Дизайн In Silico беспорядочной химерной многоэпитопной вакцины против Mycobacterium Tuberculosis Часть 1

Абстрактный

Туберкулез (ТБ) представляет собой глобальную угрозу для здоровья, ежегодно убивая около 1,5 миллиона человек. Ликвидация Mycobacterium tuberculosis, основного возбудителя туберкулеза, становится все более сложной задачей из-за появления широко распространенных штаммов, устойчивых к лекарственным препаратам. Вакцинация считается эффективным способом защиты хозяина от патогенов, но единственная клинически одобренная противотуберкулезная вакцина, бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ), имеет ограниченную защиту у взрослых. Было обнаружено, что мультиэпитопные вакцины повышают иммунитет к заболеваниям за счет селективного комбинирования эпитопов из нескольких белков-кандидатов.

Туберкулез — это инфекционное заболевание, вызываемое бактерией Mycobacterium tuberculosis, которая в основном поражает легкие, но может поражать и другие органы. Иммунитет играет важную роль в развитии и лечении туберкулеза.

В случае недостаточного иммунитета микобактерии туберкулеза могут легко проникнуть в организм человека и перерасти в туберкулез. Например, ослабление иммунной системы в результате определенных заболеваний или лечения повышает риск заражения туберкулезом. Кроме того, такие факторы, как недоедание, низкое качество жизни и чрезмерный стресс, также могут ослабить иммунитет, что приведет к развитию туберкулеза.

Поэтому поддержание хорошего здоровья и укрепление иммунитета очень важно для профилактики туберкулеза. Иммунитет можно повысить с помощью здорового питания, регулярного образа жизни, правильных физических упражнений и достаточного количества сна, что может эффективно снизить риск заражения различными заболеваниями, включая туберкулез.

Иммунитет также важен для лечения и выздоровления, когда туберкулез уже развился. Чем сильнее иммунная система, тем эффективнее организм может защитить себя от атаки бациллы туберкулеза и выработать достаточное количество антител для борьбы с болезнью. Поэтому поддержание адекватного питания, правильные физические упражнения и позитивный настрой могут улучшить иммунитет и способствовать выздоровлению.

В заключение, существует тесная связь между иммунитетом и туберкулезом. Поддержание хорошего здоровья и повышение иммунитета является одним из важных способов профилактики и лечения туберкулеза. Давайте смотреть на жизнь позитивно, вести здоровый образ жизни и держаться подальше от болезней. С этой точки зрения нам необходимо повышать свой иммунитет. Цистанхе позволяет значительно повысить иммунитет, так как зола мяса содержит множество биологически активных компонентов, таких как полисахариды, два гриба, хуан ли и др. Эти компоненты способны стимулировать иммунную систему различных типов клеток системы, повышать их иммунную активность.

Нажмите Польза цистанхе для здоровья

Это исследование было направлено на разработку мультиэпитопной вакцины против туберкулеза с использованием иммуноинформатического подхода. Благодаря функциональному обогащению мы идентифицировали восемь белков, секретируемых M.tuberculosis, которые либо необходимы для патогенеза, либо секретируются во внеклеточное пространство, либо и то, и другое. Затем мы проанализировали эпитопы этих белков и выбрали 16 эпитопов хелперных Т-лимфоцитов с интерферониндуцирующей активностью, 15 эпитопов цитотоксических Т-лимфоцитов и 10 эпитопов линейных В-клеток и конъюгировали их с адъювантом и Pan HLA DR-связывающим эпитопом (PADRE), используя соответствующие линкеры.

Кроме того, мы предсказали третичную структуру этой вакцины, ее потенциальное взаимодействие с Toll-подобным рецептором -4 (TLR4) и иммунный ответ, который она может вызывать. Результаты показали, что эта вакцина обладает сильным сродством к TLR4, который может значительно стимулировать клетки CD4 плюс и CD8 плюс к секреции иммунных факторов и В-лимфоциты к секреции иммуноглобулинов для получения хорошего гуморального и клеточного иммунитета. В целом было предсказано, что этот многоэпитопный белок будет стабильным, безопасным, высокоантигенным и высокоиммуногенным, что потенциально может служить глобальной вакциной против туберкулеза.

1. Введение

Туберкулез (ТБ), высококонтагиозное заболевание, вызываемое микобактериями туберкулеза, оценивается Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) как основная причина смерти от одного инфекционного агента [1–3]. В 2021 г. расчетное число случаев смерти и новых случаев туберкулеза достигло 1,6 млн и 10,6 млн соответственно [4]. В настоящее время клиническое лечение ТБ относительно ограничено, и в основном используется комбинация нескольких противомикробных препаратов.
Этот цикл химиотерапии очень длинный, обычно занимает от девяти до двенадцати месяцев или даже дольше [5], что увеличивает риск устойчивых к лекарственным препаратам мутаций M.tuberculosis [6,7]. В последние годы химиотерапия стала менее эффективной из-за появления и увеличения доли M.tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью [6]. Предотвращение развития туберкулеза может быть более эффективным, чем его лечение. Хорошо известно, что вакцинация является эффективным способом защиты хозяина от патогенных бактерий [8].

В настоящее время Bacillus Calmette-Guérin (BCG), разработанная более 100 лет назад, является единственной клинически одобренной противотуберкулезной вакциной [9]. К сожалению, БЦЖ защищает только новорожденных и детей грудного возраста и в значительной степени неэффективна в отношении подростков и взрослых [2,10], хотя ВОЗ сообщает, что 89 процентов случаев туберкулеза в 2021 г. приходилось на взрослых [4]. Поэтому существует острая необходимость в разработке новой и эффективной противотуберкулезной вакцины, особенно для подростков и взрослых.

Разработка противотуберкулезной вакцины осложняется многочисленными особенностями микобактерий, такими как латентная инфекция, персистенция и уклонение от иммунитета [11–13]. Идеальная противотуберкулезная вакцина должна быть нацелена на белки/пути, ответственные за эти свойства M.tuberculosis, и должна быть способна эффективно индуцировать CD4-плюс и CD8-плюс Т-клеточный иммунный ответ [14].

Более того, эффективная вакцина также должна быть нацелена на главные комплексы гистосовместимости (MHC) хозяина, которые являются высоко полиморфными [15]. Эти характеристики выдвигают очень высокие требования к универсальности вакцины, которая, очевидно, не может быть достигнута одним природным белком. Мультиэпитопная вакцина, рекомбинантный белок, состоящий из ряда перекрывающихся эпитопов (пептидов) [16], представляет собой новый тип вакцины-кандидата, который может решить вышеуказанные проблемы.

В последние годы многоэпитопные вакцины привлекли большое внимание из-за их преимуществ более высокого иммунитета и меньшей аллергенности, чем у обычных вакцин [17,18]. В настоящее время разработаны многоэпитопные вакцины против многих патогенных микроорганизмов, включая Shigella spp. [19], вирус ящура [20], Helicobacter pylori [21,22], вирус гепатита В [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], вирус Nipah [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] и вирус лейкоза [29].

В частности, появление пандемии COVID-19 усилило применение этой технологии [16,30–32]. Что касается ТБ, было разработано несколько многоэпитопных вакцин для борьбы с изначально активным ТБ [33–39] и латентным ТБ [40,41]. Среди них три вакцины-кандидата были разработаны в форме ДНК [34,36,40], а две из них включали эпитопы в белковые цепи для создания рекомбинантных вакцин [34,36].

Следует отметить, что белки-кандидаты для некоторых из вышеперечисленных многоэпитопных вакцин выбираются случайным образом, и охват населения этими вакцинами требует дальнейших исследований.

Более того, были разработаны две многоэпитопные кандидатные противотуберкулезные вакцины с широким охватом населения, один эпитоп был выбран из белков везикул иммуногенных экзосом с патогенными свойствами [39], а другой не фокусируется на белках-кандидатах, а напрямую отбирает высококонсервативные и экспериментально подтвержденные эпитопы из базы данных иммунных эпитопов (IEDB) [38]. Однако этим белкам-кандидатам не хватает функционального обогащения, и способность вакцин-кандидатов индуцировать секрецию интерферона (IFN-) еще предстоит улучшить.

Предыдущее исследование показало, что рациональная оптимизация эпитопов может быть достигнута за счет комбинации связывающей способности MHC и способности эпитопа реагировать с рецепторами Т-клеток [42]. Кроме того, они предсказали, что вакцины с эпитопами, связывающими цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) A1, A2, A3, A24 и B7, будут иметь почти 100-процентное покрытие в основных этнических группах (афроамериканцы, азиаты, латиноамериканцы и европеоиды).

Однако до сих пор не было подобного подхода к разработке противотуберкулезной вакцины. В этом исследовании мы разработали мультиэпитопную противотуберкулезную вакцину с высокой неразборчивостью, используя различные антигенные свойства восьми функционально обогащенных белков. Химерная вакцина-кандидат обладает 15 эпитопами CTL, 16 эпитопами хелперных Т-лимфоцитов (HTL) с IFN- -индуцирующими свойствами и 10 линейными эпитопами B-клеток. Иммуноинформатический анализ показал, что эта вакцина-кандидат является «всеохватывающей», что делает ее потенциальным краеугольным камнем для достижения «Стратегии ликвидации туберкулеза».

2. Материалы и метод

2.1. Выбор белка и поиск последовательности

Для конструирования мультиэпитопной вакцины против туберкулеза мы сначала выбрали белки комплекса M.tuberculosis, которые депонированы в базе данных IEDB [43] и были подтверждены как связывающие эпитопы MHC класса I и II. Аминокислотные последовательности (первичная структура) белков штамма M.tuberculosis H37Rv были получены из базы данных UniProt [44]. Независимые от выравнивания прогнозы перспективных антигенов на основе физико-химических свойств были получены с сервера VaxiJen 2.0 [45], который подвергся автоматическому и кросс-ковариационному (ACC) преобразованию белковых последовательностей в однородный вектор основных аминокислот. свойств, с порогом антигенности, установленным на уровне 0.4 для каждого бактериального белка [45,46].

Функциональную аннотацию белков оценивали с использованием базы данных для аннотации, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID) 6.8 [47]. Секретируемые белки дополнительно обогащались с использованием двух категорий: внеклеточное пространство и патогенез через базы данных DAVID и BioCyc [48] соответственно. Протеом Homo sapiens GRCh38.p13 был загружен в формате FASTA из базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) [49]. BLASTp использовали для предсказания гомологии (значение E =1e-5) между секретируемыми белками и белками H. sapiens.

2.2. Предсказание Т-клеточного эпитопа

Прогнозирование и выбор эпитопов являются важными этапами в создании многоэпитопных вакцин. Молекулы MHC I связывают короткие пептиды (9–11 аминокислот), поскольку пептидсвязывающая щель молекул MHC I, состоящая из одной цепи, закрыта [50]. Для предсказания эпитопов ЦТЛ использовали свободно доступную программу NetMHCpan-4.1 [51], которая использует NNAlign_MA для получения процентных рангов (процентного ранга) на основе комбинации аффинностей связывания MHC I и элюированных лигандов. .

«Процентное ранжирование» запрашиваемой последовательности определяли путем сравнения ее оценки предсказания с распределением оценок предсказания для соответствующего MHC, рассчитанного с использованием набора случайно выбранных нативных пептидов. Эпитопы с процентным рангом < 0,5% считались сильными связывателями, тогда как эпитопы с процентным рангом <2 процентов считались слабыми связывателями [51].

Хотя на сервере можно предсказать до 12 эпитопов MHC класса I супертипа, мы использовали только A1, A2, A3, A24 и B7, поскольку эти пять супертипов охватывают 100 процентов основных человеческих рас [42]. . Мы выбрали сильные связывающие вещества и предсказали их антигенность, используя VaxiJen2.0 [45], затем мы предсказали иммуногенность класса I, используя Международную базу данных эпитопов (IEDB) [52], которая использует 3-кратную перекрестную проверку.

Наконец, мы упорядочили эпитопы, которые были как антигенными, так и иммуногенными, в соответствии с процентным ранжированием и выбрали 15 эпитопов с низкой оценкой, по три для каждого супертипа и по крайней мере один для каждого белка-кандидата, за исключением белка-кандидата, который не мог иметь сильный эпитоп, связывающий ЦТЛ. то есть антигенным и иммуногенным. Наконец, значения IC50 для каждого эпитопа CTL были предсказаны по NetMHC-4.0 [53].
Молекулы MHC класса II связываются с антигенными пептидами, и образующийся комплекс может быть распознан HTL. Обычно антигенные пептиды имеют длину от 12 до 20 аминокислотных остатков, но часто наблюдаются пептиды длиной от 13 до 16 остатков [54].

{{0}}mers были наиболее распространенными эпитопами MHC II для M.tuberculosis и были депонированы в IEDB. В результате мы использовали NetMHCIIpan-4.0 [51,55] для предсказания связывания 15-mer пептидов с человеческим лейкоцитарным антигеном-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, и аллель H-2–1. Прогноз также был основан на NNAlign_MA с процентным ранжированием < 2 процентов и < 10 процентов, рассматриваемых как сильные и слабые связующие, соответственно [51].

Кроме того, мы предсказали эпитопы, индуцирующие 15-mer IFN, для белков-кандидатов, используя сервер IFNepitope [56], в котором используется гибридный подход на основе машины опорных векторов, позволяющий проводить виртуальный скрининг пептидов/эпитопов, индуцирующих IFN- -в пептиде. библиотека, состоящая из IFN- -индуцируемых и неиндуцируемых связующих MHC II, которые активируют Т-хелперные клетки. Затем мы предсказали антигенность эпитопов, индуцирующих IFN [45], и, наконец, мы выбрали 16 наиболее беспорядочных эпитопов, которые были сильно связывающими MHC-II, индуцирующими IFN и антигенными.

Важно отметить, что сигнальные пептиды были удалены из белков-кандидатов до предсказания эпитопа. В этом исследовании сигнальные пептиды подвергали скринингу с использованием SignalP 5.0 [57] и TargetP2.0 [58].

2.3. Предсказание линейного В-клеточного эпитопа

Линейные эпитопы B-клеток (16-mers) были предсказаны с использованием ABCpred [59,60] с порогом по умолчанию 0,51. Кроме того, для повышения надежности результатов прогнозирования мы также использовали BepiPred 2.0 [61] для прогнозирования линейных эпитопов В-клеток. Эпитопы, полученные из этих двух программ, далее подвергали предсказанию антигенности с использованием VaxiJen2.0 [45]. Наконец, мы выбрали десять линейных В-клеточных эпитопов на основании высоких показателей ABCred и антигенности, при этом для каждого белка-кандидата был выбран по крайней мере один эпитоп.

2.4. Конструирование многоэпитопной вакцины-кандидата с химерными свойствами

Разработанная мультиэпитопная вакцина содержит один адъювант HBHA (гепарин-связывающий гемагглютинин), один Pan-HLA-DR-связывающий эпитоп (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 линейных В-клеточных эпитопов и одну метку His×6 (рис. 3). Линкеры использовали для соединения эпитопов, предотвращения образования соединительных эпитопов и усиления процессии и регенерации отдельных эпитопов в химерных вакцинах [62].

Для конструирования этой вакцины-кандидата адъювант HBHA (идентификатор UniProt: P9WIP9) был расположен на N-конце и связан с нижестоящим PADRE через линкер EAAAK. Затем эпитопы HTL, соединенные линкерами GPGPG, были связаны с PADRE. Более того, эпитопы CTL, соединенные линкером AAY, были соединены с эпитопами HTL через линкер HEYGAEALERAG, который также соединял эпитопную единицу CTL с линейными В-клеточными эпитопами, связанными с помощью линкеров KK. Наконец, к С-концу химерного белка прикрепляют метку His×6.

2.5. Антигенность, аллергенность и физико-химические свойства

Антигенность многоэпитопной вакцины и восьмикомпонентных белков была предсказана сервером VaxiJen 2.0 [45], а аллергенность этих белков была предсказана сервером AllerTOP 2.0 [ 63]. AllerTOP 2.0 использует E-дескрипторы аминокислот, преобразование ACC белковых последовательностей и k-ближайших соседей (kNN) для классификации аллергенов.

Метод достиг точности 85,3% с 5-кратной перекрестной проверкой. Для прогнозирования физико-химических свойств, таких как период полувыведения, изоэлектрическая точка, индекс нестабильности, алифатический индекс и общее среднее гидропатичности (GRAVY) этой многоэпитопной вакцины, использовался сервер ExPASy ProtParam [64].
Кроме того, растворимость мультиэпитопного вакцинного пептида оценивали с использованием сервера Prosoll (PROSO II) [65] на основе классификатора, использующего тонкие различия между хорошо известными нерастворимыми белками из TargetDB и растворимыми белками из TargetDB и PDB [65]. 66]. При оценке с использованием 10-кратной перекрестной проверки была достигнута точность 71,0 процента (площадь под ROC-кривой=0,785).

2.6. Иммунное моделирование

Чтобы охарактеризовать профиль иммунного ответа и иммуногенность вакцины, было выполнено иммунное моделирование in silico с использованием сервера C-ImmSim [67]. C-ImmSim прогнозирует иммунные взаимодействия, используя позиционно-специфические оценочные матрицы, полученные с помощью методов машинного обучения для прогнозирования пептидов.
Он одновременно моделирует три компартмента, представляющие три отдельные анатомические области млекопитающих: (i) костный мозг, где гемопоэтические стволовые клетки моделировались для производства новых лимфоцитов и миелоидных клеток; (ii) тимус, где были отобраны наивные Т-клетки, чтобы избежать аутоиммунитета; и (iii) лимфатический орган, такой как лимфатические узлы.

Чтобы эффективно примировать и стимулировать вакцину, мы следовали подходу [68], когда вводились две инъекции с интервалом в четыре недели. Все параметры моделирования были установлены на значения по умолчанию, с временными шагами, установленными на 10 и 94 (каждый временной шаг составляет восемь часов).

2.7. Предсказание неупорядоченной области

Внутренне неупорядоченные области (IDR) присутствуют во многих белках. Неупорядоченная область была предсказана с помощью DISOPRED3 [69], который использует DISOPRED2 и два других модуля на основе машинного обучения, обученных на больших IDR для выявления неупорядоченных остатков. Они были тогда анно

2.8. Предсказание вторичной и третичной структуры

Вторичная структура разработанной вакцины была предсказана сервером PSIPRED 4.0 [70], который сначала использует PSI-BLAST для идентификации последовательностей, тесно связанных с запрашиваемым белком. Третичная структура этой вакцины была предсказана с помощью сервера Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER) [71].

В моделировании ITASSER есть четыре ключевых этапа; а) идентификация шаблона резьбы; б) итеративное моделирование сборки конструкции; в) выбор и уточнение модели; и d) функциональная аннотация на основе структуры [72,73].

I-TASSER сгенерировал пять моделей, которые были проверены с помощью ProSA-web [74], и для дальнейшего уточнения была выбрана модель с наименьшим Z-показателем. ProSA-web сравнивает оценки модели, полученные из экспериментально проверенных структур, депонированных в PDB. График локальной оценки качества помогает определить проблемные области в модели, и те же самые оценки были представлены с использованием цветового кода при представлении трехмерной структуры. Это полезно для раннего структурного определения и уточнения.

2.9. Уточнение третичной структуры

«Грубая» трехмерная модель вакцины-кандидата, полученная ITASSER, была уточнена в два этапа с использованием двух серверов; сначала с ModRefiner [75], затем GalaxyRefine [76]. ModRefiner использует трассировки C, чтобы повлиять на построение и уточнение белков, полученных путем двухэтапной минимизации энергии на атомном уровне.

Во-первых, следы C были использованы для построения основной цепи, после чего последовало уточнение ротамеров боковых цепей и атомов основной цепи с использованием составных силовых полей, основанных на физике и знаниях. GalaxyRefine использует несколько шаблонов для создания надежных основных структур, в то время как ненадежные контуры или терминалы были созданы с помощью моделирования на основе оптимизации.

2.10. Проверка третичной структуры

Уточненная структура вакцины-кандидата была подтверждена графиками Рамачандрана, полученными из баз данных PROCHECK [77] и MolProbity [78]. Графики Рамачандрана оценивают конформацию скелета белков путем разделения аминокислотных остатков на две области: разрешенную и запрещенную. PROCHECK использует стереохимию для оценки чистого качества белковых структур, сравнивая их с уточненными структурами с тем же разрешением, а затем представляя области, требующие дальнейшего анализа.

Molprobity проверяет локальные и глобальные модели макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) с помощью сочетания рентгеновских лучей, ЯМР, вычислительных и криоЭМ критериев [79]. Мощность и чувствительность для оптимизации размещения водорода и анализа контактов всех атомов широко используются в обновленной версии критериев ковалентной геометрии и торсионного угла [80].

2.11. Прерывистые В-клеточные эпитопы

Прерывистые В-клеточные эпитопы в структуре нативного белка были предсказаны с помощью ElliPro [81]. ElliPro реализует три алгоритма для аппроксимации формы белка в виде эллипсоида, вычисляет индекс выступания остатков (PI) и группирует соседние остатки на основе их значений PI. ElliPro предоставляет каждому выходному эпитопу оценку, описанную как усредненное значение PI для остатка эпитопа. Эллипсоид со значением PI 0,9 состоит из 90 процентов содержащихся белковых остатков, а оставшиеся 10 процентов остатков лежат вне эллипсоида. Для каждого остатка эпитопа значение PI вычисляют, исходя из центра масс остатка, лежащего за пределами максимально возможного эллипсоида.

2.12. Молекулярный докинг химерных белков

Молекулярный докинг разработанной вакцины (лиганда) с иммунным рецептором Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) проводили с помощью Patchdock [82]. Затем 10 лучших моделей были уточнены с помощью FireDock [83]. PatchDock заменяет представление поверхности молекул точками Коннолли вогнутыми, выпуклыми и плоскими участками.

Затем модели оценивались на основе геометрического соответствия и атомной десольватации. [82]. FireDock оптимизирует конформации боковых цепей и ориентацию твердого тела и создает на выходе усовершенствованный комплекс в 3D на основе энергии связывания [83]. В качестве стыковочного комплекса мы выбрали первую модель Firedock на основе глобальной энергетики. Наконец, с использованием сервера PRODIGY [84] была предсказана энергия связывания и содержание диссоциации в док-комплексе.

2.13. Моделирование молекулярной динамики

Молекулярно-динамическое моделирование белков выполнялось с использованием быстрого и свободно доступного веб-сервера, сервера анализа внутренних координат в нормальном режиме (iMODS) [85], а последовательные и оптимальные результаты стыковки были получены с сервера PatchDock-FireDock. Во внутренних координатах анализ нормального режима (NMA) генерирует коллективные движения, критические для макромолекулярной функции. iMODS представляет механизмы для изучения этих режимов, такие как анализ вибрации, анимация движения и траектории морфинга, которые выполнялись почти интерактивно при разных разрешениях [85].

2.14. Обратная трансляция, оптимизация кодонов и клонирование вакцины in silico

Для эффективной экспрессии вакцины-кандидата в клетках Escherichia coli кДНК создавали in silico путем оптимизации кодонов и обратной трансляции с использованием Java Codon Adaptation Tool (JCAT) [86].

Оптимизация включала (i) отказ от ро-независимых терминаторов транскрипции, ii) отказ от сайтов связывания прокариотических рибосом, (iii) отказ от сайтов расщепления ферментами рестрикции NcoI и XhoI, которые служат N-концевыми и C-концевыми сайтами рестрикции для встраивания кДНК. шаблон вакцины и (iv) только частичная оптимизация для применения сайт-направленного мутагенеза. Индекс адаптации кодонов (CAI) и содержание GC предсказывали качество кДНК с опаловым стоп-кодоном (TGA), вставленным после метки His×6. Затем оптимизированный фрагмент ДНК химерной вакцины-кандидата интегрировали в обратную цепь pET-28a(plus) с помощью инструмента SnapGene [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com