Идентификация ситоглузида как потенциального агента, уменьшающего пигментацию кожи, с помощью сетевой фармакологии

Контактное лицо: ali.ma@wecistanche.com

Хаоран Го, 1 Хунлян Цзэн, 2 Чухан Фу, 1 Цзиньхуа Хуан, 1 Цзяньюнь Лу, 1 Ибо Ху, 1 Ин Чжоу, 1 Липин Луо, 1 Юшань Чжан, 1 Лань Чжан, 1 Цзин Чен, 1 и Цинхай Цзэн 1.

Многие традиционные китайские лекарства (ТКМ) сотбеливание кожисвойства были записаны в рецептах Ben-Cao-Gang-Mu и народных рецептах, а в некоторых источниках подтверждается, что их экстракты действительно могут ингибироватьпигментация. Однако никакие систематические исследования не выявили конкретных регуляторных механизмов потенциальных активных ингредиентов. Цель этого исследования состояла в том, чтобы проверить ингредиенты ТКМ, которые ингибируют кожу.пигментациячерез сетевую фармакологическую систему и изучить лежащие в ее основе механизмы. Мы идентифицировали 148 потенциальных активных ингредиентов из 14 ТКМ и, основываясь на средней «степени» топологических параметров, выделили пять лучших ТКМ (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones и Paeoniae Radix Alba), которые скорее всего, вызывалиотбеливание кожичерез противовоспалительные процессы были выбраны. Ситоглузид, наиболее распространенный ингредиент в пяти лучших ТКМ, ингибирует меланогенез в клетках меланомы человека (MNT1) и клетках меланомы мыши (B16F0) и уменьшаетпигментацияу рыбок данио. Кроме того, механистические исследования показали, что ситоглузид способен подавлятьтирозиназа(TYR) путем ингибирования путей ERK и p38 и ингибирования активности TYR. Эти результаты демонстрируют, что сетевая фармакология является эффективным инструментом для открытия природных соединений со свойствами отбеливания кожи и определения их возможных механизмов. Ситоглузид — новый отбеливающий кожу активный ингредиент с двойным регулирующим эффектом, который ингибируетТИРвыражение и активность.

Нажмите чтобыЭкстракт Cistanche DHT для отбеливания кожи

Введение

Меланин не только определяет цвет кожи, глаз и волос человека, но также играет ключевую роль в маскировке, мимике, социальной коммуникации и защите от ультрафиолетовых лучей. состояний, таких как веснушки и меланодермия, которые могут негативно повлиять на восприятие красоты и социальной уверенности [1]. Меланин является конечным продуктом L-тирозина после нескольких стадий ферментативных реакций и синтезируется в меланосомах меланоцитов [2]. В коже меланоциты расположены в базальном слое эпидермиса и могут продуцировать и переносить зрелые меланосомы на кератиноциты, вызывая тем самым кожныйпигментация [3]. ТИРявляется основным скорость-лимитирующим ферментом в продукции меланина [4], а фактор транскрипции, ассоциированный с микрофтальмом (MITF), является основным фактором транскрипции, который регулирует транскрипционную экспрессию TYR [5].

Недавние исследования показали, что воспалительные реакции играют важную роль в регуляции меланогенеза [6]. Например, ИЛ-18, продуцируемый клетками Лангерганса, дендритными клетками и кератиноцитами в эпидермисе, может усиливать экспрессию TRP{{2 }} (родственный тирозиназе белок 1) и TRP-2 (родственный тирозиназе белок 2) путем активации путей p38/MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа) и PKA (протеинкиназа А), тем самым способствуя меланогенезу [7, 8 ]. TNF- подавляет выработку меланина B16 главным образом путем активации NF-κB [9]. Было показано, что PGe2 (простагландин e2), который секретируется фибробластами и кератиноцитами, стимулирует дифференцировку дендритных клеток и инициирует активность TYR в меланоцитах через сигнальные пути цАМФ (циклический аденозинмонофосфат) и Plc (фосфолипаза с) [10]. PIH (поствоспалительная гиперпигментация) представляет собой тип реактивной меланизации кожи [11]. Различные кожные заболевания, травмы или косметические операции часто приводят кпигментацияобласти поражения, особенно у цветных людей [12]. Пациенты с ПВГ обычно переносят огромный психологический стресс, который в тяжелых случаях негативно влияет на качество их жизни. Поэтому некоторые лекарства, регулирующие воспаление, используются для лечения PIH и других заболеваний, вызывающих гиперпигментацию. Например, было обнаружено, что ресвератрол, уменьшающий воспалительное повреждение в клетках HaCaT [13], ингибирует синтез меланина посредством внеклеточной регуляции сигналов киназы 1/2 и передачи сигналов. фосфоинозитид 3-киназы/Акт [14].

Отбеливаниеагенты, такие как гидрохинон (HQ) и витамин С, традиционно используются для лечения пигментации [15]. HQ представляет собой гидроксифенол с мощным ингибирующим действием на меланогенез. Однако из-за различных побочных эффектов, таких как раздражающий или аллергический контактный дерматит, изменение цвета ногтей и нарушение заживления ран, использование ГХ ограничено [16, 17]. Витамин С ингибируетТИРпутем взаимодействия с ионами меди в активных центрах TYR, тем самым уменьшая меланогенез. Однако витамин С нестабилен в готовых продуктах. Кроме того, если концентрация витамина С выше 20 процентов, это может вызвать раздражение кожи [18]. Таким образом, натуральные ингредиенты из широкого спектра источников, которые являются безопасными, эффективными, очень стабильными и удобными для хранения, пользуются большим спросом.

В последнее время было обнаружено, что больше ингредиентов ТКМ эффективны в ингибировании кожи.пигментация, такие как апигенин и пеонифлорин [19–21]. ТКМ с отбеливающей активностью, описанные в Бен-Цао-Ган-Му, широко используются в качестве секретных рецептов в Китае, и в настоящее время подтверждено, что они обладают эффектом ингибирования пигментации. Например, экстракт Hedysarum multijugum Maxim (корневище Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge) вызывает отбеливание кожи путем ингибирования пути ERK [22]. Сухой экстракт Typhonii Rhizoma (корневище Sauromatum gigan-teum (англ.) Cusimano and Hett.) может эффективно ингибироватьтирозиназаактивность in vitro [23]. И доказательная медицина также подтвердила, что экстракт SapindiMukorossi Semen (плод Sapindus mukorossi Gaertn.), ингибирующий активность тирозиназы, потенциально может быть использован в качестве лекарственной и косметической добавки [24]. Некоторые традиционные народные рецепты, хотя и не собраны в сборник, также широко используются. Типичным примером является Сан-Бай-Тан (СБТ). Йе и др. продемонстрировали, что SBT может снижать выработку меланина путем ингибирования сигнального пути p38/MAPK и активности TYR [25]. Также было показано, что другие ТКМ, описанные в некоторых рецептах,отбеливание кожипоследствия. Экстракт Coicis Semen (семена Coix AquaticaRoxb.) ингибирует выработку меланина путем подавления MITF, TYR, TRP-1 и TRP-2 [26]. Более того, клеточный анализТИРпоказали, что Ampelopsis japonica (корневище Ampelopsis japonica (Thunb.) Makino) ингибирует активность TYR гриба более чем на 50% [27]. Отбеливающие ТКМ, записанные в этих древних рецептах, доказали свою эффективность современными экспериментальными методами, но большинство из них проверены в виде экстрактов, а активные ингредиенты, которые действуют, неясны. Это вызвало наш интерес к активным ингредиентам ТКМ с зарегистрированными отбеливающими эффектами. в древних рецептах.

Кроме того, ТКМ или рецепты имеют сложные ингредиенты, различные способы действия и неизвестные активные ингредиенты. Кроме того, большее влияние на эффективность ТКМ оказывает несоответствие таких факторов, как качество сырья, методы обработки, технологии приготовления, совместимость ингредиентов, используемых в составе, и лекарственных форм [19, 28]. Таким образом, использование определенных ТКМ сотбеливание кожиэффекты ограничены. Таким образом, необходимо срочно идентифицировать активные ингредиенты с потенциальным отбеливающим действием на кожу путем систематического скрининга, чтобы гарантировать безопасность, эффективность и стабильность этих ингредиентов.

В последние годы применение системной биологии в области традиционной китайской медицины значительно продвинулось вперед. Сетевая фармакология ТКМ — это новая междисциплинарная дисциплина, объединяющая фармакологию ТКМ с наукой о сетях, системной биологией, вычислительной наукой и биоинформатикой [29]. Он полностью понимает сложность между лекарствами, болезнями и биологическими системами с точки зрения сети «комплекс-белок/ген-заболевание» [30]. Сетевая фармакология является эффективным и систематическим инструментом для изучения фармакологического действия, механизма, безопасности и других аспектов фитотерапии, особенно ТКМ, и дает ценную информацию для открытия новых лекарств [31, 32].

ингредиенты для отбеливания кожи

2. Материалы и методы

2.1. Сетевой фармакологический процесс

2.1.1. Создание базы данных для химических ингредиентов

Блок-схема изучаемой экспериментальной программы представлена ​​на рис. 1. Для сетевого фармакологического анализа использовались ТКМ с антипигментным действием, описанные в «Бен-Цао-Ган-Му» и в народных рецептах. Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones и Sapindi MukorossiSemen, описанные в Ben-Cao-Gang-Mu, имеютотбеливаниеснижает желтизну и может удалять пятна и родинки на лице. Poria cocos (Schw.) Wolf (склероций Smilax china L.), Paeoniae Radix Alba и Atractylodes macrocephala Koidz (корневище Atractylodes macrocephalaKoidz.), которые, как известно, являются составляющими SBT, улучшают текстуру кожи и уменьшают хлоазму ипигментация. Другие традиционно зарегистрированные травы, такие как Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (корневище Bletilla striata(Thunb.) Rchb.F.), Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.)Benth. Et Hook (корневище дягиля даурского (Hoffm.) Benth. и Hook.f. ex Franch. and Sav.), Atractylodes lancea (Thunb.) Dc. (корневище Atractylodes lancea (Thunb.) DC.), Fructus Ligustri Lucidi и Coicis Semen также были включены в это исследование. Из-за большого количества ТКМ, включенных в это исследование, множественные скрининги баз данных китайской медицины вызовут путаницу при обработке данных. Мы используем только базу данных фармакологических систем традиционной китайской медицины (TCMSP), более широко используемую базу данных, для последующего скрининга. Химические ингредиенты этих ТКМ были найдены в TCMSP (обновлено 24 апреля020) [33]. Лекарственное сходство (DL) и пероральная биодоступность (OB) являются обычно используемыми параметрами скрининга. Местные или системные лекарства являются обычными методами лечения заболеваний пигментации кожи; поэтому мы использовали только DL в качестве критерия скрининга. Отличные комплексы с DL > 0:18 были выбраны для увеличения вероятности попадания потенциальных лекарств.

2.1.2. Пересечение между генами-мишенями ТКМ и генами, связанными с пигментацией.

Набор генов, связанный спигментациябыл выбран на основе базы данных GeneCards (обновлено 24 апреля 2020 г.), из которой были отобраны мишени с оценкой агенетического заболевания > 1. В итоге было выявлено 6180 целей, связанных с пигментацией. Пересечение между генами-мишенями ТКМ и генами, ассоциированными с пигментацией, было проиллюстрировано с помощью диаграммы Венна [34].

2.1.3. Построение сети активного соединения-мишени-пути.

Активные ингредиенты и регулируемые гены-мишени подвергали скринингу по результатам диаграммы Венна. Сеть была построена с использованием программного обеспечения Cytoscape [35] и использовалась для обозначения взаимосвязи между активными соединениями ТКМ и генами-мишенямипигментацияКаждый целевой ген, регулируемый активным ингредиентом в аТКМ, считался одной «степенью». Средние топологические параметры «степени» каждой ТКМ использовались для оценки важности выбранных ТКМ. Соединения были ранжированы, и для ключевого анализа были выбраны пять лучших ТКМ. Кроме того, была проанализирована подробная информация о потенциально активных ингредиентах, регулирующих пигментацию.

2.1.4. Киотская энциклопедия генов и генома (KEGG) Анализ обогащения генов-мишеней, регулируемых потенциально эффективными ТКМ.

Гены-мишени, регулируемые пятью основными ТКМ, были выбраны для определения целевых путей KEGG и изучения возможных механизмов потенциально эффективных ингредиентов этих ТКМ противпигментацияРесурсы .DAVID bioinformatics 6.8 использовались для анализа обогащения целевых путей KEGG. Были загружены генные символы потенциальных мишеней эффективных активных ингредиентов. Затем полученные идентификаторы генов были загружены и введены в KOBAS3. Был выбран ген, который скорректировал значения p меньше 0.05.

2.1.5. Моделирование молекулярной стыковки.

Двумерные структуры ситоглузида, арбутина, никотинамида, HQ, койевой кислоты и аскорбиновой кислоты были получены из базы данных PubChem. Механические структуры малых молекул были оптимизированы с использованием ChemBio3D Ultra 14.0. Трехмерная кристаллическая структура грибаТИР(идентификатор PDB: 2Y9X, координаты стыковки: X =-8:87, Y=-30:74 и Z=-41:52) был получен из банка данных о белках ( PDB) [36]. Трехмерные кристаллические структуры шести мембранных рецепторов (опиоидный u-рецептор, PDB ID: 4DKI; рецептор меланокортина 1, PDB ID: 2L1J; рецептор эндотелина B, PDB ID: 5GLI; адренергический рецептор, PDB ID: 4GBR; простагландиновый рецептор, PDB ID: 6D26. ; рецептор фактора стволовых клеток, PDB ID: 2EC8) были получены из базы данных PDB. Белковые структуры были приготовлены с использованием AutoDock Tools путем удаления молекул воды, добавления водорода и создания связей нулевого порядка с металлами и дисульфидными связями. Наконец, моделирование молекулярного докинга было выполнено с использованием AutoDock Vina 1.1.2 [37], а результаты были проанализированы с использованием PyMoL 1.7.2.1.

2.2. Экспериментальная проверка

2.2.1. Химические вещества и антитела.

Ситоглузид (чистота выше или равная 98 процентам) был приобретен у ChemFaces (#CFN98, 713, Chem Faces). Диметилсульфоксид (ДМСО) был приобретен у Sigma-Aldrich. Нейтральный параформальдегид (4%) был приобретен у Biosharp (Хефэй, Китай). Койевая кислота, набор для окрашивания Фонтана-Массона, дезоксихолат натрия и L-ДОФА были приобретены у компании Solarbio (Пекин, Китай). Модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM) была приобретена у Gibco (#C11995500BT, Gibco). Фетальную бычью сыворотку (FBS) и набор для подсчета клеток-8 (CCK8) приобретали у BI (кибуц Бейт-Хемек, Израиль). PMA (12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат, активатор ERK/MAPK) был приобретен у APExBIO (#N2060, APExBIO). Анизомицин (активатор p38/MAPK) был приобретен у MedChem Express (HY-18982, MedChemExpress). Первичные антитела против ras-родственного белка Rab-27A (RAB27A) (#69295,CST), киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK) (#4695,CST), p-ERK (#4370, CST), c- Jun N-концевая киназа JNK(#9252, CST), p-JNK (#4668, CST), p38 (#8690, CST), p38 (#4511, CST), белок, связывающий элемент ответа цАМФ CREB ( № 9107, CST) и p-CREB (№ 9198, CST) были приобретены у компании Cell Signaling Technology. Первичные антитела против TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058, Novusbio), MITF (STJ94134, St. John's Laboratory),ТИР(BS1484, Bioworld) и GAPDH (#AP0066, Bioworld) были приобретены у Abcam, Novusbio, St. John's Laboratory и Bioworld соответственно.

2.2.2. Культура клеток и лечение.

MNT1 и B16F0, богатые меланосомами, широко используются для изучения меланогенеза [38]. Следовательно, эти две клеточные линии были выбраны для последующих экспериментов. Клетки MNT1 и B16F0 культивировали в 20-процентной или 10-процентной фетальной бычьей сыворотке (BiologicalIndustries, Израиль) и 1-процентном пенициллин-стрептомицине (Gibco) в среде DMEM. Все клетки культивировали во влажном инкубаторе при 37°С и 5% СО2. Ситоглузид растворяли в ДМСО, и конечная концентрация ДМСО составляла<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. Разведение и лечение рыбок данио.

Эмбрионы рыбок данио и культуральная среда были приобретены у EzeRinka Biotech (Нанкин, Китай). Экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по этике Третьей больницы Сянъя Центрального Южного университета (№ 2021-S137). В первый день после вылупления рыбок данио выращивали в 12-луночном планшете (10 лунок), защищенном от света, и культивировали при 37°С. Рыбок данио обрабатывали различными концентрациями ситоглузида, и с 24-часовыми интервалами с помощью инвертированного микроскопа делали фотографии для регистрации изменений меланина в хвостах рыбок данио. После того, как снимки были сделаны, растворы ситоглузида различных концентраций считывались и записывались непрерывно в течение одной недели.

2.2.4. Жизнеспособность клеток.

Жизнеспособность клеток оценивали с использованием CCK8.MNT1 и клетки B16F0, высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2000 клеток/лунку или 500 клеток/лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями ситоглузида (25, 50, 100, 200, 400, 600 и 800 мкМ). Через 24 часа или 48 часов в каждую лунку добавляли 10 мкл реагента CCK8 и клетки инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Когда цвет среды становился оранжевым, культуру прекращали и использовали микропланшет-ридер (PerkinElmer EnVision Xcite, Великобритания) для измерения поглощения при 490 нм.

2.2.5. Окрашивание меланина Фонтана-Массона.

Клетки культивировали в 6-луночном планшете и обрабатывали различными концентрациями ситоглузида в течение 2 дней, а в качестве положительного контроля добавляли койевую кислоту в концентрации 200 мкМ. Затем клетки помещали в 4-процентный раствор параформальдегида на 15 мин. После промывки водой клетки инкубировали с аммиачно-серебряным раствором Фонтана в течение 24 ч в темной камере, промывали водой и затем помещали в гипосульфит еще на 5 мин. Для наблюдения за меланином использовали инвертированный микроскоп.

2.2.6. Эксперимент по восстановлению функции.

ФМА, признанный активатор ERK/MAPK [39, 40}, тестировали на цитотоксичность в эксперименте с CCK8 в различных концентрациях (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 и 800 нг/мл) в течение 24 часов. И после обработки клеток MNT1 и B16F0 различными концентрациями (25, 50 и 100 нг/мл) PMA в течение 2 часов уровень фосфорилирования ERK определяли с помощью эксперимента по вестерн-блоттингу. При выбранной концентрации клетки обрабатывали 0, 1, 2, 4, 6 и 8 часов для определения эффективного времени активации. После обработки клеток ситоглузидом (200 мкМ) и ФМА (25 нг/мл) в течение 48 часов (повторная обработка каждые 8 ​​часов) уровни белкаТИРи p-ERK были обнаружены. Окрашивание меланина по Фонтана-Массону определяло содержание меланина. Анизомицин [41] является активатором p38/MAPK, разведочные концентрации которого составляют 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 и 512 нМ, а остальные экспериментальные методы такие же, как у PMA.

2.2.7. Измерения активности TYR.

Клетки обрабатывали различными концентрациями ситоглузида в течение 2 дней. После расщепления и центрифугирования клетки подсчитывали и дважды ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS). Затем к каждому образцу добавляли 500 мкл 0,5-процентного раствора дезоксихолата натрия. Образцы инкубировали при 4 градусах в течение 10 минут, а затем при 37 градусах в течение 15 минут. Добавляли 1 мл 1-процентного раствора L-DOPA, после чего 200 мкл сразу пипеткой вносили в 96-луночный планшет. Затем для измерения значений поглощения (А0) при 475 нм использовали многорежимный планшет-ридер, и измерение повторяли через 30 мин (А30).ТИРактивность рассчитывали как (A{{0}}A0)/число клеток.

2.2.8. Датчик активности TYR.

Ближний инфракрасный флуоресцентный зонд дляТИРактивность на основе резоруфина использовали для визуализации активности в живых клетках, как описано ранее [42]. Вкратце, клетки MNT1 и B16F0 культивировали в 6-луночном планшете и обрабатывали различными концентрациями ситоглузида в течение 2 дней. . Добавляли 10 мкМ флуоресцентный зонд и через 4 часа клетки заменяли PBS. После возбуждения красным светом немедленно использовали флуоресцентный инвертированный микроскоп для фотографирования.

2.2.9. Экстракция белков и вестерн-блоттинг.

После обработки клеток различными концентрациями ситоглузида в течение 2 дней общий клеточный белок экстрагировали с использованием буфера для лизиса RIPA (Thermo Fisher) и коктейлей ингибиторов протеаз и ингибиторов фосфатаз (Roche). Концентрацию белка определяли с использованием набора для анализа белка BCA (KeyGEN Biotec). После блокирования 1-процентным БСА первичные антитела противТИР, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A,CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38 и p-p38 инкубировали с мембранами в течение ночи при 4 градусах при 1:1000 и GAPDH при 1:3000. Мембраны промывали TBS-T и инкубировали с козьими антикроличьими вторичными антителами при 1:3000 в течение 1 часа. Связывающие антитела обнаруживали с помощью электрохемилюминесценции (ECL).

2.2.10. Статистический анализ.

Программное обеспечение SPSS22.0 использовалось для статистического анализа, а t-критерий Стьюдента или однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) использовался для множественных сравнений групп. Для непараметрических данных использовали U-критерий Манна-Уитни. p < 0:05="" во="" всех="" случаях="" считалось="" статистически="" значимым.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01="" и="" ∗p=""><>

3. Результаты

3.1. Композитные ингредиенты ТКМ.

Изучено четырнадцать ТКМ, записанных в Бен-Цао-Ган-Му и в народных рецептах, с антипигментным действием. В общей сложности 372 ингредиента китайской медицины из 14 ТКМ были извлечены из базы данных TCMSP (дополнительная таблица S1).

3.2. Гены-мишени, регулируемые ТКМ, и гены родственной пигментации.

В соответствии с системой прогнозирования мишеней в базе данных TCMSP было получено всего 834 гена-мишени из 14 ТКМ. Всего 9431 ген, связанный спигментациябыли извлечены из базы данных GeneCards, из которых было отобрано 6180, имевших показатель релевантности > 1.

3.3. Рейтинг 14 ТКМ и целевой сети заболеваний.

Используя программное обеспечение Cytoscape, мы провели пересечение регуляторных генов каждой ТКМ и генов, связанных с пигментацией, и получили потенциальные активные ингредиенты и общие гены-мишени. Далее, целевая сеть соединений болезней между ТКМ ипигментациябыл построен. На основании этого мы получили среднюю «степень» каждого активного ингредиента и ранжировали ТКМ в соответствии с их баллами. В соответствии с ранговыми оценками в пятерку лучших трав вошли Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones и Paeoniae Radix Alba (рис. 2(а)). По данным KEGG-анализа 220 генов-мишеней 5 основных ТКМ, 19,3% генов были связаны с сигнальным путем PI3K-Akt, 13,6% генов были связаны с сигнальным путем TNF и около 12,3% генов были связаны с IL{{ 12}}. Кроме того, 37 генов были вовлечены в путь MAPK и 28 генов были вовлечены в путь HIF-1. Эти пути тесно связаны с регуляцией метаболизма меланина и фотостарением кожи. Среди 20 наиболее обогащенных сигнальных путей пути, связанные с воспалением, составляют четверть (рис. 2(с)). На рисунках 2(d)–2(h) показана сеть соединений-мишеней болезни между Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba и пигментацией соответственно. Согласно диаграмме Венна ингредиентов в пяти лучших ТКМ, мы обнаружили, что четыре ТКМ содержат ситоглузид и бета-ситостерол (рис. 2(b), дополнительная таблица S2).

3.4. Потенциальные активные ингредиенты для подавления пигментации.

По данным сети «болезнь-состав-мишень», 148 ингредиентов, связанных спигментациябыли получены от 14 ТКМ. В ходе литературного поиска было сообщено, что 25 из 148 ингредиентов ингибируют меланогенез. Сообщалось о четырех активных ингредиентах в виде растительных экстрактов, которые ингибируют меланогенез. Были изучены четырнадцать активных ингредиентов, и сообщалось, что их производные регулируют пигментацию. Интересно, что было показано, что четыре ингредиента способствуют меланогенезу, в то время как механизм шести ингредиентов в регулировании меланогенеза до сих пор неясен. Остальные 95 потенциальных китайских лекарственных ингредиентов еще не изучены для регуляции пигментации. Подробная информация об этих ингредиентах представлена ​​в дополнительной таблице S3.

3.5. Влияние ситоглузида in vitro и in vivo на меланогенез.

После описанного выше процесса скрининга мы обнаружили, что четыре ТКМ в лучших ТКМ содержат ситоглузид и -ситостерол. Сообщалось, что -ситостерол ингибирует альфа-меланоцит-стимулирующий гормон (-MSH), стимулируя меланогенез через сигнальный путь p38 в клетках меланомы B16F10 [43]. Тем не менее, антипигментные эффекты ситоглузида и его специфический механизм не описаны. Поэтому мы выбрали ситоглузид в качестве лекарственного препарата для этих исследований. Анализ CCK8 был проведен для изучения потенциальных токсических концентраций ситоглузида в клетках MNT1 и B16F0. Результаты показали, что ситоглузид не оказывал явного влияния на пролиферацию клеток (рис. 3(а) и 3(b)) при концентрациях ниже 400 мкМ. Окрашивание меланином, проведенное с использованием 25, 50, 100 и 200 мкМ ситоглузида, показало, содержание меланина в клетках MNT1 и B16F0 в зависимости от дозы (рис. 3(c)). Кроме того, лечение ситоглузидом значительно ингибировало кожные заболевания.пигментацияу рыбок данио в зависимости от времени и дозы (рис. 3(d)). Эти результаты позволяют предположить, что ситоглузид ингибирует меланогенез in vitro и in vivo.

3.6. Влияние ситоглузида на экспрессию TYR.

Судя по предыдущим результатам, ситоглузид может эффективно снижать содержание меланина, но то, как он регулирует этот процесс, до сих пор неизвестно и поэтому представляет интерес. Вестерн-блоттинг был проведен для обнаружения экспрессии генов, связанных с меланогенезом (TYR, MITF, TRP1, TRP2 и RAB27A) на уровне белка. Результаты анализов показали, что экспрессия TYR была значительно снижена, а экспрессия MITF и TRP1 была умеренно снижена после обработки ситоглузидом. (Рисунок 4(а)). Поскольку MAPK и PKA являются ключевыми сигнальными путями, регулирующими TYR, мы дополнительно исследовали изменения в ключевых белках в этих двух путях. После обработки клеток MNT1 и B16F0 ситоглузидом в течение 2 дней уровни фосфорилирования ERK и P38 были значительно снижены. , тогда как не было значительных изменений в общих уровнях белков CREB, ERK, JNK и p38 или уровнях фосфорилирования JNK и CREB (рис. 4 (b), рис. S1A). По результатам эксперимента CCK8 мы обнаружили, что ФМА ниже 100 нг/мл не токсичен для обеих клеток (рис. S1B), а 25 нг/мл ФМА может, очевидно, повышать уровень фосфорилирования ERK. Уровень фосфорилирования ERK постепенно снижался через 4 часа (рис. S1C-D). С помощью окрашивания меланина Фонтана-Массона мы обнаружили, что PMA может значительно увеличить содержание меланина в клетках MNT1 и B16F0. Результаты вестерн-блоттинга также свидетельствуют о том, что PMA может повышать уровень фосфорилирования ERK, а ситоглузид может снижать уровень фосфорилирования ERK, регулируемый PMA. Ингибируя уровень фосфорилирования ERK и снижая уровень белка вТИР, ситоглузид снижает содержание меланина, увеличенное под действием PMA (рис. 4(c) и 4(e), рис. S2A). В то же время мы обнаружили, что анизомицин дает аналогичные результаты. Анизомицин ниже 8 нМ не токсичен для обеих клеток, а 2 нМ анизомицин может значительно повысить уровень фосфорилирования р38. Через 8 часов уровень фосфорилирования p38 все еще высок (рис. S1B, рис. S1E-F). Результаты окрашивания меланина по Фонтана-Массону и вестерн-блоттинга также свидетельствуют о том, что ситоглузид может ингибировать уровень фосфорилирования р38, регулируемый анизомицином, снижая содержание белка TYR и ингибируяпигментация(Рис. 4(d) и 4(f), рис. S2B). Следовательно, ситоглузид может снижать экспрессию TYR путем ингибирования путей ERK/MAPK и p38/MAPK. Однако механизм, с помощью которого ситоглузид ингибирует эти сигнальные пути, остается неясным. Мы проследили вышестоящие мембранные рецепторы этих сигнальных путей и использовали молекулярный докинг для изучения механизма регуляции нижестоящих путей. Энергии связывания между ситоглузидом и шестью мембранными рецепторами, а именно опиоидным u, меланокортином 1, фактором стволовых клеток, эндотелином B, адренергическими рецепторами и простагландиновыми рецепторами, были -7.8, -5.8, {{9 }}.5, -5.4, -3.4 и 0 кал/моль соответственно. Путем молекулярного докинга мы обнаружили, что среди шестимембранных рецепторов ситоглузид имеет очень высокое сродство с опиоидными рецепторами u, меланокортина 1 и фактора роста стволовых клеток (рис. 4(g)). Мы предполагаем, что ситоглузид может ингибировать пути ERK/MAPK и p38/MAPK, связываясь с ранее упомянутыми мембранными рецепторами, тем самым подавляя экспрессию TYR.

3.7. Влияние ситоглузида на активность TYR.

СТИРявляется ключевым ферментом в синтезе меланина, это наиболее важная мишень для ингибирования меланогенеза. Большинство коммерчески доступных косметических средств или средств для осветления кожи, таких как HQ, арбутин и койевая кислота, являются ингибиторами TYR. Мы использовали ситоглузид и некоторые клинически используемыеотбеливание кожиагенты (арбутин, никотинамид, койевая кислота, HQ и аскорбиновая кислота) для проведения молекулярного докинга с TYR. Детальные взаимодействия между ситоглузидом и вышеупомянутыми агентами сТИРпоказаны на рисунке 5(а). Энергии связи этих шести соединений были -6.2, -6.4, -5.6, -5.7, -5.4 и {{ 11}}.4 ккал/моль соответственно. Обычно считается, что когда энергия сродства равна -4, это указывает на силу связывания, а когда она больше или равна -7.0, это указывает на сильную силу связывания. Сторона ситоглу занимает второе место по сродству, немного уступая арбутину, демонстрируя относительно выдающуюся комбинированную способность.

В то же время для определения активности TYR использовали эксперимент по конверсии L-DOPA с использованием койевой кислоты в качестве положительного контроля. Результаты показали, что ситоглузид ингибировал активность TYR в клетках MNT1 и B16F0 зависимым от концентрации образом, а группа с высокой концентрацией (200 мкМ) продемонстрировала ингибирующий эффект, эквивалентный действию 200 мкМ койевой кислоты. кислоты (рис. 5(b) и 5(c)). Кроме того, результаты эксперимента с зондом TYR показали, что по мере увеличения концентрации ситоглузида интенсивность флуоресценции в клетках постепенно снижалась, а интенсивность флуоресценции группы с высокой концентрацией была близка к интенсивности флуоресценции 200 мкМ койевой кислоты в клетках MNT1 и B16F0 (рис. 5(d), Рисунок S2C). Эти результаты показывают, что ситоглузид может эффективно ингибироватьТИРактивность в клетках MNT1 и B16F0. Более того, мы предполагаем, что ситоглузид, как природное стероловое соединение, может напрямую проникать через клеточную мембрану, связываться с TYR и ингибировать его активность, тем самым ингибируя меланогенез.

4. Дискуссия

В этом исследовании мы использовали сетевую фармакологию для изучения механизмов потенциальногоотбеливание кожиингредиенты, обнаруженные в 14 ТКМ, задокументированные в рецептах Бен-Цао-Ганг-Му и народных рецептах, в ингибированиипигментация. Исследование также предложило инновационный метод, который использует топологический параметр средней «степени» каждого активного ингредиента для оценки потенциальной эффективности трав. В соответствии со средней «степенью» были отобраны Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarummultijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones и Paeoniae Radix Alba. сигнальные пути были связаны с воспалением, включая сигнальные пути IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt и MAPK.

Недавно было показано, что различные медиаторы воспаления активируют или ингибируют связанные с меланогенезом сигнальные пути, которые стимулируют или ингибируют кожные процессы.пигментация[6]. В культуре клеток меланомы B16F10 TNF- снижал экспрессиюТИРи активность TRP1 и TYR дозозависимым образом [44]. IL-17 и TNF- могут снижать экспрессию генов, связанных с меланогенезом, в меланоцитах, а IL-17 может значительно усиливать ингибирующее действие TNF- на меланогенез. После лечения этанерцептом (анти-ФНО) гены, связанные с меланогенезом, были значительно активизированы в кожных поражениях пациентов с псориазом [45]. Сообщалось, что HIF-1, мощный транскрипционный фактор, регулирующий воспалительный ответ, участвует в регуляции таких факторов, как IL-17 и TNF- [46-48]. Следовательно, HIF-1, вероятно, участвует в регуляции меланогенеза, влияя на воспаление. Другие цитокины, такие как IL-18, IL-33, GM-CSF и IL-1 могут способствовать меланогенезу, активируя PKA, MAPK или другие сигнальные пути, в то время как IFN-, IL-1, IL-4 и IL-6 снижают меланогенез, ингибируя STAT1, NF-kB, и сигнальные пути JAK2-STAT6 [6]. Наши результаты показывают, что пять лучших ТКМ (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones и Paeoniae Radix Alba) могут оказывать антипигментное действие, главным образом, за счет противовоспалительных путей. В предыдущей литературе также упоминалось, что эти пять лучших ТКМ обладают мощным противовоспалительным и омолаживающим действием [49, 50]. Это также подтверждает нашу гипотезу о том, что ТКМ могут играть существенную роль в поствоспалительной пигментации.

Изучая литературу о 148 ингредиентах, найденных в 14 ТКМ, мы также обнаружили, что среди 35 ингредиентов, о которых сообщалось, почти 70 процентов из них либо уменьшали содержание меланина, либо ингибировали активность TYR. Это не только подтверждает, что записи рецептов отбеливания кожи в древних книгах в значительной степени надежны, но также показывает, что ссылка на древнюю литературу является надежным методом получения знаний о ТКМ. Есть еще 95 соединений, которые остаются неизученными и обладают потенциалом противостоятьпигментация. Путем анализа диаграмм Венна пяти лучших ТКМ было получено 13 общих ингредиентов. Среди них эксперименты in vitro подтвердили, что даидзеин, рутин и (плюс)-катехин могут снижать содержание меланина [51–53]. Сахароза нарушает правильное созревание меланосом. вызывая осмотический стресс и ингибируя путь киназы PI3, тем самым вмешиваясь в меланогенез [54]. Кверцетин снижает меланогенез, вызванный окислительным стрессом [55]. Кроме того, химические и физические методы, такие как спектроскопический анализ и анализ структурной активности, подтвердили, что лупеоланд кемпферол может ингибироватьТИРи уменьшить меланогенез [56, 57]. Это указывает на то, что сетевая фармакология, возможно, является подходящим методом раскопок.отбеливаниеингредиенты. Четыре ТКМ из пяти лучших ТКМ содержали ситоглузид, и нет сообщений о том, регулирует ли ситоглузид пигментацию или связанный с ней механизм. Поэтому мы выбрали ситоглузид для этих исследований.

Сообщалось, что ситоглузид, стероловый гликозид, широко присутствующий в растениях, оказывает противоопухолевое, антиоксидантное и нейропротекторное действие [58–60]. В этом исследовании мы обнаружили, что ситоглузид эффективно снижает содержание меланина in vitro и in vivo. Последующие эксперименты показали, что он может значительно снижать экспрессию TYR. Койевая кислота использовалась в качестве положительного контроля, и она также может ингибировать уровни белка генов, связанных с меланогенезом, таких как TYR, MITF и TYRP1, при стимуляции -MSH, о чем сообщили Jeon et al. [61]. Учитывая отсутствие экзогенной стимуляции, 200 мкМ койевой кислоты оказывали лишь умеренное ингибирующее действие на экспрессию генов в нашем исследовании, но поскольку койкацид обладает высокой активностью в отношении ингибирования тирозиназы, мы по-прежнему используем ее в качестве положительного контроля в этом исследовании. Сообщалось, что экспрессия TYR прямо или косвенно регулируется путями MAPK или PKA, соответственно. Было подтверждено, что все большее число ингредиентов оказывает отбеливающее действие на кожу за счет ингибирования сигнального пути MAPK. Например, фаргезин снижает экспрессиюТИРпутем ингибирования пути P38/MAPK [62]. Полисахариды Ganoderma lucidum могут противостоять меланогенезу, индуцированному УФ-В, путем подавления пути MAPK [63]. Наше исследование показало, что ситоглузид в концентрации 200 мкМ обладает потенциалом снижать экспрессию TYR путем ингибирования сигнальных путей ERK/-MAPK и P38/MAPK. Об этом сообщалось посредством молекулярной стыковки между расположенными выше мембранными рецепторами путей MAPK [64] и ситоглузидом. Мы обнаружили, что ситоглузид прочно связывается с опиоидными рецепторами u, меланокортина 1 и фактора роста стволовых клеток. Поэтому мы предполагаем, что ситоглузид может взаимодействовать с этими мембранными рецепторами, ингибировать сигнальные пути ERK/MAPK и P38/MAPK и снижать экспрессию TYR.

Поскольку TYR является ключевым ферментом в синтезе частиц меланина в меланоцитах, ингибирование активности каталитического центра TYR необходимо для уменьшения кожных дефектов.пигментация[65]. Многие средства для осветления кожи на рынке являются ингибиторами активности TYR, такие как HQ, арбутин и койевая кислота. В этом исследовании мы использовали молекулярный докинг для изучения связывающих эффектов ситоглузида и пяти распространенныхотбеливание кожиактивные ингредиенты (арбутин, никотинамид, койевая кислота, ГХ и аскорбиновая кислота) [66] сТИР. Результаты показали, что ситоглузид имеет сильное сродство связывания с TYR, более слабое, чем арбутин, но более сильное, чем койевая кислота, никотинамид, HQ и аскорбиновая кислота. Арбутин является пролекарством HQ и натуральным продуктом, который может снижать или ингибировать синтез меланина путем ингибирования TYR. Однако природная форма арбутина химически нестабильна и может превращаться в HQ, который катализируется и метаболизируется в метаболиты бензола с потенциальной токсичностью для костного мозга [67]. Использование койевой кислоты в косметике ограничено из-за ее канцерогенности и нестабильности при хранении [68]. Таким образом, ожидается, что ситоглузид, природное соединение стеролов, полученное из различных растений, будет действовать как сильнодействующее средство для осветления кожи. Однако растворимость ситоглузида в ДМСО низкая, что также является недостатком этого природного ингредиента. Последующая экспериментальная проверка показала, что ситоглузид безопасен для клеточных линий MNT1 и B16F0, а группа с низкой концентрацией оказывает хорошее ингибирующее действие на активность TYR, в то время как группа с высокой концентрацией оказывает такое же действие, как и койевая кислота той же концентрации. Таким образом, ситоглузид можно использовать в терапевтических целях в качестве регулятора отбеливания кожи, который не только снижает экспрессию TYR, но также ингибирует его активность (рис. 6).

5. Выводы

Сетевая фармакология может быть эффективным инструментом для открытия естественных ингредиентов, уменьшающих пигментацию кожи, и их возможных механизмов. Fructus LigustriLucidi, Hedysarum multijugum maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones и PaeoniaeRadix Alba обладают потенциаломотбеливание кожисвойства и может ингибироватьпигментацияпутем регулирования воспаления. Ситоглузид - новыйотбеливание кожиактивный ингредиент с двойным регулирующим действием, а именно. запрещающийТИРэкспрессивность и активность.

цистанхе таблетки