Сероводород ослабляет почечную И/Р-индуцированную активацию воспалительной реакции и апоптоза посредством регуляции Nrf2-опосредованного ингибирования сигнального пути NLRP3
Mar 14, 2022
Абстрактный. Поражение почек при ишемии/реперфузии (И/Р) может привести к остромупочечная недостаточность, отсроченная функция трансплантата и отторжение трансплантата. Нуклеотид-связывающий домен олигомеризации NOD-подобный рецептор, содержащий пириновый домен 3 (NLRP3), опосредованное воспалением, участвует в развитиипочечныйрана. Nrf2 ускоряет активацию сигнального пути NLRP3 и дополнительно регулирует воспалительную реакцию. Кроме того, сероводород выполняет защитную роль впочечная травма; однако подробный основной механизм остается плохо изученным. В настоящем исследовании изучалось, участвуют ли пути Nrf2 и NLRP3 в регулируемых сероводородом процессах.почечныйИ/Р-индуцированная активация воспалительной реакции и апоптоза. Мыши дикого типа и мыши с нокаутом Nrf2 (KO) подверглись хирургическому вмешательству, чтобы индуцироватьпочечныйI/R через пережатие билатеральногопочечныйножки. В общей сложности 20 мг/кг MCC950 (ингибитор NLRP3) вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение 14 дней до операции.почечнаяткани и кровь были собраны у мышей модели I / R для анализа уровней экспрессии мРНК NLRP3 и Nrf2, доменов, содержащих NLRP3, PYD и CARD, уровней экспрессии белков каспазы-1, IL-1, Nrf2 и гемоксигеназы 1, апоптоза клеток, секрецию фактора некроза опухоли, цитокинов ИЛ-1 и ИЛ-6 ипочечныйгистопатология и функция.почечнаяИ/Р активировал сигнальные пути NLRP3 и Nrf2. И наоборот, лечение MCC950 ингибировало активацию сигнального пути NLRP3 и предотвращало индуцированный И/Рпочечная травмавыбросом цитокинов и апоптозомпочечныйМыши модели I/R. Гидросульфид натрия (NaHS) не только облегчал повышение уровня экспрессии белка NLRP3, но также уменьшалпоражение почек,высвобождение цитокинов и апоптоз клеток, индуцированный I/R почек у мышей дикого типа, но не у мышей Nrf2-KO. NaHS облегчал активацию воспалительных процессов NLRP3,поражение почек,воспалительная реакция и клеточный апоптоз через сигнальный путь Nrf2 у мышей с моделью I/R почек.
CISTANCHE УЛУЧШИТ ПОЧЕЧНУЮ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ
Введение
Почечная ишемия/реперфузия (И/Р) является ведущей причиной острогоповреждение почек(ОПН), которое обычно возникает во времяпочечныйхирургии и предрасполагает людей к тяжелой дисфункции в нескольких системах органов. И/Р-индуцированная гибель клеток и воспаление внутрипочечныйткани связано со сложными патофизиологическими процессами и способствует снижениюфункция почек,тем самым приводя к накоплению продуктов метаболизма (1). В дополнение к индуцированной ишемиейпочечныйПри повреждении ткани реперфузия также запускает сложный патофизиологический каскад, который включает чрезмерное высвобождение свободных радикалов и накопление воспалительных клеток, что впоследствии способствует воспалению и дальнейшему усугублению локальной ишемии и клеточного повреждения (2).
Подсемейства нуклеотидсвязывающего домена и семейство, содержащее богатые лейцином повторы, играют ключевую роль в развитии воспалительной реакции (3). Пириновый домен семейства NLR содержит инфламмасому 3 (NLRP3) (ранее известная как домены NACHT, LRR и PYD, содержащие белок 3 и криопирин), которая на сегодняшний день является наиболее охарактеризованной инфламмасомой. Во все большем числе исследований сообщается об ассоциации между NLRP3 иРенал И/Р. При ОПП NLRP3 участвует впочечныйИ/Р травма (4,5). Например, нокдаун NLRP3 и его адаптера, содержащего домен PYD и CARD (ASC), облегчает индуцированный I / R.почечныйдисфункцией и избыточным притоком нейтрофилов впочечная ткань(6). Кроме того, нокдаун NLRP3 и/или каспазы-1 защищает мышей от ОПП, вызванного сепсисом или липополисахаридом (7,8). Эти данные свидетельствуют о том, что инфламмасома NLPR3 может играть ключевую роль в патогенезепоражение почек.
Nrf2 представляет собой эндогенный антиоксидантный ген, расположенный в цитозоле, который соединяется с Kelch-подобным ECH-ассоциированным белком 1 (Keap). После активации Nrf2 высвобождается из Keep и перемещается в ядро, где впоследствии связывается с элементами, отвечающими за антиоксидантный ответ, чтобы инициировать транскрипцию нижестоящих антиоксидантных и цитозащитных генов-мишеней, таких как супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатион-S-трансфераза. изоферменты, каталитические и модифицирующие субъединицы -глутамилцистеинлигазы и НАДФ(Н): хиноноксидоредуктаза (9). Ранее сообщалось, что Nrf2 связан с ОПП, вызванным воздействием окружающей среды, ишемией или ксенобиотиками (10). Помимо его заявленной защитной роли при повреждении тканей, предыдущие исследования также продемонстрировали, что избыточная экспрессия Nrf2 подавляет воспалительную активность NLRP3 и улучшает повреждение тканей (11-13). Однако основной механизм сигнального пути Nrf2 и его влияние на активацию воспалительных процессов NLRP3 впочечныйИ/Р остается неизвестным.Сероводород (H2S) получил признание благодаря своей способности регулировать гомеостаз млекопитающих и основные клеточные процессы, такие как аутофагия (14). В ряде исследований сообщается, что H2S выполняет защитную роль против апоптоза, окислительного стресса и воспаления в организме.почечная травма(15‑20). Тем не менее, основной защитный механизм H2S впочечная травмаиндуцированный И/Р остается неизвестным. Поэтому в настоящем исследовании изучались уровни экспрессии NLRP3 и его адаптера, ASC, у мышей с моделью I/R почек, а затем определялось влияние Nrf2 на экспрессию NLRP3. Настоящее исследование также направлено на определение того, защищает ли H2Sпочечная тканьпротивпоражение почек,воспаление и апоптоз посредством Nrf2-опосредованного ингибирования NLRP3.
Ключевые слова:почечная ишемия/реперфузионное повреждение, Nrf2, сероводород, апоптоз, повреждение почек; почечная недостаточность
CISTANCHE УЛУЧШИТ ЗАБОЛЕВАНИЕ ПОЧЕК / ПОЧЕК
материалы и методы
Создание модели I/R почек и групп лечения.Всего 24 самца мышей дикого типа (масса 20-25 г, возраст 6-8 недель) были получены из Центра лабораторных животных Академии военно-медицинских наук (Пекин, Китай). Кроме того, девять самцов мышей с нокаутом Nrf2 (KO) (вес 20–25 г, возраст 6–8 недель) были получены от Junke Biological Co., Ltd. Все протоколы животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Больница общего профиля Тяньцзиньского медицинского университета (разрешение № IRB2020-DW-04; Тяньцзинь, Китай), и были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и количество используемых животных. Мыши были акклиматизированы к окружающей среде в течение 3 дней до эксперимента при температуре 22°С, влажности 40-60%, 12-часовом цикле свет/темнота и свободном доступе к воде и корму для грызунов. После того, как мышей анестезировали внутрибрюшинно (в/б) пентобарбиталом натрия в дозе 50 мг/кг, двустороннеепочечныйножки лигировали на 30 мин с помощью зажимов для микроаневризм. После этого зажимы микроаневризмы были сняты. В контрольной группе операция проводилась по той же схеме; Однако,почечныйножки не перевязывались. После операции для восстановления мышей использовали 0,9-процентный раствор хлорида натрия. Затем мышей умерщвляли после реперфузии в течение 24 часов. В общей сложности 24 мыши дикого типа были случайным образом разделены на следующие шесть групп: i) контрольная (Con) группа (n=9); ii) группа I/R (n=9); iii) I/R плюс группа MCC950 (n=3); и iv) I/R плюс группа NaHS (n=3). В общей сложности девять мышей Nrf2-KO были случайным образом разделены на следующие три группы: i) группа Con (n=3); ii) группа I/R (n=3); и iii) I/R плюс группа NaHS (n=3).
Согласно предыдущим исследованиям и предварительным экспериментам (21,22), 20 мг/кг MCC950 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) вводили (внутрибрюшинно) ежедневно в течение 14 дней до операции в И/Р плюс MCC950. группа. Всего 50 мкмоль/кг гидросульфида натрия [NaHS; айпи; разведенный в нормальном (0,9 процента) физиологическом растворе; Сигма-Олдрич; Merck KGaA] вводили до операции в группе I/R плюс NaHS. Как только все экспериментальные процедуры были завершены, мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков и собирали ткань и кровь для последующего анализа.
Вестерн-блоттинг. Ткань почкибыл собран у мышей модели I/R после 24-часовой реперфузии для анализа уровней экспрессии белка. Вкратце, общий и нуклеиновый белок экстрагировали с использованием буфера RIPA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) и определяли концентрацию белка с использованием набора для анализа белка BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.). В общей сложности 40 мкг белка на дорожку отделяли с помощью 10-процентного SDS-PAGE и переносили на поливинилидендифторидные мембраны, затем блокировали 5-процентным молоком на 2 часа при комнатной температуре. Затем мембраны инкубировали со следующими первичными антителами в течение ночи при 4°C: анти-NLRP3 (1:500; кат. № ab214185; Abcam), анти-ASC (1:200; кат. № sc-514414; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), анти-каспаза-1 (1:200; каталожный номер sc-56036; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), анти-IL-1 (1:1,000; кат. , № ab200478; Abcam), анти-Nrf2 (1:1, 000; кат. № ab137550; Abcam), анти-гемовая оксигеназа (HO)-1 (1:2, 000 ; кат. № ab68477; Abcam), анти-актин (1:2, 000; кат. № ab8227; Abcam) и анти--гистон Н3 (1:2, 000; кат. , № ab176842; Abcam). После инкубации с первичными антителами мембраны инкубировали с соответствующими HRP-конъюгированными вторичными антителами (1:5, 000; кат. № ab6721 и ab6728; оба Abcam) в течение 1 ч при комнатной температуре. Белковые полосы визуализировали с помощью набора для улучшенной хемилюминесценции (Thermo Fisher Scientific, Inc.) с использованием системы Bio-Imaging (Bio-Rad Laboratories, Inc.) и полуколичественно определяли с использованием программного обеспечения Quantity One (V4.6) (Bio-Rad Laboratories). , ООО). Уровни экспрессии белка нормализовали до актина для цитоплазматического белка или гистона для нуклеинового белка.
Обратная транскрипция – количественная(RT-q)ПЦР.Ткань почкибыл собран у мышей модели I / R после 24-часовой реперфузии для анализа уровней экспрессии мРНК. Вкратце, тотальную РНК экстрагировали из ткани с использованием реагента TRIzol® (каталожный номер 15596026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Тотальную РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора для синтеза кДНК RevertAid First Strand (кат. № K1621; Thermo Scientific™; Thermo Fisher Scientific, Inc.) в соответствии с протоколом производителя. Затем кПЦР проводили с использованием SYBR PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) на системе ПЦР в реальном времени 7500 (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Условия термоциклирования были следующими: денатурация при 95°С в течение 5 мин; 40 циклов при 95°С по 15 с; и удлинение при 60°С в течение 20 сек. Последовательности ген-специфических праймеров перечислены в таблице I. Относительные уровни экспрессии генов-мишеней рассчитывали с использованием метода 2-ΔΔCq (23) и нормализовали к уровням экспрессии GAPDH.
Иммуногистохимия (ИГХ). Ткань почкибыл собран у мышей модели I / R после 24-часовой реперфузии для определения уровней экспрессии NLRP3 и Nrf2. Кратко,почкаткань фиксировали при комнатной температуре в течение 48 ч в 10-процентном формалине, заливали в парафин и нарезали на срезы толщиной 5 мкм. Затем срезы блокировали 5-процентным молоком при 37°C в течение 30 минут и инкубировали с анти-NLRP3 (1:100; кат. № ab214185; Abcam) или анти-Nrf2 (1:200; кат. № ab137550; Abcam) первичные антитела в течение ночи. После инкубации с первичным антителом срезы инкубировали с меченым HRP вторичным антителом против кролика (1:200; кат. № ab214880; Abcam) при 37°C в течение 30 мин, проявленным с использованием раствора диаминобензидина для<3 min="" and="" counterstained="" with="" 0.5%="" hematoxylin="" for="" 3="" min="" at="" room="" temperature.="" a="" light="" microscope="" was="" used="" to="" visualize="" ihc="" staining="" (magnification,="" x200;="" biorevo="" bz‑9000;="" keyence="">
Анализ функции почек. В общей сложности 2-3 мл крови было собрано после центрифугирования при 3,000 xg в течение 10 минут при 4°C от мышей модели I/R после 24-часовой реперфузии. Получена сыворотка для анализафункция почекс помощью ИФА для определения уровня креатинина (кат. № C011; Нанкинский институт биоинженерии Цзяньчэн) и азота мочевины крови (АМК; кат. № C013; Нанкинский институт биоинженерии Цзяньчэн) в соответствии с инструкциями производителя.Травма почекУровни молекулы-1 (KIM-1) в сыворотке измеряли с помощью ELISA (каталожный номер EK0880; Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя.
Окраска гематоксилином и эозином.Ткань почкибыл собран у мышей модели I / R после 24-часовой реперфузии для оценкипочечныйгистопатологические изменения. Ткань фиксировали при комнатной температуре в течение 48 ч в 1% формалине, а затем заливали в парафин. Срезы, залитые парафином, нарезали на срезы толщиной 5 мкм и окрашивали 0,5% гематоксилином в течение 5 минут и эозином в течение 3 минут при комнатной температуре (25°C). Наличие кровоизлияния, некроза канальцевых клеток, дилатации канальцев и образования цитоплазматических вакуолей в ткани оценивали следующим образом: 0, нормапочка;1, минимальный ущерб; 2, средний ущерб; и 3, серьезное повреждение (24).Почечная травмабаллы рассчитывались слепым методом двумя исследователями под световым микроскопом (увеличение х200; Biorevo BZ-9000; Keyence Corporation).
ИФА-анализ уровней ФНО-, ИЛ-1 и ИЛ-6. Кровь собирали (1 мл) у мышей модели I/R после 24-часовой реперфузии. Сыворотку получали центрифугированием при 3,000 xg в течение 10 мин при 4°С. Сывороточные уровни TNF- (кат. № MTA00b), IL-1 (кат. № MLB00C) и IL-6 (кат. № M6000B) анализировали с использованием коммерческие наборы ELISA (R&D Systems, Inc.) в соответствии с протоколом производителя на устройстве для считывания микропланшетов (номер по каталогу CA94089; Molecular Devices, LLC).
CISTANCHE УЛУЧШИТ ПОЧЕЧНУЮ ИНФЕКЦИЮ
Окрашивание ТУНЕЛЬ.Ткань почкисобирали у мышей с моделью I/R после 24-часовой реперфузии для оценки клеточного апоптоза с использованием окрашивания TUNEL. Вкратце, ткань фиксировали при комнатной температуре в течение 48 часов в 10-процентном формалине, заливали в парафин и нарезали на срезы толщиной 5 мкм. Срезы инкубировали с реагентом TUNEL во влажной камере при 37°C в течение 60 мин в темноте (Roche Diagnostics) и окрашивали DAPI в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем случайным образом выбирали 10 полей зрения при высоком увеличении и наблюдали в каждом срезе с помощью флуоресцентного микроскопа (увеличение х10).Статистический анализ. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение трех экспериментов и проанализированы с помощью GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). Статистические различия между двумя группами были проанализированы с использованием парного критерия Стьюдента. Статистические различия между более чем тремя группами были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом множественных сравнений Тьюки. Все данные были нормально распределены и имели одинаковую дисперсию. п<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Полученные результаты
Лечение MCC950 предотвращает индуцированную И/Р активацию передачи сигналов NLRP3 послепочечная травмау мышей. Путь воспаления NLRP3 активируется и играет решающую роль вповреждение почек(25,26). В предыдущем исследовании также сообщалось, что передача сигналов NLRP3 активируется в почечной ткани мышей через 24 часа после реперфузии (4). Таким образом, 24 часа после реперфузии были выбраны в качестве текущей точки времени оценки. Уровни экспрессии белка NLRP3 повышались при повреждении почек I / R в группе I / R по сравнению с контрольной группой (Con) (рис. 1A и B). Аналогичная тенденция наблюдалась в уровнях экспрессии мРНК NLRP3 (рис. 1С). Кроме того, количество NLRP3-позитивных клеток увеличилось в группе I / R по сравнению с группой Con, что было определено окрашиванием IHC (рис. 1D и E).
Чтобы определить основной механизм активации воспалительной реакции NLRP3 и влияние на нижестоящий сигнальный путь после повреждения почек I / R, мышей лечили ингибитором NLRP3 MCC950. Результаты Вестерн-блоттинга продемонстрировали, что I/R повышает уровень экспрессии белка NLRP3 и его адаптера ASC и способствует созреванию от про-каспазы-1 до каспазы-1 и от про-IL-1 до IL-1 в группе I/R по сравнению с группой, получавшей I/R. Группа Con (рис. 2A‑E). Эти результаты показали, что I/R почек может индуцировать активацию воспалительного пути NLRP3, а лечение MCC950 может снижать уровни экспрессии NLRP3, ASC, каспазы-1 и IL-1 после повреждения I/R почек.
Влияние инфламмасомы NLRP3 напочечная травма, воспаление и апоптоз у мышей с моделью I/R почек. Чтобы
определить влияние NLRP3 на повреждение почек, мышей модели I/R лечили ингибитором NLRP3 MCC950. У мышей с моделью I/R почек наблюдались значительно повышенные уровни BUN, сывороточного креатинина и KIM-1, что является биомаркером повреждения почек (рис. 3A-C), что указывает на успешную индукцию I/R повреждения почек. Гистологическое исследование почечной ткани мышей с моделью I/R выявило повышенную гистологическую оценку, о чем свидетельствовали выраженный набухание канальцевого эпителия, дилатация канальцев и интерстициальный отек, вакуолярная дегенерация и потеря щеточной каймы, что позволяет предположить, что почечная I/R может способствовать значительное повреждение почечной ткани и увеличение гистологического показателя (рис. 3D и E). Ингибирование NLRP3 с помощью лечения MCC950 значительно снижало вызванное I/R увеличение уровней BUN, креатинина и KIM-1 и уменьшало гистологическую оценку, при этом в почечной ткани было обнаружено меньшее количество сильно поврежденных канальцев (рис. 3A-E).
Кроме того, уровни воспалительных факторов и апоптотических клеток после введения MCC950 анализировали у мышей с моделью I/R почек. Показатели воспаления, включая TNF-, IL-1 и IL-6, были значительно повышены в группе I/R по сравнению с группой Con (рис. 3F-H). Более того, по сравнению с группой Con, процент апоптотических клеток был значительно увеличен через 24 часа после реперфузии в группе I/R (рис. 3I и J). По сравнению с группой I/R секреторные уровни цитокинов, TNF-, IL-1 и IL-6, а также процент апоптотических клеток были снижены при лечении MCC950 в группе I/R плюс MCC950 (рис. 3F-J). ). Эти результаты показали, что ингибирование инфламмасомы NLRP3 может предотвращать высвобождение воспалительных факторов и апоптоз почечной ткани, вызванный И/Р.
Nrf2 необходим для индуцированной И/Р почек регуляции воспалительной активности NLRP3.Предыдущее исследование показало, что Nrf2 активируется, а уровни экспрессии генов-мишеней Nrf2 повышаются впочечная тканьпосле почечной И/Р травмы (27). Аналогичные результаты были получены в настоящем исследовании. Уровни экспрессии нуклеиновой кислоты, общего белка и мРНК Nrf2 анализировали через 24 часа после почечной И/Р-повреждения. Результаты показали, что по сравнению с группой Con, уровни экспрессии нуклеиновых кислот, общего белка и мРНК Nrf2 были повышены в группе I/R (рис. 4A-D). Кроме того, анализ IHC показал, что уровни экспрессии Nrf2 в почечной ткани были повышены, что было продемонстрировано увеличением количества Nrf2-позитивных клеток.
клетки, наблюдаемые в группе I / R (фиг. 4E и F). Эти данные свидетельствуют о том, что активация сигнального пути Nrf2 может инициировать защитный ответ у мышей с моделью I/R почек. Чтобы проверить влияние Nrf2 на путь воспаления NLRP3 при И/Р почек, в последующих экспериментах использовали мышей Nrf2-KO. Уровни экспрессии белка Nrf2 и его гена-мишени, HO-1, были значительно снижены после I/R почек у нокаутированных мышей по сравнению с мышами дикого типа (рис. 5A-C). Наоборот, по сравнению с группой I/R дикого типа, уровни экспрессии NLRP3 и его адаптера, ASC, каспазы-1 и IL-1 повышались в группе I/R KO (рис. 5A и D-G). Эти данные показали, что I/R почек может индуцировать активацию инфламмасомы NLRP3 у мышей Nrf2-KO.
NaHS смягчает индуцированную I/R повышающую регуляцию уровней экспрессии белка NLRP3 у мышей дикого типа, но не у мышей Nrf2-KO. Было продемонстрировано, что NaHS оказывает влияние на экспрессию Nrf2 и активацию воспалительных процессов NLRP3 в различных моделях заболеваний (28–30). В настоящем исследовании изучалось, происходит ли влияние NaHS на активацию пути NLRP3 через сигнальный путь Nrf2 путем анализа уровней экспрессии.Nrf2 и NLRP3, ассоциированных с инфламмасомами, у мышей дикого типа и нокаутированных мышей.У мышей дикого типа, по сравнению с группой Con, уровни экспрессии Nrf2, NLRP3, каспазы-1 и IL-1 повышались при повреждении почек I/R. Кроме того, лечение NaHS дополнительно повышало экспрессию Nrf2 и снижало уровни экспрессии NLRP3, каспазы-1 и IL-1 в группе I/R плюс NaHS по сравнению с группой I/R (рис. 6A-E). У мышей Nrf2-KO не наблюдалось статистически значимых различий в уровнях экспрессии Nrf2, NLRP3, каспазы-1 и IL-1 между группами I/R и I/R плюс NaHS (рис. 6A-E). В группе I / R плюс NaHS уровни экспрессии Nrf2 были значительно снижены, тогда как уровни экспрессии NLRP3, каспазы-1 и IL-1 были значительно повышены у мышей Nrf2-KO по сравнению с мышами дикого типа. Эти результаты свидетельствуют о том, что NaHS может снижать активацию воспалительных процессов NLRP3 через сигнальный путь Nrf2 при повреждении почек I/R.
NaHS облегчает повреждение почек, воспаление и апоптоз через сигнальный путь Nrf2 у мышей с моделью I/R почек. NaHS играет важную роль в повреждении почек при ОПП, И/Р и других моделях заболеваний (31). NaHS облегчал индуцированное И/Р почечное гистопатологическое повреждение, что проявлялось уменьшением набухания канальцевого эпителия, дилатации канальцев и интерстициального отека ипочкагистологические показатели в группе I/R плюс NaHS по сравнению с группой I/R у мышей дикого типа (рис. 7A и B). Показатели почечной функции, включая креатинин, мочевину и KIM-1, также снижались при лечении NaHS в группе I/R плюс NaHS по сравнению с группой I/R у дикого типа.
мыши (рис. 7C-E). Однако у мышей Nrf2‑KO NaHS не смог снизить повышенноепочкагистологическая оценка и уровни показателей почечной функции, индуцированные почечной И/Р. Кроме того, процент апоптотических клеток и высвобождение цитокинов, TNF-, IL-1 и IL-6, были снижены после обработки NaHS в И/Р плюс NaHS.группу по сравнению с группой I/R у мышей дикого типа (рис. 7F-J). Однако NaHS не мог оказывать защитного действия против апоптоза и чрезмерного высвобождения воспалительных факторов после реперфузии почечной ткани в группе мышей Nrf2-KO, получавших I/R плюс NaHS, по сравнению с мышами дикого типа, получавшими I/R плюс NaHS (рис. 7F-J). Эти результаты свидетельствуют о том, что NaHS может облегчать повреждение почек, воспаление и апоптоз у мышей дикого типа I/R, но не у мышей Nrf2-KO.
Обсуждение
Воспаление является ключевым патогенетическим процессом ОПП, индуцированным И/Р (4). Инфламмасома NLRP3 и сигнальный путь Nrf2 участвуют в регуляции воспаления вповреждение почек(32). Настоящее исследование показало, что ОПП, индуцированная И/Р, активировала инфламмасому NLRP3 и ее адаптор, ASC, способствовала созреванию прокаспазы-1 и про-ИЛ-1 и ускоряла избыточное высвобождение цитокинов и апоптоз, которые приводили к тяжелым нарушение функции почек. Ингибирование инфламмасомы NLRP3 с помощью лечения MCC950 улучшало функцию почек, уровни воспаления и апоптоза в почечной ткани. Помимо активации NLRP3, I/R почек также активирует сигнальный путь Nrf2. Однако отсутствие Nrf2 у мышей Nrf2-KO привело к дальнейшей активизации инфламмасомы NLRP3 и ее адаптора. Было обнаружено, что лечение NaHS снижает воспалительную активность NLRP3 через сигнальный путь Nrf2. Более того, повреждение почек, воспаление и апоптоз уменьшались при лечении NaHS за счет Nrf2-опосредованного ингибирования активации воспалительных процессов NLRP3.
И/Р-повреждение почек является важной клинической проблемой и основной причиной ОПП, что приводит к повышенному риску развития хроническогоБолезнь почек(33). Воспаление является важным патологическим признаком ишемического повреждения и возникает как следствие активации иммунных клеток посредством распознавания молекулярных паттернов, связанных с патогенами и повреждением (34). Более того, ранее сообщалось, что инфламмасома NLRP3 играет роль в рядеболезни почекпутем регулирования воспаления, пироптоза, апоптоза и фиброза (35). Воспаление NLRP3 представляет собой белковый комплекс, состоящий из NLRP3, его адапторного белка, ASC и каспазы-1. Каспаза-1 расщепляет про-ИЛ-1 и про-ИЛ-18 на зрелые, активированные секреторные формы. Повреждение почек, вызванное различными патологиями, включая ишемию (33), активирует воспалительный комплекс, повышает экспрессию NLRP3 и способствует последующему созреванию про-ИЛ-1 (36). NLRP3 KO с использованием малой интерферирующей РНК у мышей или эпителиальных клеток почечных канальцев оказывает защитный эффект против повреждения почечной ткани, вызванного ишемией или повреждением клеток в отсутствие глюкозы (37). Настоящие результаты показали, что почечный И/Р индуцировал активацию инфламмасомы NLRP3, в то время как ингибирование NLRP3 с использованием MCC950 значительно снижало уровни экспрессии NLRP3 и ASC и созревание прокаспазы-1 и про-ИЛ-1 в почечном И/Р. модель травмы. Кроме того, ингибирование NLRP3 с помощью MCC950 улучшало почечную дисфункцию и уменьшало гистопатологическое повреждение и количество баллов, чрезмерное высвобождение цитокинов и количество апоптотических клеток. Эти данные свидетельствуют о том, что активация NLRP3 может играть ключевую роль в повреждении почек, а ингибирование NLRP3 может оказывать защитный эффект против повреждения тканей и дисфункции, вызванных I/R почек.
В предыдущих исследованиях сообщалось, что Nrf2 участвует в воспалительной реакции (10-12). Кроме того, Nrf2 играет ключевую противовоспалительную, антиоксидантную или антиапоптотическую роль при ишемических состояниях. Активация сигнального пути элемента реакции Nrf2/антиоксиданта ослабляет воспаление и апоптоз в почечной ткани мышей, индуцированных циклофосфамидом (38). Другое исследование показало, что активация Nrf2 сульфорафаном ингибирует активность сигнального пути NF-kB, тем самым уменьшая воспаление в дистрофической мышечной ткани (39). Кроме того, нокдаун Nrf2 способствует активации инфламмасомы NLRP3 и приводит к активации IL-1 в модели ишемии (11). Настоящие данные подтверждают выводы о том, что почечный I/R может индуцировать сигнальный путь Nrf2 и экспрессию его нижележащих генов-мишеней, таких как HO-1. Мыши Nrf2-KO дополнительно способствовали активации инфламмасомы NLRP3, что указывало на повышение уровней экспрессии NLRP3, ASC, каспазы-1 и IL-1 в модели I/R почек. Эти результаты свидетельствуют о том, что Nrf2 оказывает ингибирующее действие на активацию воспалительных процессов NLRP3 при повреждении I/R почек.
Предыдущие исследования показали, чтопочкапроизводит H2S (40). Кроме того, H2S увеличивает почечный кровоток и способствует клиренсной функциипочка, о чем свидетельствует повышенная скорость клубочковой фильтрации (41). Более того, H2S не только снимает воспаление и окислительный стресс, но также играет решающую роль в регуляции эндотелиальной дисфункции и гипертонии (28). H2S участвует в регуляции почечных заболеваний, таких как повреждение И/Р и обструктивная и диабетическая нефропатия (42), однако основные механизмы остаются плохо изученными. NHS использовалась в качестве экзогенного донора H2S в исследованиях (43). В настоящем исследовании доставка H2S осуществлялась в форме NaHS. Настоящие результаты показали, что NaHS улучшает повреждение тканей,почкадисфункцию, избыточный выброс цитокинов и апоптоз, индуцированный почечной И/Р. Ранее сообщалось, что NaHS предотвращает активацию микроглии и воспаление, вызванное повреждением нерва, посредством регуляции сигнального пути Nrf2 (44). В соответствии с гипотезой о том, что NaHS регулирует воспаление через сигнальный путь Nrf2, настоящие результаты показали, что NaHS повышал уровни экспрессии Nrf2 и ингибировал уровни экспрессии NLRP3 у мышей с моделью I/R почек. Кроме того, нокаут Nrf2 устранял регуляторные эффекты NaHS на инфламмасому Nrf2 и NLRP3. В настоящем исследовании также изучалась роль Nrf2 в повреждении и функционировании почек после лечения NaHS; ингибирование Nrf2 не только частично обращало защитный эффект NaHS наповреждение почеки дисфункции, но также обращал ингибирующее действие NaHS на воспалительную реакцию и апоптоз после почечной И/Р. Эти результаты свидетельствуют о том, что Nrf2 может быть необходим для защитного действия NaHS на ОПП, вызванное И/Р, а NaHS может выполнять свою защитную роль против повреждения тканей посредством Nrf2-опосредованного ингибирования воспаления NLPR3. В заключение, индуцированное И/Р повреждение почек активировало инфламмасому NLRP3 и сигнальный путь Nrf2, а ингибирование инфламмасомы NLRP3 защищало от повреждения почек. Nrf2 отрицательно регулировал активацию воспаления NLRP3 и облегчал NaHSповреждение почеки дисфункция, апоптоз и воспалительная реакция посредством Nrf2-опосредованного ингибирования воспаления NLRP3. Эти результаты дают новое представление о потенциальной будущей мишени для лечения ишемического повреждения почек.