Паттерн экспрессии β-тубулина, инверсина и его мишени Dishavelled-1 и морфология первичных ресничек при нормальном развитии и заболеваниях почек человека

edmund.chen@wecistanche.com

Абстрактный:Пространственно-временная экспрессия белков -tubulin, инверсии и беспорядка -1 (DVL-1), связанных с сигнальным путем Wnt, и морфология первичных ресничек были проанализированы в развивающихсяпочки(14-38-я недели развития), здоровые постнатальные (1,5- и 7-лет) и патологически измененные человеческиепочки,включая мультикистозную диспластическуюпочки(МЦДК), фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) и нефротический синдром финского типа (ХНФ). Анализ проводили методами двойной иммунофлюоресценции, электронной микроскопии, полуколичественными и статистическими методами. Цитоплазматическая коэкспрессия -тубулина, инверсии и DVL-1 наблюдалась в проксимальных извитых канальцах (ПКТ), дистальных извитых канальцах (ДКТ) и клубочках (г) анализируемых тканей. В течениепочкаразвития общая экспрессия -тубулина, инверсии и ДВЛ-1снижалась, а в постнатальном периоде несколько увеличивалась. Самые высокие экспрессии β-тубулина и инверсии характерны для dct и g, в то время как высокая DVL-1 характерна для pct. Паттерны экспрессии -тубулина, инверсии и DVL-1 в MCDK, FSGS и CNFпочкидостоверно отличался от здорового контроля. По сравнению со здоровымпочки, патологически измененныйпочкиимели дисморфные первичные реснички. Различная динамика экспрессии -тубулина, инверсии и DVL-1 во времяпочкаразвитие может указывать на то, что переключение между канонической и неканонической передачей сигналов Wnt необходимо для нормальногопочкаморфогенез. Напротив, их нарушенная экспрессия при патологическихпочкиможет быть связано с аномальными первичными ресничками, что приводит к хроническомузаболевания почек.

Ключевые слова:развитие почек человека; -тубулин; инверсин; ДВЛ-1; МЦДК; ФСГС; УНВ; почка, почечный

CISTANCHE УЛУЧШИТ ЗАБОЛЕВАНИЕ ПОЧЕК / ПОЧЕК

Введение 

Развитие дефинитивной или метанефрическойпочкиначинается на пятой неделе беременности (GW), которая затем непрерывно дифференцируется с образованием постоянных почек [1,2]. Сигнальные взаимодействия между мезенхимой метанефры и зачатком мочеточника обеспечивают правильноепочкаразвитие во время нефрогенеза. Вкратце, зачаток мочеточника индуцирует мезенхимально-эпителиальный переход (MET) в метанефральной мезенхиме, которая конденсируется и образуетпочечныйвезикулы, за которыми следуют запятообразные и S-образные тельца и, наконец, приводят к образованию клубочков [3]. В свою очередь, мезенхима индуцирует дальнейшее разветвление зачатка мочеточника. Метанефрические почки становятся функциональными экскреторными единицами на 11-й неделе развития человека. Однако нефрогенез завершается на 34–36-й неделе внутриутробного развития, когда завершаются события множественного ветвления, но дальнейший процесс дифференцировки почек продолжается в постнатальный период [4,5]. Нарушение этих сложных взаимодействий приводит к различным врожденным аномалиям почек и мочевыводящих путей (CAKUT), включая дисплазию, поликистозную болезнь почек, мультикистозную диспластическую болезнь.Болезнь почек(MCDK), что приводит к хроническомуБолезнь почек(ХБП) [6].

В этом исследовании мы сосредоточились на появлении первичных ресничек и сигнальном пути Wnt, который играет важную роль во время нормального нефрогенеза и впочкавосстановительный процесс после острого или хроническогоБолезнь почек[7]. Существование первичных ресничек во время нефрогенеза и большое количество онтогенетическихпочкадефекты, встречающиеся у пациентов с цилиарным заболеванием, указывают на то, что подлинная функция первичных ресничек необходима для нормальногопочкаорганогенез [8,9]. Первичная ресничка представляет собой органеллу на основе микротрубочек, важную для тканевого гомеостаза, где основным компонентом является -тубулин [10]. Потеря ацетилирования -тубулина в иммортализованных клетках запускает эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ), таким образом, подразумевая, что ацетилированный -тубулин важен для стабилизации микротрубочек [11]. Во время развития человека первичный путь Wnt, опосредованный ресничками, обеспечивает клеточную пролиферацию, дифференцировку и морфогенез тканей [12]. У значительного числа детей с нарушением функции первичных ресничек и нарушенным сигнальным путем Wnt развивается ХБП, где врожденныепочечныйрасстройства являются причиной почти половины случаев [13]. Наиболее частой врожденной кистозной болезнью у детей является мультикистозная диспластическаяБолезнь почек(МКДК) [14]. Множественные кисты, которые не сообщаются [15] и не имеют нормальногопочечныйпаренхимы являются характерными микроскопическими находками для MCDK. Фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) является одним из наиболее частых гломерулярных заболеваний, приводящих к терминальной стадииБолезнь почек[16]. В начале ФСГС характеризуется очаговым поражением небольшого числа клубочков и сегментарным поражением только одного сегмента клубочкового круга [17]. Врожденный нефротический синдром финского типа (ВНС) — редкое заболевание, передающееся по аутосомно-рецессивному типу.Болезнь почекпредставлен пренатальной вспышкой обширной потери белка [18], связанной с кистогенезом проксимальных канальцев [19]. При многих формах первичных гломерулярных заболеваний протеинурия развивается в результате повреждения барьера клубочковой фильтрации [20]. Значительное количество исследований предполагает, что повреждение и дисфункция подоцитов играют важную роль в патогенезе протеинурии при ХБП [21]. В исследовании Vukojevic et al. показывает повышенное количество реснитчатых и малодифференцированных подоцитов в CNF [22]. Предыдущие исследования показали, что сигнальный путь Wnt/-catenin играет фундаментальную роль в смягчении дисфункции подоцитов при протеинурии [23]. Существует два основных пути передачи сигналов Wnt, один из которых известен как канонический -катенин-зависимый, а другой - неканонический, -катенин-независимый. Во время мышипочкаразвития каноническая передача сигналов Wnt активна на кончиках зачатков мочеточников и в S-образных телах [24]. Кроме того, Wnt посредством канонической передачи сигналов имеет значение для поддержания MET во время нефрогенеза [25]. А именно, связывание белкового комплекса, содержащего Dvl, с мембранным рецептором обязательно для активации Wnt-пути, а отключение ключевых компонентов этого пути приводит к ранней перинатальной смертности из-за отсутствия нефрогенной зоны впочка[25]. 

Было обнаружено, что белок, решающий роль молекулярного переключателя между каноническими и неканоническими сигнальными путями Wnt, представляет собой инверсию [26]. Хотя взаимодействие различных белков с инверсией обнаружено, ее точная функция еще полностью не выяснена. впочечныйэпителиальных клеток инверсия располагается в первичных ресничках, выполняя роль цилиарного белка [27]. Кроме того, инверсия образует устойчивый комплекс с тубулином в культурахпочечныйклетки, и они колокализуются in vivo [27,28]. Инверсия, по-видимому, играет существенную роль в раннем морфогенезе пронефрической системы и определении лево-правой симметрии во время развития [29,30]. Важное событие как для канонических, так и для неканонических путей передачи сигналов Wnt при привлечении цитоплазматического Dvl к клеточной мембране. Поскольку предыдущие находки показали, что инверсия и Dvl совместно локализуются в почечных эпителиальных клетках, можно предположить, что инверсия также может играть роль в неканонической передаче сигналов. Нарушение регуляции передачи сигналов Wnt, опосредованное инверсией, запускает аберрантную пролиферацию в канальцах [31]. Генетические тесты выявили мутацию DVL-1 у пациентов с аутосомно-доминантным синдромом Робинова, представляя собой гетерогенные нарушения у некоторых пациентов, связанные с урогенитальными ипочечныйаномалии [32].

CISTANCHE УЛУЧШИТ ПОЧЕЧНЫЙ ДИАЛИЗ

Паттерн экспрессии -тубулина, инверсии и DVL-1 в процессе развития был исследован на различных животных моделях. Так, их экспрессия в пронефросе Xenopus laevis была подтверждена с помощью прижизненной микроскопии [31], а в клеточных линиях, полученных из клеток проксимальных канальцев мыши, с помощью конфокальной микроскопии и масс-спектрометрии [33]. Кроме того, световая микроскопия и двойная иммунофлюоресценция выявили их присутствие в срезах мышей.почки[34]. Исследования на мышах с нокаутом инверсии выявили увеличенные диффузные кисты впочечныймозгового вещества и коры, связанные с висцеральной инверсией места расположения [35]. У человека мутация инверсии была представлена ​​инфантильным нефронофтизом, что привело к прерыванию беременности [36]. Несмотря на многочисленные исследования попочечный-тубулин, инверсия и паттерн экспрессии и функция DVL-1, насколько нам известно, паттерн экспрессии этих белков в эмбриональных и постнатальных тканях человека еще не был исследован и не приведен к корреляции. Кроме того, не сообщалось о доказательствах, касающихся экспрессии инверсии и DVL-1 в раннем развитии человека. Таким образом, это исследование было направлено на анализ пространственного и временного паттерна экспрессии -тубулина, инверсии и DVL-1 во время фетальной и постнатальной стадий здорового человека.почки, а также впочкаткани МКДК, ФСГС и УНВпочкичтобы установить возможное недостающее звено между этими сущностями. А именно, мы предполагаем, что нарушенные паттерны экспрессии белков -тубулина, инверсии и DVL-1 могут быть лежащим в основе процесса кистогенеза и аномальной функцией первичных ресничек, приводящей к хроническимзаболевания почек. 

Полученные результаты

Анализ развития и послеродового периода.почкаткани выполняли на отчетливо дифференцированных структурахпочка:проксимальные извитые канальцы (pct), дистальные извитые канальцы (dct) и клубочки (g). На анализируемых стадиях развития и в постнатальномпочкаткани, -тубулин, инверсия и DVL-1 показали положительную экспрессию, но с различиями в интенсивности, распределении и количестве. Анализ патол.почечная тканьMCDK, FSGS и CNF выполняли на полном изображении подсчета положительных клеток по сравнению с контролем здоровой ткани почки.

2.1. Световая микроскопия, электронная микроскопия и иммуногистохимия (-тубулина) здоровой и патологически измененной постнатальной ткани почки человека

2.1.1. Здоровый послеродовой почечный свет

микроскопия послеродовогопочкаткани демонстрируют хорошо выраженныепочкаструктуры, с отчетливой разницей между мозговым веществом и корой и формированием пкт, дкт и г в области коры. Иммуногистохимическое окрашивание -тубулина выявляет наличие одной первичной реснички в центре апикальной клеточной поверхности каждой канальцевой клетки и в 0.018% ± 0,00014% SD на поверхности клубочковых клеток. Электронная микроскопия показывает наличие только одной первичной реснички, возникающей из базального тельца на апикальной клеточной поверхности канальца (рис. 1а).

2.1.2. УНВ

Большинство проанализированных g имеют меньший размер и дольчатую форму (80 процентов), тогда как меньшинство имеют нормальный размер или гипертрофию (20 процентов, n=100). Выявляют сегментарный или глобальный склероз Г, тогда как ПКТ и ДКП частично расширены и покрыты атрофическим эпителием. Ультраструктурно наблюдается потеря микроворсинок и уменьшение высоты клеток с мультифрагментацией ядер. В подоцитах ножки отростков диффузно утрачены. Трубчатые первичные реснички дезорганизованы, особенно в кистах проксимальных канальцев, демонстрируя изменения длины и положения в цитоплазме (Рис. 1b).

2.1.3. МЦДК

В почечной ткани могут быть обнаружены спорадические незрелые и зрелые Г.Почкаткань заполнена многочисленными кистами овальной формы. Клетки столбчатого эпителия покрывают кисты и окружены рыхлой соединительной тканью. Иммуногистохимическое окрашивание на -тубулин показывает множественные длинные и дезорганизованные первичные реснички на поверхности эпителиальных клеток (рис. 1с).

2.1.4. ФСГС

В 90 процентах случаев обнаруживается обширный сегментарный склероз (n=100), связанный с интерстициальным фиброзом и признаками поражения канальцев. В электронном микроскопе обнаруживается уменьшение высоты эпителиальных клеток с утратой микроворсинок, при этом эндотелиальные клетки и мезангиальные участки имеют правильную ультраструктуру. Под электронным микроскопом на поверхности дистальной тубулярной клетки наблюдается чрезвычайно длинная и смещенная (децентрализованная) ресничка (рис. 1е). Подоциты показывают диффузную потерю отростков стопы с обширной тканью микроворсинок. Иммуногистохимическое окрашивание на а-тубулин показывает множественные длинные и дезорганизованные первичные реснички на поверхности эпителиальных клеток (рис. 1с).

2.2. Иммуногистохимическое окрашивание на тубулин, инверсию и DVL-1- и статистический анализ развивающихся и здоровых постнатальных почек человека

На 14, 15 и 16 неделях беременностипочкапредставлена ​​тканью с разными стадиями развития нефронов: из метанефральных чашечек,почечныйстадии пузырьков командовать S-образными нефронами, формируя таким образом нефрогенную зону во внешней коре (рис. 2). Дифференцирующие pct, dct и g можно наблюдать в областях коры, расположенных ближе кпочкапродолговатый мозг. Во время 22-й ГВ стали отчетливо различаться участки мозгового и коркового вещества, а в 38-й ГВ,почкаструктуры выглядят как высокодифференцированные, содержащие зрелые формы pct, dct и g

2.2.1. а-тубулин

Во время развития а-тубулин сильно экспрессируется во всех развивающихсяпочкаструктур, прежде всего визуализируя форму первичных ресничек на поверхности париетальных эпителиоцитов капсулы Боумена, g, pct и dct. В пределахпочкаткани, 82-97 процентов клеток pct экспрессируют а-тубулин, в то время как в dct экспрессия падает с 99 процентов до 72 процентов в 38-й GW (см. рис. 3, табл. 1). Среди разных стадий развития самая сильная экспрессия а-тубулина обнаружена в g 16-го GW.почки, содержащий 93 процента положительных клеток. На 14-й, 15-й и 22-й GW (см. рис. 3а, б, табл. 1) около 7% g-клеток экспрессируют а-тубулин, в то время как наименьшая экспрессия наблюдается в 38-й GW (p < 0,01).="" с="" 34%="" положительных="" клеток="" (рис.="" 3с).="" в="" послеродовом="">почкаткани (1,5-лет и 7-летпочки), самая сильная иммунореактивность к а-тубулину наблюдается на апикальной клеточной поверхности ПКТ и ДКП (рис. 3d-f). Экспрессия а-тубулина также присутствует в перинуклеарной цитоплазме ДКП и париетальных эпителиальных клетках капсулы Боумена. а-тубулин окрашивает всепочечныйструктуры со средним значением 50 процентов положительных клеток в ПКТ, 94 процента в ДКП и 85 процентов в g (рис. 3f). Окрашивание Dct значительно отличается от окрашивания pct (p <0,0001). все="" исследованные="" структуры="" окрашиваются="" положительно="" на="" а-тубулин,="" при="" этом="" 77="" %="" положительных="" клеток="" в="" пкт,="" 72="" %="" в="" дкт="" и="" 58="" %="" в="" g="">

Рисунок 3. Иммунофлуоресцентное окрашивание -тубулина и DAPI в развивающихся и постнатальных тканях почек человека (а-е). Почки 14, 15/16, 38 ГВ (а–в);почкидетей в возрасте 1 5- и 7-лет (г, д). Положительное окрашивание -тубулина (стрелки) показано в каждой структуре коры через фазы развития и постнатальную фазу (a-e), проксимальные извитые канальцы (pct), дистальные извитые канальцы (dct) и клубочки (g). Детали первичных ресничек в pct (d) и dct (a-c, e) показаны как вставки с большим увеличением (белая рамка). Увеличение ×40, масштабная линейка 100 мкм. Распределение -тубулин-позитивных клеток по структурам на разных стадиях развития и в постнатальный период показано на графике (f). График (g) (общее количество белков-позитивных клеток в наблюдаемых структурах) показывает экспрессию белка, связанную со временем развития (линейная регрессия), и взаимосвязь -тубулина с DVL-1 посредством развития и созревания (двухфакторный ANOVA с последующим апостериорный тест SIDAK). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Распределение -тубулин-позитивных клеток по структурам на разных стадиях развития и в постнатальном периоде показано на графике (f). График (g) (общее количество белков-позитивных клеток в наблюдаемых структурах) показывает экспрессию белка, связанную со временем развития (линейная регрессия), и взаимосвязь -тубулина с DVL-1 через развитие и созревание (двусторонний ANOVA с последующим апостериорный тест Сидака). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

2.2.2. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание до инверсии и DVL-1 и ядерное окрашивание DAPI в развивающихся и здоровых постнатальных почках Экспрессия инверсии в развивающихся и постнатальных почечных тканях

На 14-м, 15-м и 16-м GW инверсия демонстрирует сильную гранулярную экспрессию в g и умеренную гранулярную экспрессию в цитоплазме pct и dct (рис. 4a,b), в то время как на 22-м и 38-м GW (см. рис. 4c) сильно положительная экспрессия наблюдается в g (табл. 1). Между 14-м и 22-м GW около 5% клеток экспрессируют версию. В 16-м GW клетки pct экспрессируют инверсию в 73 процентах клеток, а в 38-м GW количество клеток снижается до 29 процентов (p <0,05) (см.="" рисунок="" 4f).="" положительная="" экспрессия="" инверсии="" обнаруживается="" примерно="" в="" 80–90="" %="" dct-="" и="" g-клеток="">почкаткани 14-го и 16-го GW с наименьшей экспрессией в ДКП 38-го GW (p < 0.0="" 5,="" p="">< 0,0001="" соответственно),="" где="" 66%="" клеток="" были="" положительными.="" в="" послеродовом="">почки, pct сильно окрашивается на апикальной клеточной мембране, в то время как dct окрашивается в основном на базальной клеточной мембране и в перинуклеарной цитоплазме (рис. 4d, e). На этом этапе мы обнаружили выражение инверсии во всех исследованныхпочечныйструктуры, включая pct, dct и g, со средней экспрессией положительных клеток 92 процента для pct, 88 процентов для dct и 90 процентов для g (рис. 4f). Мы не наблюдали существенной разницы в силе сигнала инверсии экспрессии между структурами. Самая высокая экспрессия инверсии обнаружена в g, в среднем 94% положительных клеток (рис. 4f). Значительная разница обнаружена при сравнении окрашивания g (где 94 процента клеток окрашиваются положительно) с pct, где 58 процентов клеток окрашиваются положительно (p < 0.01),="" и="" с="" dct,="" где="" 49="" процентов="" клеток="" окрашиваются="" положительно.="" положительный="" (p=""><0,0001, рис.="">

Экспрессия DVL-1 в развивающейся и постнатальной ткани почки

Экспрессия DVL{{0}} от легкой до сильной наблюдается в цитоплазме pct, dct и g в плодном периоде (см. рис. 4a–c, табл. 1). В ПКТ 76–86 процентов клеток экспрессируют DVL-1 в 14-22-м GW, в то время как в 38-м GW имеется 57 процентов положительных клеток (рис. 4g). В ДКП 14-й и 15-й ГВ 68–70 процентов клеток экспрессируют DVL-1, в 16-й и 22-й ГВ количество положительных клеток снижается до 42–5{{41} } процентов, в то время как в 38-й экспрессии GW (p < 0,001)="" наблюдается="" в="" 19="" процентах="" клеток="" dct.="" экспрессия="" dvl-1="" увеличивается="" в="" g="" на="" всех="" стадиях="" плода:="" в="" 14-й="" гв="" она="" составляет="" 6%,="" а="" в="" 15-й,="" 16-й="" и="" 22-й="" гв="" она="" увеличивается="" до="" 10%="" (p="">< 0,01).="" в="" 38="" gw="" 14%="" клеток="" g="" экспрессируют="" dvl-1="" (рис.="" 4g).="" в="" постнатальном="" периоде="" иммунореактивность="" dvl-1="" рассеивается="" в="" цитоплазме="" (таблица="" 1)="" как="" пкт,="" так="" и="" дкт="" (рис.="" 4d,="" e).="" сигнал="" обнаруживается="" во="" всех="" исследованных="" структурах,="" но="" в="" основном="" в="" перинуклеарной="" цитоплазме.="" интенсивность="" экспрессии="" dvl-1="" значительно="" выше="" в="" pct="" по="" сравнению="" с="" dct="" и="" g="" (p="">< 0,01).="" 39–45="" процентов="" клеток="" в="" пкт="" и="" дкп="" экспрессируют="" dvl-1,="" в="" то="" время="" как="" в="" g="" 21="" процент="" клеток="" являются="" положительными="" (рис.="" 4g).="" мы="" не="" обнаружили="" существенной="" разницы="" между="" процентным="" содержанием="" иммунореактивных="" клеток="" в="">почечныйструктуры. Процент иммунореактивных клеток DVL-1 составляет 34% в ПКТ, 36% в ДКТ и 27% в g соответственно (рис. 4g).

Рисунок 4. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание инверсии (зеленый), DVL-1 (красный) и DAPI (синий) в развивающихся и постнатальных тканях почки (14-38-й GW, 1.5- и {{6 }}ткани почки годовалого возраста). Положительное окрашивание (стрелки) показано в каждой структуре на протяжении всех фаз развития (а-в) и постнатального периода (г, д). Слились микрофоны вместе с представляющими интерес структурами коры: проксимальные извитые канальцы (ПКТ), дистальные извитые канальцы (ДКТ) и клубочки (g). Колокализация инверсии/DVL-1 (стрелка) показана на объединенных микрофотографиях. Окрашивание отрицательного контроля показано в виде вставок на инверсии и DVL-1 (а). Эритроциты можно увидеть в виде сильно окрашенных клеток вблизи dct. Детали показаны в виде вставок с большим увеличением. Увеличение ×40, масштабная линейка 100 мкм. Динамическое положительное распределение клеток инверсии и DVL-1 в структурах почек (pct, dct, g) на протяжении развивающейся и постнатальной стадий показано на графиках (f,g). На графике (h) показана экспрессия белка (общее количество положительных клеток в структурах), связанная со временем развития (линейная регрессия) и взаимосвязь инверсии с DVL-1 через развитие и созревание (двусторонний ANOVA с последующим апостериорным тестом Сидака). ). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Коэкспрессия инверсии и DVL-1 наблюдается в цитоплазме почек g, dct и pct во время развития (см. рис. 4a–c, слияние). В постнатальном периоде коэкспрессия инверсии и DVL-1 характеризует различные клеточные компартменты канальцевых клеток в pct и dct, в то время как коэкспрессия в g характеризуется сильным преобладанием экспрессии инверсии (см. рис. 4d, слияние ). В почках 7-года постнатального развития коэкспрессия инверсии и DVL-1 наблюдается в канальцевых клетках dct и pct, а также в g, где экспрессия инверсии немного преобладает по сравнению с DVL-1 (Рисунок 4e, слияние).

2.2.3. Различия в экспрессии -тубулина, инверсии и DVL-1 между различными стадиями развития почек и постнатальными почками

Количество -тубулин-позитивных клеток в пкт ткани почки плода было статистически значимо выше по сравнению с тканью почки 7-детей летнего возраста (13-е место (p < 0.0{="" {11}}1),="" 15-е="" (p="">< 0.0001)="" и="" 16-е="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" дкт="" ранних="" фетальных="" стадий="" (13-я,="" 15-я,="" 16-я="" и="" 22-я="" gw)="" содержала="" больше="" положительных="" клеток="" по="" сравнению="" с="" тканью="" почки="" 38-й="" gw="" и="" 1,{19}}летнего="" ребенка="" (p="">< 0,0001,="" соответственно,="" рисунок="" 3f).="" при="" сравнении="" разных="" стадий="" развития="" мы="" обнаружили="" более="" низкий="" уровень="" экспрессии="" инверсии="" в="" пкт="" 13-й="" (p="">< 0,0001),="" 15-й="" (p="">< 0,00001),="" 22-й="" (p="">< 0,001)="" и="" 38-й="" (p="">< 0,0001)="" зв="" по="" сравнению="" с="">почечныйткань от 1,5-летнего ребенка. В dct была обнаружена статистически значимая более низкая экспрессия инверсии по сравнению с тканью почки 16-й GW и 38-й GW (p < 0.0001).="" кроме="" того,="" более="" низкая="" экспрессия="" инверсии="" в="" дкп="" наблюдалась="" в="" ткани="" почек="" 7-летнего="" ребенка;="" сравнивая="" ткань="" почки="" 13-го,="" 15-го="" (p=""><0,001, оба),="" 16-го="" и="" 1,5-летнего="" возраста="" с="" дкп="" почечной="" ткани="" 7-летнего="" возраста="" (p=""><0,00001, соответственно,="" рис.="" 4f).="" наблюдаемый="" сигнал="" экспрессии="" dvl-1="" на="" разных="" стадиях="" показал,="" что="" пкт="" 13-й="" (p="">< 0,01),="" 15-й,="" 16-й="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Взаимосвязь между экспрессией -тубулина и инверсией DVL-1 в развивающейся и постнатальной ткани почки

Экспрессию тубулина и инверсии сравнивали с экспрессией DVL-1 на всех стадиях развития и в постнатальной ткани почек. -тубулин имел статистически более высокую экспрессию на всех наблюдаемых стадиях по сравнению с экспрессией DVL-1 (p < 0.001,="" рис.="" 3g).="" на="" всех="" наблюдаемых="" стадиях="" инверсия="" имела="" более="" высокое="" выражение="" по="" сравнению="" с="" dvl-1="" (p=""><0,0001, рис.="">

2.2.5. Сравнение иммуногистохимического окрашивания на -тубулин, версия и DVL-1- и статистический анализ патологически измененной ткани почки (MCDK, CNF, FSGS) -Тубулин Разница в окрашивании -тубулина в MCDK, FSGS и CNF была статистически значимой по сравнению на здоровую постнатальную ткань почки в качестве контрольной группы (p < 0,0001="" соответственно).="" диспластические="" ткани="" почек="" имели="" значительно="" более="" высокую="" экспрессию="" по="" сравнению="" с="" контрольной="" группой,="" в="" то="" время="" как="" фсгс="" и="" cnf="" показали="" значительно="" более="" низкую="" экспрессию="" -тубулина="" по="" сравнению="" со="" здоровым="" контролем="" (рис.="">

Инверсия

Инверсия выражена в цитоплазме дезорганизованных эпителиальных клеток и канальцев MCDK (рис. 5а). В CNF экспрессия инверсии характеризует g и dct, в то время как в кистах pct она проявляется менее интенсивно (рис. 5б). При ФСГС инверсия сильно выражена в g и dct, но менее интенсивно в кистах pct (рис. 5в). Пространственное выражение инверсии показало статистически значимую более высокую скорость окрашивания в здоровых тканях почек (рис. 5g) по сравнению с MCDK, FSGS и CNF (p < 0,0001="">

Рис. 5. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание инверсии (зеленый), DVL-1 (красный) и DAPI (синий) в патологических тканях почек в MCDK (а), CNF (б) и ФСГС (в): канальцы (t) , клубочки (ж), киста ПКТ (в), высота клеток эпителия ПКТ (*). Структура и совместная локализация клеток инверсии и DVL-1 (стрелки) показаны в объединенных разделах с деталями на вставках с большим увеличением. Окрашивание отрицательного контроля показано в виде вставок на инверсии и DVL-1 (а). Увеличение ×40, масштабная линейка 10{{2{0}} мкм. Связь -тубулина (d) и инверсии (e) с экспрессией DVL-1 в MCDK, FSGS и CNF (двусторонний ANOVA с последующим апостериорным тестом SIDAK). Разница в высоте эпителиальных клеток (f) FSGS, CNF и MCDK pct по сравнению со здоровым контролем (однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Тьюки, n=50). Разница в общем процентном соотношении положительных клеток -тубулина, инверсии и DVL-1 в MCDK, CNF и FSGS по сравнению со здоровым контролем (g – i), односторонний ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Достоверные различия обозначены значением p (* p <0,05, **="" p=""><0,01, ****="" p=""><0,0001). dvl-1="" dvl-1="" очень="" слабо="" выражен="" только="" в="" дезорганизованных="" канальцах="" mcdk,="" в="" то="" время="" как="" в="" cnf="" его="" экспрессия="" характеризует="" dct="" и="" g="" (рис.="" 5a,b).="" в="" фсгс="" dvl-1="" наблюдается="" как="" легкая="" реактивность="" в="" g,="" dct="" и="" pct="" (рис.="" 5c).="" здоровые="" ткани="" почек,="" окрашенные="" dvl-1,="" показали="" значительно="" более="" высокую="" скорость="" окрашивания="" (рис.="" 5,="" ч)="" по="" сравнению="" с="" mcdk="" и="" fsgs="" (p=""><0,0001, оба),="" в="" то="" время="" как="" для="" cnf="" не="" было="" обнаружено="" существенной="">

2.2.6. Взаимосвязь между экспрессией -тубулина и инверсией DVL-1 в патологически измененной ткани почки (MCDK, CNF, FSGS)В MCDK, FSGS и CNF -тубулин окрашивается значительно выше, чем DVL-1 (p <{2}}.0001, соответственно,="" рис.="" 5d).="" инверсия="" окрашена="" значительно="" выше="" по="" сравнению="" с="" dvl-1="" в="" mdck="" (p=""><0,0001) и="" в="" fsgs="" (p=""><0,01, рисунок="">

2.2.7. Различия в высоте эпителиальных клеток проксимальных извитых канальцев между здоровым контролем и патологически измененной тканью почки (MCDK, CNF, FSGS)Высоту эпителиальных клеток pct (n {{0}} на группу) сравнивали между клетками канальцев в здоровых тканях почек и патологически измененными тканями почек (рис. 5b, c, f). Средняя высота эпителиальных клеток при HC составляла 12,91 мкм ± 1,847 мкм и была значительно выше по сравнению с CNF и FSGS (p < 0,0001="" соответственно).="" средняя="" высота="" клеток="" в="" cnf="" pct="" составила="" 9,011="" мкм="" ±="" 1,453="" мкм,="" а="" в="" fsgs="" -="" 8,114="" мкм="" ±="" 0,9248="" мкм.="" эпителиальные="" клетки="" pct="" mcdk="" не="" показали="" значительных="" изменений="" по="" высоте="" (12,17="" мкм="" ±="" 1,476="" мкм)="" по="" сравнению="" с="">

2.2.8. Различия в длине первичных ресничек между здоровым контролем и патологически измененной тканью почки (MCDK, CNF, FSGS)

Длину первичной реснички (n= 50 на группу) сравнивали между HC и патологически измененными тканями почек (рис. 6c). Здоровые ткани почек и MCDK окрашивали -тубулином, чтобы убедиться в специфичности окрашивания ресничек -тубулином (рис. 6а, б). В здоровых тканях почек первичная ресничка имела длину 5,065 мкм ± 1,229 мкм, в то время как в MCDK CNF и FSGS были значительно длиннее (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Обсуждение

Целью нашего исследования было изучение иммуногистохимической экспрессии а-тубулина, инверсии и DVL-1 в плодах.почечныйткани и постнатальной ткани почек. Кроме того, мы хотели выяснить, нарушаются ли экспрессия и характер окрашивания а-тубулина, инверсии и DVL-1 при различных заболеваниях почек по сравнению со здоровым контролем. А именно, несмотря на большой интерес других исследователей к роли а-тубулина, инверсии и DVL-1 во время развития почек, в большинстве предыдущих исследований использовались животные или экспериментальные модели in vitro. Насколько нам известно, это первое исследование, которое показало экспрессию и локализацию а-тубулина наряду с инверсией и DVL-1 в почках плода и постнатального человека, а также изучало экспрессию упомянутых белков в почках. заболеваний, таких как МЦДК, ФСГС и ХНФ. Мы также проанализировали изменения длины и внешнего вида ресничек с помощью световой и электронной микроскопии, так как наше предыдущее исследование уже показало, что нарушения ресничек могут быть связаны с кистогенезом при FSGF и CNF [19].

В каноническом пути передачи сигналов Wnt связывание лигандов Wnt с рецепторами рекрутирует Dvl [37]. Процессы MET и путь планарной клеточной полярности на ранних стадиях морфогенеза почки контролируются передачей сигналов Wnt. Опосредуя путь Wnt, первичные реснички контролируют клеточную пролиферацию, дифференцировку и морфогенез тканей [12] посредством организации клеточного цитоскелета и ориентации клеток, а также удлинения трубчатых структур [2,38]. В нашем исследовании β-тубулин, инверсия и DVL-1 присутствовали в почечных структурах, и все они локализовались не только во время развития почек плода, но и в почечной ткани из 1.5- и {{9} }}летние дети. Эти данные согласуются с активацией пути передачи сигналов Wnt, которая, как было доказано, происходит уже во время тубулогенеза [39]. Кроме того, наши результаты показали, что экспрессия -тубулина и инверсия реципрокно связаны с DVL-1 и что они показывают статистически значимую разницу между их паттернами экспрессии. Это коррелирует с экспериментальными моделями, поскольку мутация полного семейства белков Dvl у мышей приводит к отсутствию процесса гаструляции, в то время как мутации, не включающие все семейство белков, демонстрируют дефекты в размещении узловых ресничек наряду с дефектами органов [40]. . Предыдущие находки показали, что инверсия играет роль в миграции клеток у Xenopus pronephros. Поскольку этот сегмент коррелирует с петлей Генле млекопитающих и дистальными канальцами, это может указывать на важность инверсии во время развития почек и у людей [41]. В соответствии с этой предпосылкой предыдущие исследования показали, что мутация гена инверсии может привести к нефронофтизу 2 типа, который опосредуется аномальной экспрессией DVL-1 [42]. Несмотря на спорную роль первичной реснички в регуляции пути передачи сигналов Wnt, мы обнаружили, что -tubulin колокализуется с инверсией и DVL-1 в проанализированных образцах почек. Более того, предыдущие исследования показали, что первичная ресничка наряду с инверсией регулирует деградацию Dvl, влияя на путь передачи сигналов Wnt [43]. При заболеваниях почек человека, связанных с развитием кист, наблюдали аномальную локализацию и функцию первичных ресничек [19]. Точно так же настоящее исследование также подтвердило морфологические изменения образования первичных ресничек при патологических состояниях, таких как CNF, FSGS и MCDK. Предыдущие результаты подтвердили, что чрезмерная активация канонического пути Wnt после повреждения почек приводит к необратимым структурным изменениям почечной ткани [44]. Напротив, первичным ресничкам была отведена роль переключения с канонического на неканонический путь Wnt в содействиипочечныйремонт. Кроме того, было обнаружено, что чрезмерная активация канонического пути Wnt в трансплантированной ткани почки имеет положительную прогностическую ценность в отношении фиброза почек [45]. Если канонический путь Wnt преобладает за счет неканонического, это подтверждает теорию о фиброзе почек как исходе. Наши данные о пониженной экспрессии β-тубулина и инверсии в CNF и FSGS подразумевают неактивность неканонического пути Wnt, тем более что оба состояния имеют тенденцию приводить к терминальной стадии.почечная болезнь.А именно, считается, что нормальная локализация и функция первичной реснички могут быть фактором поддержания регулярного пути Wnt и, следовательно, предпосылкой для нормального развития. Напротив, если путь Wnt усиливается, это может привести к нарушению регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки, что приводит к канцерогенезу [46]. Как описано ранее, канонический путь Wnt является обязательным для инициации МЭТ и образования нефрона, в то время как его нарушение может привести кпочечныйгипоплазия [47]. Наши результаты подтверждают эту идею, обнаруживая самую низкую экспрессию DVL-1 с самой высокой экспрессией -тубулина в MCDK по сравнению со здоровым контролем. Эти результаты могут указывать на самую низкую активацию канонического пути Wnt, что может быть основной причиной отсутствия образования нефронов. Напротив, самая высокая экспрессия -tubulin с самой низкой экспрессией DVL-1 может объяснить обнаружение множественных кист, поскольку нет организованной элонгации и поляризации клеток, управляемых неканоническим путем Wnt. Предыдущие исследования также показали, что инверсия ингибирует канонический путь передачи сигналов Wnt, нацеливая Dvl на деградацию [26]. Этот этап их взаимодействия оказался необходимым для ингибирования канонической передачи сигналов Wnt при поддержании нормального удлинения и позиционирования канальцев. Инверсионная мутация приводит к усилению канонической передачи сигналов Wnt, что впоследствии провоцирует аномальную пролиферацию в тубулярных клетках. Доказано, что этот этап имеет решающее значение в цистогенезе [42], в то время как нокаут инверсии у мышей приводит к поликистозной болезни почек [48]. Согласно теориипочечныйцистогенеза, инверсия считается «микопротеином» из-за его локализации в первичных ресничках впочечныйтрубчатые клетки. В нашем исследовании первичные реснички присутствовали на апикальной поверхности клеток канальцев на всех анализируемых стадиях, при этом на фетальных стадиях экспрессия β-тубулина была сильнее, чем в постнатальном периоде.

CISTANCHE УЛУЧШИТ БОЛИ В ПОЧЕКАХ

Предыдущие исследования показали, что первичная функция ресничек может быть нарушена нарушением регуляции -tubulin во время развития, что может привести к цистогенезу, аномальному развитию почек и возможному хроническому заболеванию почек в детстве [31,49]. Это согласуется с нашими выводами об укороченных и дисморфичных первичных ресничках, наблюдаемых в MCDK, или множественных и чрезвычайно удлиненных или смещенных ресничках, обнаруженных в расширенных канальцах CNF и FSGS по сравнению со здоровым контролем. Чтобы подтвердить тот факт, что канонические и неканонические пути передачи сигнала Wnt, регулируемые первичными ресничками, считаются обязательными для нормального развития почек, мы обнаружили значительно более низкое окрашивание инверсии и DVL-1 в MCDK по сравнению со здоровым контролем. [31,49]. Различная динамика паттерна экспрессии -tubulin, инверсии и DVL-1 на разных фазах развития почек может указывать на переключение между каноническим и неканоническим сигнальным путем Wnt во время нормального морфогенеза почки. Мы предполагаем, что их обмен определяет транскрипцию в каноническом пути или порядок миграции и поляризации клеток во время развития почки в неканоническом сигнальном пути. Их баланс и экспрессия во всех исследованных почечных структурах предполагают их важную роль в нормальном развитии почек. Во время нормального развития почек (с 13-го GW до 38-го GW) общая экспрессия -тубулина, инверсии и DVL-1 снижается по мере того, как почечная ткань приобретает зрелую морфологию. В тканях почек возрастом 1.5- и 7-года -tubulin и инверсия показали небольшое увеличение экспрессии, что подтверждает тот факт, что неканонический путь Wnt остается активным после рождения. Напротив, DVL-1 сохраняется со сниженным паттерном экспрессии, что может добавить к выводу, что канонический путь Wnt замалчивается в здоровой ткани почек. В результате патологических состояний почек эпителиальные клетки почки могут отреагировать повторным появлением ЭМП и фиброза [50], связанными с реактивацией канонического пути Wnt [44]. Таким образом, нарушения β-тубулина, инверсии и DVL-1, обнаруживаемые в больных почках, могут быть основным патологическим механизмом и результатом переключения с неканонического на канонический путь Wnt в развивающейся почке, намекая на переход от обратимого к необратимому почечному пути. наносить ущерб. Кроме того, изменения в их пренатальном и постнатальномпочечныйПаттерн экспрессии может быть связан с нарушением функции почек во взрослом возрасте, что приводит к врожденным заболеваниям и хронической почечной недостаточности.

4. Материалы и методы

4.1. Образцы человека

Образцы ткани почек плода были собраны после прерывания беременности на 14, 15, 16, 22 и 38 ГВ в отделении гинекологии и акушерства Университетского больничного центра Сплита. Весь полученный плодный материал исследовал патологоанатом, для исследования использовали только ткани без признаков аномалий, мацераций или внутриутробной гибели и с нормальной кариограммой. Медицинские карты матерей были изучены до забора образцов, и в случае проблем со здоровьем, которые могли повлиять на исход беременности, ткани почек были исключены из исследования. Зрелость определяли по окружности головы, окружности живота и длине бедра [51] в корреляции с менструальным календарем пациенток. Образцы почечной ткани в возрасте 1,5- и 7-лет были собраны после несчастного случая. Образцы были получены в отделении патологии Университетского больничного центра Сплита. Образцы тканей мультикистозно-диспластической почки (МКДП) получены после невынашивания беременности, фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) и нефротический синдром финского типа (СНС) получены вследствие нефрэктомии. Весь полученный материал был осмотрен и оценен патологоанатомом, который классифицировал диагнозы. Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике Медицинской школы Университета Сплита (20 мая 2016 г.) в соответствии с Хельсинкской декларацией и ее обновлениями (номер классификации: 003-08/16-03/0001, регистрационный номер: 2181-198-03-04-16-0024, 20 мая 2016 г.) [52].

4.2. Иммуногистохимия

Фиксацию собранного образца ткани обрабатывали 4-процентным параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 24 часов при 22 ◦C. После обезвоживания в 100%-ном этаноле образцы заливали в парафин, как описано ранее [53]. Образцы нарезали на срезы толщиной 5 мкм с помощью микротома, а затем помещали на предметные стекла микроскопа. Для проверки сохранности ткани каждый 10-й срез окрашивали гематоксилином и эозином [54]. Депарфеминизацию и иммуногистохимию проводили, как описано ранее [2,55,56]. После промывания в PBS предметные стекла инкубировали в течение ночи с первичными антителами во влажной камере при 22°C (система окрашивания предметных стекол StainTray; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). В качестве первичных антител использовали кроличье моноклональное антитело к альфа-тубулину (разведение 1:1000; ab179484, Abcam, Кембридж, Великобритания), кроличье поликлональное антитело против инверсии (разведение 1:100; ab65187, Abcam, Кембридж, Великобритания), мышиный моноклональный DVL. -1 антитело (разведение 1:150; подкожно -8025, Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США) и кроличье поликлональное антитело против гамма-тубулина (для проверки первичного окрашивания ресничек с помощью альфа- тубулин, разведение 1:500; ab11321, Abcam, Кембридж, Великобритания). После промывания в PBS в течение часа вводили вторичные антитела, как указано: ослиные антикроличьи IgG H&L, Alexa Fluor 488 (разведение 1:400; ab150073, Abcam, Кембридж, Великобритания) и козьи антимышиные IgG H&L, TRITC (разведение 1:400; ab6786, Abcam, Кембридж, Великобритания) 4',6-диамидино-2-фенилиндола дигидрохлорид (DAPI) использовали для окрашивания ядер и после 2-минутной инкубации предметные стекла промывали в PBS и покрывали монтажной средой и покровными стеклами. Неспецифическое окрашивание предотвращали с помощью белкового блока (ab64226; Abcam, Кембридж, Великобритания) перед нанесением первичных антител. В качестве отрицательного контроля проводили тест предварительной адсорбции, в то время как специфичность вторичных антител проверяли, исключая первичные антитела из процедур окрашивания.

4.3. Электронная микроскопия

Фиксацияпочкатканей проводили в 4-процентном параформальдегиде в течение 24 часов с последующей постфиксацией в 1-процентном четырехокиси осмия в течение 1 часа. Процесс обезвоживания проводили серией этанола и заканчивали заливкой в ​​смолу LX 112 [22]. Тонкие срезы толщиной в один микрометр окрашивали толуидиновым синим и изучали для отбора ультратонких срезов. Ультратонкие срезы толщиной 0.05 мкм исследовали после окрашивания уранилацетатом и цитратом свинца. Для получения микрофотографий использовали микроскоп JEOL 1200 EX.

4.4. Генетический анализ

Как описано ранее [19], с использованием лейкоцитов периферической крови выделяли геномную ДНК. Обнаружена гомозиготная миссенс-мутация в гене NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg), что подтвердило диагноз врожденного нефротического синдрома финского типа (ВНС) [57].

CISTANCHE УЛУЧШИТ ПОЧЕЧНУЮ ИНФЕКЦИЮ

4.5. Анализ данных

Анализ срезов проводили на флуоресцентном микроскопе FL с использованием 3 каналов флуоресценции FL (Olympus BX51, Токио, Япония). Изображения были сняты цифровой камерой DP71 (Olympus, Токио, Япония) с большим (×40) увеличением. Толькопочечныйинтерес представляли коры головного мозга, содержащие проксимальные извитые канальцы (ПКТ), дистальные извитые канальцы (ДКТ) и клубочки (г). Затем изображения обрабатывались программным обеспечением ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, Национальные институты здравоохранения США, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (по состоянию на 15 октября 2018 г.), 1997–2021 гг. ) и Adobe Photoshop (Adobe Inc., Сан-Хосе, Калифорния, США) для дальнейшей оценки. Перед подсчетом клеток использовался инструмент ImageJ с разделенными каналами. После этого исходная иммунофлуоресцентная микроскопическая фотография была вычтена красным или зеленым каналом (в зависимости от того, каким был исходный канал) с использованием инструмента ImageJ калькулятора изображений для предотвращения утечки сигнала. Значения ниже порогового уровня 50 считались отрицательными. Мы подсчитывали иммунореактивные сигналы в клетках не менее 20 структур (pct, dct или g) на стадию или общее положительное количество клеток на микрофотографию мультикистозной диспластическойпочкаткани, ФСГС и УНВ. Мы классифицировали клетки как положительные, если сигнал иммунофлуоресценции накапливался на любом уровне мембраны, цитоплазмы или ядра выше значения 50, измеренного в программном обеспечении ImageJ с использованием пороговой команды. Отрицательные клетки классифицировали как клетки с отсутствием какой-либо иммунореактивности. Два независимых исследователя проанализировали данные.

4.6. Полуколичественный анализ

Интенсивность сигнала окрашивания -тубулина, инверсии и DVL-1 оценивали два независимых исследователя с использованием программного обеспечения ImageJ. Общая интенсивность сигнала измерялась после того, как изображение было переведено в 8-битный тип; после этого оценивали интенсивность окрашивания маркера в 20 пкт, дкт и г путем измерения очерченной области структуры. Если результаты между оценщиками различались, третий независимый исследователь разъяснял сомнения. Максимальная интенсивность сигнала для -тубулина составила 84,125 ± 3,214 SD, для инверсии - 71,50 ± 2,715 SD и для DVL-1 80,916 ± 1,875 SD. Наивысшая насыщенность сигнального цвета на микроскопических фотографиях была отмечена как 3 (66,66–99,99 % от общей интенсивности изображения сигнала), затем 2 (33,33–66,66 %) для средней интенсивности сигнала и 1 (0,33–33,33 %). для малой интенсивности сигнала (табл. 1).

4.7. Статистический анализ

Для определения различий между стадиями и структурами был проведен тест Крускала-Уоллиса, а затем апостериорный тест Данна с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com (по состоянию на 15 октября). 2018.)). Количество положительных клеток выражали в процентах как среднее значение ± стандартное отклонение (SD), а статистическую значимость признавали при p < 0,05.="" количество="" проанализированных="" структур="" составило="" 4200="" в="" 35="" образцах,="" всего="" было="" подсчитано="" 135="" 256="" клеток.="" мы="" использовали="" 2-способ="" anova="" с="" апостериорным="" тестом="" сидака,="" чтобы="" проверить="" различия="" в="" экспрессии="" -тубулина,="" инверсии="" и="" dvl-1="" на="" разных="" стадиях="" развития.="" чтобы="" изучить="" экспрессию="" белка="" в="" зависимости="" от="" времени="" развития,="" мы="" использовали="" линейную="" регрессию.="" односторонний="" anova="" с="" последующим="" апостериорным="" тестом="" тьюки="" использовался="" для="" изучения="" различий="" в="" экспрессии="" -тубулина,="" инверсии="" и="" dvl-1="" у="" здоровых="">почкаткани по сравнению с тканями MCDK, FSGS и CNF. Различия в экспрессии белков между MCDK, FSGS и CNF исследовали с помощью 2-способа ANOVA с последующим апостериорным тестом Сидака. Односторонний ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки использовали для оценки различий в длине ресничек и высоте эпителиальных клеток ПКТ между здоровым контролем и патологическим.почкаткани. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD) со статистической разницей, признанной при p <>