In vitro оценка наиболее активных штаммов пробиотиков, способных улучшать барьерные функции кишечника и предотвращать воспалительные заболевания желудочно-кишечной системыⅡ

2. Материалы и методы

2.1. Клеточные культуры

Клетки Caco{{0}} аденокарциномы толстой кишки человека (ATCC® HTB-37™) и клетки HT29-MTX, секретирующие эпителиальную слизь толстой кишки человека (Sigma Aldrich), сначала культивировали отдельно, оба с использованием Среда DMEM (Gibco) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco), 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина (Gibco) и 2 мМ глутамина (Gibco) при 37 ◦C в атмосфере с 5% CO2. Затем совместные культуры помещали в планшеты 12-wellTranswell® (с поликарбонатной вставкой толщиной 12 мм и порами 0,4 мкм), помещая клетки в базолатеральный отсек в соотношении Caco-2:HT 75:25. 29-MTX и проводили в течение 21 дня, меняя среду каждые 2 дня.

Нажмите, чтобы быстро облегчить запор

2.2. Бактериальные штаммы

Штаммы лактобактерий, в том числе Limosilactobacillusfermentum, выделенные из буйволиного молока [32], Levilactobacillus brevis SP-48, Lacticaseibacillus rhamnosus IMC501, Limosilactobacillus reuteri LR92 и Lacticaseibacillus paracasei IMC502, предоставленные руководителем проекта Incube, R&D—IBSA Farmaceutici Italia, культивировались в биореакторе. мышление процессы и лиофилизацию для получения порошков, используемых в качестве исходного материала. Перед экспериментом порошки ресуспендировали и выращивали в бульоне Мана, Рогозы и Шарпа (MRS-Оксоид) при 37 ◦С в микроаэрофильных условиях в течение 24 ч.

2.3. Клеточная обработка

Совместно культивированные клетки обрабатывали различными штаммами Lactobacillus spp. (108 КОЕ/мл) при множественности инфекции (МВД) 100, отдельно или в сочетании с 20 мкг/мл липополисахарида (ЛПС) S. Typhimurium, в течение 24 ч при 37 ◦C и 5% CO2 в DMEM без антибиотиков.

2.4. ПЦР в реальном времени

Чтобы оценить экспрессию про- и противовоспалительных цитокинов, HBD-2 и TJ, клетки в конце обработки трижды промывали стерильным PBS и общую РНК экстрагировали с использованием набора для выделения РНК High Pure (High Pure RNA Isolation Kit). Roche Diagnostics). Всего 2{{20}}0 нг клеточной РНК было обратно транскрибировано (Expand Reverse Transcriptase, Roche) в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием случайных гексамерных праймеров (рандомгексамеры, Roche) при 42 ◦С в течение 45 мин согласно инструкции производителя. ПЦР в реальном времени на IL-6, IL-8, TNF-, IL-1, TGF-, HBD-2, окклюдин, зонулин-1 и клаудин{{ 14}} проводили с использованием набора LC Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Diagnostics) с использованием 2 мкл кДНК, что соответствует 10 нг общей РНК в конечном объеме 20 мкл, 3 мММgCl2 и 0,5 мкМ смыслового и антисмыслового праймеров ( Таблица 1). После амплификации анализ кривой плавления проводили путем нагрева до 95 ◦C в течение 15 с со скоростью перехода температуры 20 ◦C/с, охлаждения до 60 ◦C в течение 15 с со скоростью перехода температуры 20 ◦C/с, а затем нагрев образца со скоростью 0,1 ◦С/с до 95 ◦С. Затем результаты анализировали с использованием программного обеспечения LightCycler (Roche Diagnostics). Стандартную кривую каждой пары праймеров устанавливали с помощью серийных разведений кДНК. Все ПЦР проводили в трех экземплярах. СпецификаНаличие продуктов амплификации проверяли с помощью электрофореза на 2% агарозном геле и визуализации окрашиванием бромистым этидием [6].

2.5. ИФА-анализ

Присутствие IL-6, IL-8, IL-1, TNF-, TGF-, HBD-2, зонулина-1, окклюдина и клаудина{{7 }} в клеточных лизатах совместных культур Caco-2/HT29-MTX, инфицированных различными штаммами лактобацилл с LPS или без него, анализировали с помощью иммуноферментного анализа (ELISA; Invitrogen, IL{{12) }}, IL-8, IL-1 альфа, TNF альфа и TGF бета-1 HumanELISA Kit; Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Дефенсин 2, бета (человек) — набор ELISA; Elabscience Biotechnology Inc. Человеческий зонулин, человеческий OCLN (окклюдин) и человеческий CLDN1 (клаудин 1) набор для ИФА).

2.6. Анализ адгезии и инвазивности

Способность L. brevis, L. reuteri и L. rhamnosus снижать адгезивность и инвазивную способность S. Typhimurium и EIEC в кишечных совместных культурах исследовали в трех различных типах экспериментов: (i) конкурентный анализ, в котором эпителиальные клетки кишечника инкубировали одновременно с лактобактериями (108 КОЕ/мл) и S. Typhimuriumor EIEC (108 КОЕ/мл) в течение 2 ч. (ii) Анализ ингибирования, в котором клетки предварительно инкубировали с лактобациллами (108 КОЕ/мл) в течение 2 часов, а затем добавляли S. Typhimurium или EIEC (108 КОЕ/мл) и инкубировали еще 2 часа. (iii) Анализ вытеснения, в котором клетки предварительно инкубировали с S. Typhimurium или EIEC (108 КОЕ/мл) в течение 2 часов, а затем добавляли лактобактерии (108 КОЕ/мл) и дополнительно инкубировали в течение 2 часов. По истечении этого времени инфицированные монослои тщательно промывали PBS, затем лизировали раствором 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре. температура для подсчета интернализованных бактерий. Аликвоты клеточных лизатов серийно разводили, высевали на агар Hektoen (OXOID) и инкубировали при 37 ◦C в течение ночи для количественного определения общего числа жизнеспособных клеточно-ассоциированных бактерий (КОЕ/мл). Для анализа инвазивности после инкубации с бактериями инфицированные монослои тщательно промывали стерильным PBS и дополнительно инкубировали в течение дополнительных 2 часов в среде DMEM с добавлением гентамицинсульфата (250 мкг/мл) (Sigma-Aldrich) для уничтожения внеклеточных бактерий. затем клетки лизировали и высевали на чашки, как описано ранее, для количественного определения общего количества интернализованных бактерий (КОЕ/мл).

2.7. Статистический анализ

Значительные различия между группами оценивались с помощью двуфакторного дисперсионного анализа с использованием GraphPad Prism 8.0, а сравнение средних значений рассчитывалось с использованием t-критерия Стьюдента. Данные выражены как средние значения ± стандартное отклонение (SD) трех независимых экспериментов.

Натуральное растительное лекарственное средство для облегчения запоров — цистанхе

Цистанхе — род паразитических растений, принадлежащий к семейству Оробанховые. Эти растения известны своими лечебными свойствами и на протяжении веков использовались в традиционной китайской медицине (ТКМ). Виды цистанхе преимущественно встречаются в засушливых и пустынных регионах Китая, Монголии и других частях Центральной Азии. Растения цистанхе характеризуются мясистыми желтоватыми стеблями и высоко ценятся за свою потенциальную пользу для здоровья. В традиционной китайской медицине считается, что цистанхе обладает тонизирующими свойствами и обычно используется для питания почек, повышения жизненной энергии и поддержки сексуальной функции. Он также используется для решения проблем, связанных со старением, усталостью и общим самочувствием. Хотя Цистанхе имеет долгую историю использования в традиционной медицине, научные исследования его эффективности и безопасности продолжаются и ограничены. Однако известно, что он содержит различные биологически активные соединения, такие как фенилэтаноидные гликозиды, иридоиды, лигнаны и полисахариды, которые могут способствовать его лечебным эффектам.

Wecistanche'sпорошок цистанхе, таблетки цистанхе, капсулы цистанхеи другие продукты разрабатываются с использованиемпустыняцистанхев качестве сырья, все из которых хорошо влияют на облегчение запоров. Конкретный механизм таков: считается, что цистанхе обладает потенциальным преимуществом в облегчении запоров на основе его традиционного использования и определенных соединений, которые он содержит. Хотя научные исследования, посвященные влиянию цистанхе на запоры, ограничены, считается, что у нее есть несколько механизмов, которые могут способствовать ее способности облегчать запоры. Слабительный эффект:Цистанхеиздавна используется в традиционной китайской медицине как средство от запоров. Считается, что он обладает мягким слабительным эффектом, который может способствовать опорожнению кишечника и вызывать запоры. Этот эффект можно объяснить различными соединениями, обнаруженными в цистанхе, такими как фенилэтаноидные гликозиды и полисахариды. Увлажнение кишечника. При традиционном использовании считается, что цистанхе обладает увлажняющими свойствами, особенно воздействуя на кишечник. Содействие гидратации и смазке кишечника может помочь смягчить инструменты и облегчить его прохождение, тем самым облегчая запор. Противовоспалительный эффект: иногда запор может быть связан с воспалением пищеварительного тракта. Цистанхе содержит определенные соединения, в том числе фенилэтаноидные гликозиды и лигнаны, которые, как полагают, обладают противовоспалительными свойствами. Уменьшая воспаление в кишечнике, он может помочь улучшить регулярность дефекации и облегчить запоры.