайваня рекомендуют пациентам избегать традиционной фитотерапии. Тем не менее, некоторые традиционные растительные лекарственные средства показали себя многообещающими в лечениипочкаболезнь в доклинических исследованиях или клинических испытаниях (Wojcikowski et al., 2006; Wang et al., 2012; Zhang et al., 2012). Хотя крайне важно избегать использования растений Aristolochia в фитопрепаратах, фитопрепараты по-прежнему являются потенциальными кандидатами для лечения некоторых заболеваний.почкаболезни.

Нажмите, чтобы Цистанхе эффекты для надпочечников

Zhi bai Dihuang Wan (ZDW), политравная формула, использовалась для лечения хроническогопочкавоспаления и диабета на протяжении тысячелетий. ZDW производится из Cornus officinalis Siebold & Zucc (13,8%), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., корня, запеченного (Radix Rehmanniae preparata, 27,6%), Dioscorea oppositifolia L. (13,8%), Phellodendron amurense Rupr., кора. (Cortex Phellodendri, 6,9 процента), Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневище (6,9 процента), Paeonia suffruticose Andrews, кора корня (Moutan Cortex, 10,3 процента), Alisma Plantago-Aquatica L., корневище (Rhizoma Alismatis, 10,3 процента) и Poria cocos (Schw.) Wolf (10,3%) и не содержит Aristolochia. Среди этих ингредиентов Cornusofficinalis Siebold & Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., корень, запеченный, Phellodendron amurense Rupr., кора и кокосы Poria, как сообщается, полезны при диабетической нефропатии или хроническом повреждении почек на животных моделях (Yokozawa). и др., 2004; Ким и др., 2008; Цзян и др., 2012; Чжао и др., 2013). ZDW без коры Anemarrhena asphodeloides Bunge и Phellodendron amurense Rupr. также оказывал частичное защитное действие на раннюю диабетическую нефропатию у крыс (He et al., 2007). Эти данные свидетельствуют о том, что ZDW обладает потенциально защитным действием против повреждения почек. Однако влияние ZDW на рост клеток иапоптозизклетки почечных канальцевдо сих пор неясно.

ГентамицинЭто широко используемый аминогликозидный антибиотик для лечения грамотрицательных бактериальных инфекций, но он вызывает острыепочкатравмы примерно у 30 процентов пациентов (Singh et al., 2012). В клетках проксимальных канальцев почек, индуцируяапоптозявляется ключевым цитотоксическим механизмомгентамицин(Серве и др., 2006).Гентамицинвызываетапоптозчерез митохондриально-опосредованный сигнальный путь, включая снижение уровня Bcl-xL и увеличение количества расщепленных каспаз -3 и -9 (Ali, 2003; Juan et al., 2007). На сегодняшний день не существует идеального клинического средства для предотвращениягентамицининдуцированный острыйпочкарана. В этом исследовании мы исследовали влияние ZDW нагентамицининдуцированныйапоптозвклетки почечных канальцевin vitro и in vivo. Наши данные выявили защитный эффект ZDW нагентамицин-обработанныйклетки почечных канальцеви далее показал вклад его ингредиентов в защитный эффект ZDW.

2. Материалы и методы

2.1. Реагенты и приготовление ZDW

Модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM), эмбриональная телячья сыворотка и реагенты для тканевых культур были получены от Life Technologies, Inc. (Гайтерсберг, Мэриленд, США). Все остальные химические реактивы были получены от Sigma Chemical Company (Сент-Луис, Миссури, США). Порошки ZDW (серия № 051941) и ее ингредиенты (Cornus officinalis Siebold & Zucc, партия № C810Y; Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., корень, запеченный, партия № C730N; Dioscorea oppositifolia L., партия № C624N; Phellodendron amurense Rupr., кора, партия № C722Y; Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневище, партия № C805N; Paeonia sufruticosa Andrews, кора корня, партия № C813Y; Alisma Plantago-Aquatica L., корневище, партия № C819N; Poria cocos (Schw.) Wolf, партия № C827N) были приобретены у SunTen Pharmaceutical Co. (Тайбэй, Тайвань). В соответствии с инструкциями производителя, 29 г смеси 8- трав (4 г Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 г Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., запеченный корень, 4 г Dioscorea oppositifolia L., 2 г Phellodendron amurense Rupr., кора, 2 г Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневище, 3 г Paeonia suffruticose Andrews, кора корня, 3 г Alisma Plantago-Aquatica L., корневище и 3 г Poria cocos (Schw.) Wolf) кипятили в 290 мл дистиллированной воды в течение 4 ч при 100 1C, фильтруют, лиофилизируют, получая 7,5 г сухих экстрактов, а затем смешивают с 2,2 г кукурузного крахмала и 5,3 г порошкообразной целлюлозы, получая 15 г ZDW. Все травы были проверены профессором травологии из Исследовательского института Бриона, Тайвань, Китайская республика. Образцы ваучеров были депонированы в гербарии Национального исследовательского института китайской медицины, Тайвань, Китайская республика (номера ваучеров: Cornus officinalis Siebold & Zucc - NHP{{32} }, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., корень, запеченный -NHP-00411, Dioscorea oppositifolia L. - NHP-00600, Phellodendron amurense Rupr., кора - NHP-00369, Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневище - NHP-00196, Paeonia suffruticose Andrews, кора корня - NHP-00169, Alisma Plantago-Aquatica L., корневище - NHP-00424, Poria cocos (Schw.) Wolf - NHP -00309). Травяные препараты (0,1 г) расщепляли 1 мл искусственной кишечной жидкости (1% панкреатин, 50 мМ дигидрофосфат калия, pH 7,5) при 37 1C в течение 2 ч, фильтровали через 0.22- мкм фильтры, а затем применялись в клеточных экспериментах. Кроме того, только искусственную кишечную жидкость также инкубировали при 37 1C в течение 2 ч, фильтровали через фильтры 0,22- мкм, а затем применяли в контрольных группах.

2.2. Анализ отпечатков пальцев методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Качество ZDW измеряли с помощью ВЭЖХ. Вкратце, {{0}}.1 г порошка ZDW растворяли в демонической воде при комнатной температуре в течение 2 часов, фильтровали через фильтры {{10}}.22- мкм. , а затем применяли в анализе ВЭЖХ. Сто мкл раствора наносили на колонку 250 4,6 мм C18- (Grace. Columbia, США) с использованием системы ВЭЖХ Waters, оснащенной 60{{18 }} контроллер и матричный фотодиодный детектор 996 (Уотерс, Сент-Массачусетс, США). Затем образец элюировали линейным градиентом метанола 0–95 процентов в деионизированной воде, pH 7,0, в течение 60 минут при скорости потока 0,8 мл/мин. Элюенты обнаруживали и количественно определяли при 254 нм от 0 до 60 минут при комнатной температуре. Анализ проводился 10 раз, и результаты совпадают.

2.3. Культура клеток

Мы приобрели клетки проксимальных канальцев почек крысы (NRK-52E) в Центре сбора и исследования биоресурсов (Синьчжу, Тайвань). Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением антибиотика/противогрибкового раствора и 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Их выращивали до тех пор, пока монослой не стал сливным. Затем культивированные клетки культивировали в бессывороточной среде в течение ночи перед экспериментом. Экстракты ZDW искусственной кишечной жидкостью добавляли к голодающим клеткам в указанной концентрации, а инкубированную искусственную кишечную жидкость применяли в качестве контрольной обработки. После 24-часовой инкубации образцы клеток собирали и помещали вапоптозанализ и вестерн-блоттинг.

2.4. Мониторинг пролиферации клеток в режиме реального времени

Для мониторинга пролиферации клеток мы использовали систему «xCELLigence» от Roche Applied Sciences (Индианаполис, Индиана, США). Клетки NRK-52E высевали в двух экземплярах на E-планшеты с плотностью 10000 клеток/лунку. Затем планшеты переносили в прибор xCELLi-glance RTCA DP для автоматического мониторинга в режиме реального времени во влажном инкубаторе, содержащем 5 процентов CO 2 при температуре 37 1C. Через 24 часа клетки в Е-планшетах голодали в течение ночи. Для анализа пролиферации к клеткам добавляли экстракты ZDW на 30 мин, а затем 3 ммоль/лгентамицинбыл добавлен к клеткам. Клеточный индекс, произвольная единица, отражающая импеданс клеточного сенсора, измерялся каждые 15 мин. Расчет наклона выполняли с помощью программного обеспечения RTCA версии 1.2 (Roche Applied Sciences). Было проведено три независимых эксперимента.

2.5. Обнаружение апоптоза

Двойное окрашивание флуоресцеинизотиоцианатом (FITC)-аннексин V/йодид пропидия (PI) использовали для обнаруженияапоптозиндуцированныйгентамицинлечение. Обработанные клетки NRK-52E собирали и дважды промывали ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS). Специфическое связывание FITC-аннексина V и окрашивание PI проводили с использованиемапоптознабор для обнаружения (BD Biosciences-Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Затем клетки анализировали с помощью проточной цитометрии.

2.6. Вестерн-блот анализ

Двадцать микрограмм лизата белка NRK-52E наносили на каждую дорожку полоски для блоттинга и анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Антитела к Bcl-2 и каспазе-3 были приобретены у Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) и разведены 1:1000 для анализа. Глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) была обнаружена в качестве контроля нагрузки. Относительные уровни белковых полос количественно определяли с использованием программного обеспечения Quantiscan (Biosoft, Кембридж, Великобритания).

2.7. Животные и лечение

Самцы мышей BALB/c в возрасте 8 недель и массой тела 20–25 г были получены от BioLasco Taiwan (Тайбэй, Тайвань). Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом Тайбэйского медицинского университета по уходу и использованию экспериментальных животных. Животные содержались в центральном помещении, подвергались 12-часовому циклу свет-темнота и регулярно получали крысиный корм и водопроводную воду. Опытная группа мышей (n=6) длягентамицинлечение подвергали внутрибрюшинной (в/б) инъекциигентамицин(20 мг/кг/день) в течение 10 дней. Порошок ZDW (1 или 2 г/кг) растворяли в физиологическом растворе и вводили перорально передгентамицининъекции каждый раз. Мышам контрольной группы (n=6) вводили физиологический раствор перорально и внутрибрюшинно. Всех мышей анестезировали пентобарбиталом в дозе 30–50 мг/кг массы тела внутрибрюшинно (Sigma, Сент-Луис, Миссури) через 1 день после последней инъекции. Затем животных умерщвляли, все еще находясь под действием анестезии, и брали образцы крови из сердца для измерения креатинина сыворотки и азота мочевины крови.почкибыли собраны путем лапаротомии, а ткань коры почек была быстро заморожена в жидком азоте и хранилась в-80C.

2.8. In situ анализ опосредованного дезоксинуклеотидилтрансферазой биотинилированного мечения концов UTP (TUNEL)

Срезы замороженной ткани (4 мкм)почкабыли обработаны флуоресцеином ApopTag in situапоптозкомплект для обнаружения (CHEMICON International, Inc., Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Кратко,почкапредметные стекла были предварительно обработаны протеиназой K и H₂O₂и инкубировали с реакционной смесью, содержащей терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT) и конъюгированную с дигоксигенином dUTP, в течение 1 ч при 37 1C, заливали монтажным раствором, содержащим PI, и, наконец, наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии.

2.9. Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего стандартного отклонения (SD). Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента, где P 0,05 считалось статистически значимым.

3. Результаты

3.1. Влияние ZDW на пролиферацию клеток

Для контроля качества ZDW мы использовали ВЭЖХ для создания хроматограммы отпечатков пальцев, как показано на рис. 1. Сначала мы исследовали влияние экстрактов ZDW на пролиферацию клеток NRK-52E. Чтобы имитировать среду желудочно-кишечного тракта, ZDW переваривали и экстрагировали с использованием искусственной кишечной жидкости, а затем применяли в клеточных экспериментах.

При мониторинге пролиферации клеток в режиме реального времени как кривые, так и наклоны пролиферации показали, что клетки, обработанные 30 мкг/мл ZDW, имели более высокие скорости пролиферации по сравнению с контрольными клетками, обработанными искусственной кишечной жидкостью (рис. 2А и В). Напротив, 300 мкг/мл ZDW значительно снижали скорость пролиферации. Дозировка 30 мкг/мл ZDW содержит 4 мкг/мл Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 мкг/мл Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., корень, запеченный, 4 мкг/мл Dioscorea oppositifolia L., 2 мкг/мл Phellodendron amurense Rupr., кора, 2 мкг/мл Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневище, 3 мкг/мл Paeonia suffruticose Andrews, кора корня, 3 мкг/мл Alisma Plantago-Aquatica L., корневище и 4 мкг г/мл Poria cocos (Schw.) Wolf. Однако вместо этого эти дозы ингредиентов снижали пролиферацию клеток NRK-52E (рис. 2C).Гентамицинзначительно ингибировал рост клеток и даже снижал индекс числа клеток, который частично восстанавливался при обработке 3 или 30 мкг/мл ZDW, как показано на рис. 2А. Высокие дозы ZDW (300 мкг/мл) еще больше усиливали ингибирующий эффектгентамицинна пролиферативную способность клеток. Наши результаты показывают, что низкие дозы ZDW (3–30 мкг/мл) способствуют пролиферации клеток NRK-52E даже в присутствиигентамицинлечение.

3.2. Влияние ZDW на апоптоз

Затем мы оценили влияние экстрактов ZDW нагентамицининдуцированныйапоптозв клетках NRK{{0}}E с помощью окрашивания аннексином V/PI и проточной цитометрии. Как показано на рис. 3, экстракты ZDW от 0,3 до 300 мкг/мл не вызывали значительногоапоптозв клетках NRK-52E. Воздействие 3 ммоль/лгентамицинзаметно повышенный апоптоз клеток. Предварительная обработка клеток ZDW значительно уменьшилагентамицининдуцированныйапоптоздозозависимым образом, а ингибирующий эффект достигал пика при 30 мкг/мл и снижался при 300 мкг/мл ZDW (рис. 3).

ZDW извлекает защищенные клетки NRK-52E изгентамицининдуцированныйапоптоз. Чтобы подтвердить этот результат, мы также отслеживали влияние ZDW на апоптотический сигнальный путь, индуцированныйгентамицин. В нормальных клетках NRK{{0}}E концентрации ZDW от 0,3 до 300 мкг/мл не оказывали существенного влияния на экспрессию Bcl-2 и расщепление каспазы-3 (рис. 4).Гентамицинлечение значительно снижало экспрессию Bcl-2 и индуцировало расщепление каспазы-3 в клетках NRK-52E. Предварительная обработка клеток ZDW улучшала экспрессию Bcl-2 вгентамицин-обработанных клеток, и значительно уменьшилосьгентамицин-индуцированное расщепление каспазой-3 (рис. 4).

3.3. Влияние ингредиентов ZDW на апоптоз

Результаты показали, что наиболее эффективная концентрация ZDW была близка к 30 мкг/мл. Теоретически 30 мкг/мл ZDW содержат 4 мкг/мл Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 мкг/мл Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., корень, запеченный, 4 мкг/мл Dioscorea oppositifolia L., 2 мкг/мл Phellodendron amurense Rupr., кора, 2 мкг/мл Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневище, 3 мкг/мл Paeonia suffruticose Andrews, кора корня, 3 мкг/мл Alisma Plantago-Aquatica L., корневище и 3 мкг г/мл Poria cocos. Однако экстракты этих ингредиентов в указанных концентрациях не влияли на пролиферацию NRK-52E-клеток, как показал мониторинг пролиферации клеток в режиме реального времени (данные не показаны). Далее мы отдельно отслеживали ингредиенты ZDW на предмет их влияния на экспрессию Bcl-2 и расщепление каспазы-3гентамицин-обработанные клетки NRK-52E. На рис. 5 показано, что Cornus officinalis Sieb. et Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., корень, запеченный, Dioscorea напротив, Paeonia suffruticose Andrews, кора корня, Alisma Plantago-Aquatica L., корневище и Poria cocos не влияли на экспрессию Bcl-2 и расщепление каспазы-3 вгентамицин-обработанные клетки. Только 0,2 мкг/мл Phellodendron amurense Rupr., кора и Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневище при 4 и 60 мкг/мл ингибировали обагентамицин-индуцированное снижение Bcl-2 и одновременное увеличение расщепления каспазой-3 (рис. 5).

Подобно результатам вестерн-блоттинга, окрашивание аннексином V/PI показало, что Phellodendron amurense Rupr., кора в концентрации 0.2 мкг/мл, и Anemarrhena asphodeloides Bunge, ризома в концентрации 4 и 60 мкг/мл значительно ингибировалигентамицининдуцированныйапоптоз(рис. 6). Другие растительные ингредиенты не оказывали антиапоптотического действия нагентамицин-обработанные клетки NRK-52E, выявленные с помощью проточной цитометрии (данные не показаны). ZDW содержит 6,9% корневища Anemarrhena asphodeloides Bunge. Дозировка 60 мкг/мл корневища Anemarrhena asphodeloides Bunge значительно превышала количество, содержащееся в 300 мкг/мл ZDW, что было самой высокой дозировкой, использованной в этом исследовании. Дозировка коры Phellodendron amurense Rupr. 0,2 мкг/мл была аналогична количеству коры Phellodendron amurense Rupr., содержащемуся в 3 мкг/мл ZDW. Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневище в дозе 4 мкг/мл было близко к количеству Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневища, содержащегося в 30 мкг/мл ZDW. Концентрации ZDW как 3, так и 30 мкг/мл оказывали значительное антиапоптотическое действие (рис. 2), которое может частично быть результатом Phellodendron amurense Rupr., кора, и Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневище.

3.4. Защитное действие ZDW на почки

Защитное действие ZDW нагентамицининдуцированныйапоптозбыло дополнительно доказано на модели животных мышей. Мышей лечилигентамицин(20 мг/кг/день) или физиологический раствор в качестве контроля; экспериментальные группы дополнительно получали ZDW (1 или 2 г/кг/сут). По окончании курса лечения (9 дней)почкисобирали лапаротомией и делали срезы для анализа TUNEL in situ. Как показано на рис. 7, ядра впочкасрезы проявлялись в виде ярких пятен, окрашенных PI. Рассеянные и яркие ядра, окрашенные TUNEL, можно было обнаружить по всей коре почек вгентамицин-леченых животных, однако в контрольных образцах они выявлялись редко. Лечение ZDW уменьшеногентамицининдуцированный апоптоз ядер дозозависимым образом. Большинство ядер, меченных TUNEL, были видны в эпителии проксимальных канальцев. ZDW ингибирует in vivoгентамицининдуцированная клеткаапоптозв крысеклетки почечных канальцев. Почечную функцию подопытных мышей также контролировали путем измерения концентрации азота мочевины в крови и креатинина в сыворотке.

На рис. 8 показано, что концентрации азота мочевины крови и креатинина сыворотки были повышены вгентамицингруппы, получавшие ZDW, и лечение ZDW значительно ингибировало этигентамицин-индуцированные увеличения. Эти результаты свидетельствуют о том, что ZDW оказывает защитное действие на почки in vivo.

4. Дискуссия

В этом исследовании мы сосредоточились на влиянии ZDW нагентамицининдуцированныйапоптозу крыс проксимальнееклетки почечных канальцев. Основные результаты показали, что ZDW (3 и 30 мкг/мл) ослаблялгентамицин-индуцированное апоптотическое повреждение в клетках NRK-52E (рис. 3). Предварительная обработка ZDW также ингибировалагентамицин-индуцированные апоптотические сигналы, включая снижение Bcl-2 и увеличение расщепления каспазой-3 (рис. 4). В мышиной моделигентамицинтоксичность, лечение ZDW значительно уменьшило количество апоптотических клеток в коре почек и улучшило функцию почек (рис. 7 и 8). Наши результаты показывают, что ZDW защищаетклетки почечных канальцевизгентамицининдуцированныйапоптоз. Кроме того, мы также обнаружили, что ZDW в дозе 30 мкг/мл способствует пролиферации клеток NRK- 52E (рис. 2), что может способствовать восстановлению почечных канальцев изострыйпочкаболезнь. Однако ZDW в высоких дозах (300 мкг/мл) снижал пролиферацию клеток, а также уменьшался его антиапоптотический эффект (рис. 2 и 3). Эти результаты показывают, что ZDW в высоких дозах цитотоксичен дляклетки почечных канальцев. Поэтому мы предполагаем, что введение ZDW в адекватных дозах будет полезным для пациентов сгентамицининдуцированныйпочкарана.

Травяные препараты, используемые в клеточных экспериментах, переваривали и экстрагировали с использованием искусственной кишечной жидкости, содержащей панкреатин. Панкреатин состоит из амилазы, липазы и протеазы. В принципе, биодоступные молекулы в растительных лекарственных средствах могут быть получены с использованием лабораторной экстракции, которая имитирует среду желудочно-кишечного тракта в таких деталях, как присутствующие химические вещества и ферменты, температура, время воздействия и рН. В нашей системеклетки почечных канальцевимели возможность взаимодействовать с биодоступными молекулами в лекарственных травах, но не с сырьем. Эффективные биодоступные молекулы ZDW в нашей системе до сих пор неизвестны. Обнаружение поглощения ZDW вклетки почечных канальцевпока сложно, потому что нет подходящей цели для мониторинга. Однако искусственные кишечные экстракты ZDW оказывали дозозависимый эффект в клеточных экспериментах. Эти эксперименты предполагают, что искусственные кишечные экстракты ZDW содержат эффективные биодоступные молекулы, действующие на клетки почечных канальцев. С другой стороны, пероральный ZDW также оказывает дозозависимое выраженное почечное защитное действие угентамицинмышей, получавших лечение (рис. 7 и 8). Эти данные предполагают, что эффективные молекулы искусственных кишечных экстрактов ZDW также могут существовать впочкимышей, получавших ZDW. Наши результаты показывают фармакологическую согласованность между клеточными исследованиями с искусственными кишечными экстрактами растительных лекарственных средств и исследованиями на животных с пероральными растительными лекарственными средствами. Применение искусственных кишечных жидкостей в клеточных исследованиях доступно недавно. В клетках Caco-2 искусственные кишечные жидкости использовали для исследования характеристик клеточного поглощения L-валил-ара-С (Cheon et al., 2006). Пероральную биодоступность загрязнителей почвы измеряли in vitro с использованием искусственных кишечных жидкостей (Ellickson et al., 2001). Биодоступность мышьяка в различных видах риса также изучалась с использованием системы желудочно-кишечного тракта in vitro (He et al., 2012). Искусственная экстракция из желудочно-кишечного тракта дала результаты, разумно согласующиеся с клиническими измерениями биодоступности мышьяка, измеренными с помощью анализа мочи у взрослых людей после приема внутрь мышьяксодержащих препаратов традиционной китайской медицины (Koch et al., 2007). Кроме того, панкреатин в искусственной кишечной жидкости будет самоперевариваться и терять свою ферментативную активность во время инкубации 37 1C. Концентрация панкреатина в клеточных экспериментах также была очень низкой (0,3 30 м.д.). Влияние панкреатина на пролиферацию клеток иапоптозочень ограничен. Мы предполагаем, что искусственная экстракция кишечной жидкости является одним из идеальных методов экстракции традиционных растительных лекарственных средств в экспериментах с клеточными культурами.

Среди растительных ингредиентов ZDW только Phellodendron amurense Rupr., кора и Anemarrhena asphodeloides Bunge, ингибированные корневищагентамицининдуцированныйапоптозпри определенных концентрациях (рис. 5 и 6). Phellodendron amurense Rupr., кора и Anemarrhena asphodeloides Bunge, корневище должны играть роль в защитном действии ZDW на клетки NRK-52E. Кора Phellodendron amurense Rupr. содержит ряд алкалоидов, таких как берберин, пальматин и ятроризин. Кора Phellodendron amurense Rupr. является известным противовоспалительным средством (Mori et al., 1995; Uchiyama et al., 1989) и снижает окислительный стресс в организме.почкидиабетических крыс (Kim et al., 2008). Anemarrhena asphodeloides Bunge широко используется в традиционной китайской медицине. Корневища Anemarrhena asphodeloides Bunge обладают антидиабетическим, антитромбоцитарным и мочегонным действием (Takahashi et al., 1985). Тимосапонины, выделенные из корневищ Anemarrhena asphodeloides Bunge, подавляют агрегацию тромбоцитов и индуцированную АК генерацию супероксида в нейтрофилах человека (Zhang et al., 1999a, 1999b). Anemarrhena asphodeloides Bunge также играет важную защитную роль при повреждении головного мозга, вызванном ишемией (Oh et al., 2007). В отличие от ZDW, Phellodendron amurense Rupr., коры и Anemarrhena asphodeloides Bunge корневища проявляли антиапоптотические эффекты в ограниченном диапазоне концентраций (рис. 3 и 6). Кроме того, 30 мкг/мл ZDW способствовали пролиферации клеток, но все ингредиенты в 30 мкг/мл ZDW вместо этого снижали пролиферацию клеток (рис. 2C). Этот результат свидетельствует о том, что стимулирующий пролиферацию эффект ZDW не может быть результатом отдельных его ингредиентов. Защитный эффект ZDW может быть результатом, по крайней мере, частично, синергетического эффекта, вызываемого ингредиентами, или образования модифицированных молекул, образующихся в процессах фармацевтического приготовления ZDW. Традиционно многие практикующие специалисты китайской медицины считают, что политравная формула обычно более эффективна, чем лекарство из одной травы, что подтверждается нашими результатами.

В этом исследованиигентамицинконцентрация, применяемая в экспериментах с клеточными культурами, была аналогична ранее опубликованным исследованиям (Juan et al., 2007).Гентамицинконцентрации 1–3 ммоль/л эффективно индуцировалиапоптозвклетки почечных канальцев, и этот диапазон концентраций близок к in vivoпочкауровни, обнаруженные во времягентамицинпротивомикробное лечение у мышей и крыс (El Mouedden et al., 2000a, 2000b; Sandoval and Molitoris, 2004; Servais et al., 2005). Другими словами,гентамицинконцентрации, использованные в этом исследовании in vitro, были аналогичны концентрациям, обнаруженным у мышей.почкив естественных условиях во времягентамицинлечение. В нашем эксперименте с мышамигентамицинвводили в дозе 20 мг/кг внутрибрюшинно 1 раз в сутки игентамицининдуцированныйапоптознаблюдали у мышейпочки(рис. 7). Эта доза предлагается как равная поддерживающей дозе для взрослого пациента с предполагаемым клиренсом креатинина 90 мл/мин (El Mouedden et al., 2000a). Кроме того, в этом исследовании защитная доза ZDW составляла от 1 до 2 г/кг/день. Метаболическая эффективность мыши в 7-8 раз ниже, чем у человека. Учитывая разницу между скоростью метаболизма мышей и людей, дозировка ZDW в исследованиях на животных близка к традиционному применению ZDW у людей. Эти результаты обеспечивают основу для будущих исследований на людях.

Каспазозависимая передача сигналов апоптоза играет ключевую роль вгентамицининдуцированныйапоптоз. В митохондриальном пути каспаза-3 является каспазой-палачом, которая может расщепляться до активного состояния каспазой-9, которая активируется из прокаспазы-9 цитозольным цитохромом с (Padanilam, 2003; Jiang and Wang , 2004). Митохондриальное высвобождение цитохрома с регулируется белками семейства Bcl-2, которые связываются с внешней мембраной митохондрий и блокируют отток цитохрома с (Yang et al., 1997). В нашем исследовании

гентамицинповышенное расщепление каспазы-3 и снижение экспрессии Bcl-2 в клетках NRK-52E. Эти митохондриально-опосредованные явления апоптоза были обращены вспять при лечении ZDW. Основываясь на результатах этого исследования, мы предположили, что ZDW защищаетклетки почечных канальцевизгентамицинИндуцированное апоптотическое повреждение за счет ингибирования митохондриального пути.

5. Выводы

Таким образом, ZDW в адекватных дозах способствует пролиферации клеток и ингибируетгентамицининдуцированныйапоптозв крысеклетки почечных канальцев. ZDW также снижаетгентамицин-индуцированная почечная токсичность in vivo. ZDW может иметь терапевтический потенциал для пациентов сгентамицининдуцированныйпочкарана.

Благодарности

Это исследование спонсировалось Бюро укрепления здоровья Министерства здравоохранения Китайской Республики (DOH98-HP-1106).