Инактивация RPX1 у арабидопсиса обеспечивает устойчивость к Plutella Xylostella за счет накопления гомотерпена DMNT

Абстрактный

Чешуекрылый вредитель сельскохозяйственных культур Plutella xylostella серьезно ограничивает выращивание Brassica. Здесь мы сообщаем о новой роли RPX1 (устойчивости к P. xylostella) в устойчивости к этому вредителю у Arabidopsis thaliana. Мутант rpx1-1 отталкивает личинок P. xylostella, а питание мутанта rpx1-1 серьезно повреждает структуру перитрофического матрикса в средней кишке личинок, тем самым отрицательно влияя на рост личинок и окукливание. Эта резистентность возникает в результате накопления защитных соединений, в том числе монотерпена (3E)-4,8-диметил-1,3,7-нонатриена (DMNT), вследствие активации ПЕНТАЦИКЛИЧНОЙ ТРИТЕРПЕНСИНТАЗЫ 1 (PEN1), которая кодирует ключевой фермент биосинтеза DMNT. Заражение и ранение P. xylostella вызывают деградацию белка RPX1, что может обеспечить быстрый ответ на заражение насекомыми. Инактивация RPX1 и сверхэкспрессия PEN1 не связаны с негативными последствиями для роста растений, но дают гораздо более высокую продуктивность семян, чем дикий тип, в присутствии заражения P. xylostella. Это исследование предлагает новую стратегию молекулярной селекции растений против P. xylostella.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

  КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

устойчивость к вредителям, вторичный метаболизм, летучие выбросы

1|ВВЕДЕНИЕ

Насекомые-вредители не только снижают урожайность, но и влияют на качество растениеводческой продукции (Johnson & Züst, 2018; Wu et al., 2016; Zhao et al., 2016). Среди них ромбовидная моль Plutella xylostella — широко распространенный и вредоносный вредитель из чешуекрылых, который питается крестоцветными культурами, такими как цветная капуста и капуста, вызывая огромные экономические потери. В настоящее время в управлении сельским хозяйством борьба с вредителями с использованием агрохимикатов (например, пестицидов) очень успешна и широко применяется, но этот подход становится проблематичным из-за потенциального загрязнения окружающей среды и угроз для здоровья человека (Shakeel et al., 2017). Альтернативным подходом к растениеводству является использование генно-инженерных культур с повышенной устойчивостью к вредителям, например, при экспрессии в плантах Bacillus thuringiensis (Jouzani et al., 2017) или других гетерологичных энтомотоксичных белков (Douglas, 2018). Были предприняты обширные усилия по выявлению новых подходов к борьбе с P. xylostella в сельском хозяйстве; однако эффективные гены, природные пестициды и устойчивая зародышевая плазма остаются ограниченными (Zhou & Jander, 2021). Благодаря постоянной гонке вооружений с насекомыми-вредителями растения развили различные способности для борьбы с атаками насекомых. Соответственно, в ответ на поражение вредителями. Жасмоновая кислота (JA), также называемая «раневым гормоном», играет центральную роль в различных реакциях на повреждения, связанные с ранами, инициируемых заражением насекомыми (Lortzing & Steppuhn, 2016). Все больше данных свидетельствует о том, что JA действует синергически и/или антагонистически с другими фитогормонами, такими как салициловая кислота (СК) и этилен (Costarelli et al., 2020; Ma et al., 2019). Помимо прямой защиты, растения, поврежденные атаками насекомых, выделяют различные летучие соединения, привлекающие естественных врагов травоядных (Гольс, 2014). Из этих сложных летучих смесей гомотерпеновые соединения (3E)-4,8-диметил-1,3,7-нонатриен (DMNT) и (E, E)-4,8,12-триметил-1,3,7, 11-тридекатетраен (TMTT) обнаружен во многих видах растений, таких как Arabidopsis (Lee et al., 2010; Sohrabi et al., 2015), рисе (Li et al., 2018), кукурузе (Gouinguené et al., 2005). ; Richter et al., 2016) и хлопка (Liu et al., 2018). Несколько исследований также показали, что DMNT действует как сигнальная молекула, которая индуцирует защиту от травоядных животных во время коммуникации между растениями (Arimura et al., 2000; Meents et al., 2019). Например, после повреждения жевательными насекомыми некоторые виды сладкого картофеля выделяют ДМНТ, что приводит к системной индукции растяжения ингибитора протеазы в соседних растениях сладкого картофеля и делает его неперевариваемым для насекомых (Meents et al., 2019). Аналогичные результаты наблюдались для чайных растений (Jing et al., 2020). Недавно мы обнаружили, что ДМНТ играет роль в уничтожении личинок P. xylostella, разрушая барьер перитрофического матрикса (ПМ) в средней кишке насекомых (Chen et al., 2021).

У высших растений пути биосинтеза DMNT и TMTT были хорошо охарактеризованы с помощью обратной генетики и биохимического анализа. В кукурузе DMNT и TMTT образуются в результате окислительной деградации (E)-неролидола и (E, E)-гераниллиналоола двумя монооксигеназами P450, CYP92C5 и CYP92C6 (Richter et al., 2016). У хлопка два гена CYP (GhCYP82L1 и GhCYP82L2) ответственны за превращение (E)-неролидола в DMNT и (E, E)-гераниллиналоола в TMTT (Liu et al., 2018). В корнях арабидопсиса DMNT катализируется предшественником тритерпендиола C30, каннабидиолом, монооксигеназой цитохрома P450, кодируемой корнеспецифичным геном CYP705A1 (Sohrabi et al., 2015). Исследование с использованием дрожжей в качестве модельного организма представило доказательства того, что каннабидиол продуцируется из 2,3-оксидосквалена с помощью каннабидиолсинтазы PEN1 (Xiang et al., 2006), и экспрессия которого синергически связана с CYP705A1 (Sohrabi et al., 2006). ., 2015). Тем не менее, регуляция ключевых генов биосинтеза DMNT остается в значительной степени неизвестной. Ген RPX1, описанный в этом исследовании, кодирует новый кэп-связывающий белок (CBP), который является членом семейства генов эукариотического фактора инициации 4E (eIF4E). У растений семейство eIF4E состоит из eIF4E1, eIF4E2, eIF(iso)4E и nCBP, которые играют важную роль в инициации кэп-зависимой трансляции мРНК (Rhoads, 2009). Члены семейства eIF4E являются основными источниками рецессивной устойчивости к картофельному вирусу Y (PVY) — наиболее вредоносному патогену, влияющему на урожайность и качество картофеля, а использование технологии CRISPR-Cas9, нацеленной на ген eIF4E1, расширяет спектр устойчивости картофельного вируса Y Solanum tuberosum. (Лучиоли и др., 2022). Аналогичным образом, CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование изоформ eIF4E маниоки nCBP-1 и nCBP-2 снижает тяжесть и частоту симптомов, вызванных болезнью коричневых полос маниоки (Gomez et al., 2019). Более того, исследования Arabidopsis показывают, что дефицит nCBP играет роль в ограничении межклеточного перемещения растительных вирусов (Keima et al., 2017). Тем не менее, о функции nCBP в защите травоядных не сообщалось. Здесь мы используем интегративный подход для функциональной характеристики гена RPX1 арабидопсиса, который играет важную роль в устойчивости растений к P. xylostella. Наши результаты показывают, что нокдаун RPX1 приводит к дифференциальной экспрессии генов (DEG) и накоплению соединений. Одним из генов с повышенным уровнем экспрессии является PEN1, который является ключевым для биосинтеза DMNT. Заражение мутантом rpx1 и накопление DMNT влияют на структуру ПМ P. xylostella и вызывают дефекты развития и гибель личинок. Дополнительные данные показывают, что заражение и повреждение P. xylostella вызывают деградацию белка RPX1, что, в свою очередь, может привести к устойчивости растений к насекомым.

2|МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1|Растительный материал и условия выращивания

Семена арабидопсиса были заказаны в Ноттингемском центре запасов арабидопсиса (NASC, http://Arabidopsis.info/). Семена подвергали поверхностной стерилизации, высевали на среду Мурасиге и Скуга (MS) и стратифицировали при 5 градусах в ростовой камере в условиях короткодневного фотопериода (8 часов света, 16 часов темноты) в течение 3 дней. Затем их перенесли в теплицу при температуре 22 градуса при длинном фотопериоде (16 часов света, 8 часов темноты) при нормальном уходе за растениями.

2.2|Эксперименты и биоанализы с выбором (предпочтением) и без выбора

Яйца P. xylostella были приобретены у компании Henan Jiyuan Baiyun Company (кат.: HJB004, выведены в 2009 г., размножены для научных исследований в контролируемой среде) и инкубированы в камере выращивания, установленной на температуру 26 градусов, 16 часов света/8 часов темноты. Для экспериментов по выбору мы перенесли 3-недельные растения Arabidopsis (восемь растений дикого типа и мутантных растений соответственно) в испытательные резервуары, которые были подключены к каждому концу стеклянной пробирки, а остальные экспериментальные этапы были выполнены, как описано ранее ( Чен и др., 2021). Использовали личинок четвертого возраста, и в каждую экспериментальную повторность включали 15 личинок.

В эксперименте без выбора 3-недельные растения дикого типа и мутантные растения переносили в отдельные полуоткрытые чашки Петри, содержащие одинаковое количество личинок P. xylostella 15-го возраста. Последующие шаги выполнялись, как описано ранее (Chen et al., 2021).

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

2.3|Скрининг устойчивых мутантов Arabidopsis к P. xylostella

Мы собрали 179 мутантов Arabidopsis по вставке Т-ДНК для скрининга устойчивости P. xylostalle. Мутантов выращивали на среде MS и трансплантировали в горшки P7 (размер: 7 × 7 см) в условиях длинного дня (22 градуса, 16 часов света/8 часов темноты). Чтобы избежать потенциального воздействия окружающей среды, мы ежедневно перемещали и меняли горшки. Для первоначального скрининга мутантов мы создали две повторности, выращивая каждого мутанта в двух горшках с растениями Col-0 в качестве контроля. Через 2 недели роста после трансплантации все мутанты были подвергнуты тесту на предпочтение личинок P. xylostella третьего возраста путем сравнения их с Col-0, как описано выше. Мутанты, которые показали отличные от Col-0 предпочтения личинок, рассматривались как устойчивые к кандидатам или чувствительные мутанты и были отобраны для дальнейшей экспериментальной проверки и функциональных исследований.

2,4|Плазмидная конструкция и трансформация генов

Для конструкции RPX1pro:RPX1 геномную кодирующую область RPX1 с восходящей последовательностью длиной 1,6 т.п.н. и нисходящей последовательностью длиной 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК, экстрагированной из Col-0. Собранный фрагмент ДНК клонировали в вектор pGreenII-0179 и трансформировали в мутант rpx1-1 с использованием метода цветочного погружения (Clough & Bent, 1998). Для конструирования RPX1pro: RPX1-GFP, промотор RPX1 (1,6 т.п.н.), кодирующая область и 3'-нетранслируемые последовательности длиной 1 т.п.н. были амплифицированы с помощью ПЦР из геномной ДНК Col-0. Фрагмент GFP амплифицировали из плазмиды, содержащей последовательности GFP. Эти фрагменты ДНК были собраны в вектор pGreenII-0179 с использованием метода разрезания и лигирования, а затем трансформированы в мутант rpx1-1. Для конструкции 35Spro: RPX1-FLAG последовательности, кодирующие RPX1, были амплифицированы с помощью ПЦР из кДНК, обратной транскрипции из мРНК Col-0. ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pCambia1300-FLAG с использованием метода инфузии (Clontech) и трансформировали в Col-0. 35Spro: PEN1, 35Spro: MRN1 (MARNERAL SYNTHASE 1) и 35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SYNTHASE 1): Кодирующие последовательности этих генов были амплифицированы с помощью ПЦР из кДНК Col-0 и лигированы в вектор pLGNL-35S. Искусственная микроРНК (amiR), нацеленная на PEN1, была создана, как описано ранее (Schwab et al., 2006), амплифицирована с использованием плазмиды pRS300 в качестве матрицы и лигирована в модифицированную версию вектора pCambia1300m. Все последовательности праймеров перечислены в вспомогательной информации: таблица S1.

2,5|Анализ активности глутатион-s-трансферазы (GST) и цитохрома P450 (CYP450) у личинок P. xylostella

После того, как личинок P. xylostella второго возраста кормили рассадой Col-0 или rpx1-1 в течение 72 часов, их собирали и измельчали ​​до тонкого порошка в жидком азоте. Анализы проводили с использованием наборов GST (Nanjing Jiancheng Biology Company, кат.: A004) и наборов для анализа активности CYP450 (Beijing Huabaitai Biology Company, кат.: P450) в соответствии с инструкциями производителя. Каждый анализ имел три биологических повтора, и каждый повтор содержал 30 личинок P. xylostella.

2,6|Смурф-анализы

Трехнедельные сеянцы Col-0 или rpx1-1 использовали для кормления личинок P. xylostella второго возраста. Анализ проводили, как описано ранее, с небольшими модификациями (Chen et al., 2021). Использовали шесть биологических повторов, каждый из которых содержал 15 личинок P. xylostella.

2,7|Микроскопическое наблюдение структуры ПМ личинок

Анатомический анализ структуры личиночных ПМ и парафиновый анализ поперечного сечения личиночного кишечника проводили, как описано ранее (Chen et al., 2021).

2,8|Анализ экспрессии генов и секвенирование транскриптома (RNA-seq)

Саженцы Col-{{0}} и rpx1-1 выращивали в условиях длинного дня (16 часов света, 8 часов темноты) при температуре 22 градуса. Двухнедельные проростки Col-0 и rpx1-1 использовали для секвенирования транскриптома. Каждый образец содержал три биологические повторности. Тотальную РНК экстрагировали с использованием набора RNAprep Pure Plant Kit (TIANGEN, каталожный номер: DP441). кДНК первой цепи синтезировали методом обратной транскрипции с использованием системы One-Step RT (Takara Bio) в соответствии с инструкциями производителя. qRT-PCR проводили с использованием ген-специфических праймеров, перечисленных в вспомогательной информации: Таблица S1, на приборе Roche Light Cycler 480. Конструирование и секвенирование библиотек RNA-seq проводили с использованием Biomarker (Пекин, Китай) на платформе Illumina HiSeq. Наконец, мы использовали EdgeR для проведения анализа дифференциальной экспрессии (был установлен порог значимой разницы:|log2foldchange|Больше или равно 1, p <0,05). Три биологических повтора были выполнены для Col-0 и rpx1-1, а дифференциально экспрессируемые гены перечислены в наборе данных S1.

2,9|Экстракционный, газовый хроматографический и масс-спектрометрический (ГХ-МС) анализ ДМНТ и ДМНТ-2 H в Arabidopsis

Экстракцию и анализ DMNT проводили, как описано ранее, с небольшими модификациями (Sohrabi et al., 2015). В анализах для экстракции и измерения DMNT использовали 2 г 3-недельных сеянцев арабидопсиса.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.10|Получение и характеристика DMNT

DMNT был синтезирован, как описано ранее, с небольшими модификациями (HJ Huang & Yang, 2007). Вкратце, в круглодонную колбу емкостью 500 мл, снабженную магнитной мешалкой с тефлоновым покрытием, загружали 1 г (6,48 ммоль) аллилового спирта и 50 мл дихлорметана. Раствор энергично перемешивали и обрабатывали 3,6 г активного диоксида марганца с последующим добавлением 1–2 г окислителя каждые 2–3 ч до завершения реакции. Затем продукт использовали для получения желаемого соединения посредством реакции разума. Структура и чистота ДМНТ были подтверждены методами спектроскопии 1 H ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и 13 C ЯМР.

2.11|Лечение DMNT P. xylostella

Анализы проводили в чашках Петри, покрытых прозрачной пластиковой пленкой с множеством отверстий. ДМНТ разводили в парафиновом масле (Sigma-Aldrich) до желаемой дозировки (2,5 нмоль/л-25 мкмоль/л) и вводили в корм, как описано в тексте. Все анализы проводили в шести биологических повторах, каждый из которых состоял из 15 личинок. Рост личинок фиксировали фотодокументацией. В качестве контроля использовали корм, инъецированный тем же объемом парафинового растворителя.

2.12|Измерение содержания ЖК и СК в проростках арабидопсиса

Анализы были проведены компанией Nanjing Convinced-test Technology Company. Двухнедельные сеянцы Col-{{0}} и rpx1-1 были заражены личинками P. xylostella 15-го возраста, с незараженными сеянцами в качестве контроля. Мы поместили по две личинки на каждое растение зараженной группы, чтобы гарантировать заражение всех растений. Через 24 ч образцы растений собирали и быстро замораживали в жидком азоте для определения ЖА и СК. Образцы измельчали ​​до тонкого порошка в жидком азоте и экстрагировали экстракционным раствором изопропанол-вода-соляная кислота с последующим добавлением 8 мкл дейтерированной салициловой кислоты (D-SA) и дигидрожасмоновой кислоты (2HJA) (1 мкг /мл каждый) в качестве внутренних стандартов. Затем добавляли дихлорметан и раствор хорошо перемешивали на ротаторе в течение 30 мин. После получения нижней органической фазы центрифугированием при 13,{{1{{20}}}} об/мин в течение 5 мин ее продували азотом, повторно растворяли в метаноле (0 0,1% муравьиной кислоты), а затем центрифугировали при 13,000 g в течение 10 мин. Наконец, супернатант фильтровали через органическую фильтрующую мембрану с размером пор 0,22 мкм и анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС). Все этапы экстракции выполнялись при 4 градусах. Идентичность JA и SA определяли на основе времени пика целевых веществ и отношения массы к заряду (m/z) соответствующих ионов. Количественное определение JA и SA было проведено с использованием уравнения линейной регрессии, полученного на основе внутренних стандартных кривых. Для получения внутренней стандартной кривой готовили стандартные растворы SA и JA с градиентами 0,1, 0,2, 0,5, 2, 5, 20, 50 и 200 нг/мл, используя метанол (0,1% муравьиную кислоту) в качестве растворителя. и к реальному графику добавляли растворы внутреннего стандарта с конечной концентрацией 20 нг/мл. Из уравнений стандартных кривых были удалены аномалии линейности. JA: y=0.853 x + 0.00152 (r=0.9958); SA: y=1.76 x + 0.0403 (r=0.9936).

2.13|Анализ транспорта ДМНТ у Arabidopsis

ДМНТ растворяли в ДМСО и добавляли в среду MS без глюкозы. Трехнедельные растения Arabidopsis переносили в пробирки, а их корни погружали в среду MS с ДМНТ или ДМСО (контроль). Для предотвращения контаминации пробирки накрывали двумя слоями парафильма, в пленке делали небольшое отверстие, через которое корни растений помещали в среду МС для дальнейшего роста. Через 24 ч корни обработанных растений удаляли, а их листья использовали в качестве корма для P. xylostella, а затем анализировали выживаемость личинок и скорость окукливания. Тот же эксперимент был повторен с питательной средой, содержащей либо 2 H-меченный DMNT, либо DMSO в качестве контроля. После 24 часов инкубации листья собирали и обрабатывали для анализа ГХ-МС. Чтобы исключить возможность того, что ДМНТ может улетучиваться из среды ДМНТ в надземные части и вызывать следовое загрязнение, контрольную группу создавали таким же образом, но корни растений закапывали влажной ватой и не погружали в среду ДМНТ. Через 24 часа надземные части собирали для дальнейшего биоанализа или обнаружения DMNT с помощью ГХ-МС.

Преимущества цистанхе трубчатой-укрепить иммунную систему

2.14|Экстракция белка и иммуноблоттинг-анализ RPX1 у Arabidopsis после заражения P. xylostella и обработки ран

Мы разработали два типа обработки трансгенных RPX1pro: RPX1-GFP и 35Spro: RPX1-FLAG сеянцев арабидопсиса: заражение и ранение P. xylostella. При личиночной зараженности сеянцы арабидопсиса выращивали в течение 2 недель и скармливали им личинкам второго возраста (на каждый сеянец помещали не менее одной личинки), через 15-120 мин личинки удаляли, зараженные сеянцы отбирали и собирали для дальнейшего использования. дальнейшие эксперименты. Чтобы имитировать ранение, мы использовали иглу шприца объемом 1 мл, чтобы создать отверстие в каждом листе арабидопсиса. Через 15–120 мин роста проростки собирали.

Чтобы определить, могут ли растения, зараженные P. xylostella, вызывать деградацию RPX1, мы заразили проростки Col-0 P. xylostella на 15-120 минут и проверили его влияние на RPX1-GFP на трансгенных растениях. Все образцы измельчали ​​в порошок в жидком азоте, а затем равные количества зараженных и неинфицированных Col-0 отдельно смешивали с таким же количеством тканей RPX1-GFP и инкубировали в растворе при 4 градусах в течение 15 мин. Наконец, смесь центрифугировали и надосадочную жидкость подвергали иммуноблоттингу. Для вестерн-блот-анализа общие белки экстрагировали буфером для экстракции белков [50 ммоль/л Трис-HCl, pH 8,0, 2,5 ммоль/л ЭДТА, pH 8,0, 150 ммоль/л NaCl, 1/1000 IGPAL ( об./об.), 10% глицерина (об./об.), 7% 2-меркаптоэтанола (об./об.), 1 ммоль/л PMSF и 1× коктейль ингибиторов протеиназ (Roche)]. Затем белковый экстракт использовали для разделения PAGE и иммуноблоттинга с антителами против GFP (Roche, разведение: 1/1000) и FLAG (Abcam, разведение: 1/2000). Изображения были получены с использованием системы хемилюминесцентного анализа Tanon 5200.

3|ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1|Мутант Arabidopsis rpx1 обладает улучшенной устойчивостью к P. xylostella.

Чтобы идентифицировать гены, участвующие в устойчивости P. xylostella, мы собрали 179 мутантов Arabidopsis и вырастили их в контролируемой теплице. Через две недели после трансплантации мы провели тест на предпочтение личинок P. xylostella третьего возраста в ответ на каждый мутант и Col-0 дикого типа. В этом скрининговом эксперименте 15 мутантов показали различное влияние на предпочтения личинок (данные не показаны), и один из них был выбран для этого исследования и обозначен как rpx1-1 (устойчивость к P. xylostella). RPX1 кодирует новый кэп-связывающий белок (nCBP) (Ruud et al., 1998). Мутантом по вставке Т-ДНК был SALK_131503, а экспрессия гена RPX1 была значительно снижена по сравнению с Col-0 дикого типа (рис. 1a, вспомогательная информация: рисунок S1a, вспомогательная информация: таблица). С1). При посадке рядом растения rpx1-1 показали значительно меньший уровень повреждения личинками P.xylostella по сравнению с растениями дикого типа (вспомогательная информация: рисунок S1b).

РИСУНОК 1. Инактивация RPX1 придает арабидопсису устойчивость к Plutella xylostella. (а) Генная структура RPX1 (At5g18110). Оранжевые прямоугольники обозначают экзоны, а сплошные линии представляют интроны и нетранслируемые области. Вставка Т-ДНК в SALK_131503, названная rpx1-1, находится в четвертом экзоне. (b) Личинки P. xylostella преимущественно движутся в сторону линий комплементации Col-0 и RPX1 дикого типа (RPX1pro:RPX1/rpx1-1, RPX1com), по сравнению с rpx1-1. (c) Сравнение Col- Листья 0, rpx1-1 и RPX1com, зараженные P. xylostella. (d) Личинки P. xylostella были сильно поражены rpx1-1 по сравнению с личинками дикого типа Col-0 и линиями RPX1com, что касается роста, размера и цвета личинок. (e, f) Личинки P. xylostella, получавшие rpx1-1, демонстрируют более высокую смертность (e) и более низкие показатели окукливания (f) по сравнению с линиями Col-0 и RPX1com дикого типа. (g, h) Личинки P. xylostella, которых кормили растениями rpx1-1, имели повышенную активность глутатион-S-трансферазы (GST, g) и цитохрома P450 (CYP450, h), тогда как у личинок, получавших ком-корм RPX1, активность не отличалась от активности на столбце 0. В (b, e–h) данные представлены как среднее значение ± sem. Разные буквы при каждом лечении указывают на значительную разницу (односторонний дисперсионный анализ, n=3 для b, g, h, n {{ 36}} для д, е).

Чтобы определить механизм, лежащий в основе устойчивости rpx1-1 к заражению P. xylostella, мы провели тесты предпочтения и отсутствия выбора. В опытах по предпочтению личинки P. xylostella помещали в центр стеклянной пробирки на равном расстоянии от проростков Col-0 и rpx1-1, через 10–6{{11} } мин, на стороне Col-0 собралось значительно больше личинок, чем на стороне rpx1-1 (рис. 1b). В экспериментах без выбора мы кормили проростки Col-0 и rpx1-1 отдельно личинкам P. xylostella и наблюдали, что Col-0 потерял больше тканей листа, чем мутант rpx1-1 (рис. 1c). Чтобы подтвердить, что RPX1 был геном, вызывающим наблюдаемую устойчивость, мы ввели комплементарную конструкцию RPX1 в мутант rpx1-1. Эти линии комплементации RPX1 (RPX1pro: RPX1/rpx1-1, RPX1com) были восприимчивы к заражению P. xylostella, что было определено с помощью тестов предпочтения и отсутствия выбора (рис. 1b,c), что позволяет предположить, что RPX1 участвует в устойчивости Arabidopsis к П. ксилостелла.

3.2|Мутация rpx1-1 отрицательно влияет на рост личинок P. xylostella.

Чтобы исследовать физиологический ответ P. xylostella на питание мутантами rpx1-1, мы исследовали развитие личинок после кормления 3-недельными растениями линий Col-0, rpx1-1 и RPX1com. Личинки, которых кормили растениями rpx1-1, показали серьезное нарушение развития с точки зрения размера тела. Цвет тела личинок также отличался от цвета тела личинок, питавшихся растениями Col-0. Однако мы не наблюдали таких изменений у личинок, которых кормили проростками RPX1com (рис. 1d). Дальнейший фенотипический анализ показал, что личинки P. xylostella, которых кормили rpx1-1, имели заметно более высокую смертность и более низкие показатели окукливания, чем те, которых кормили Col-0 или RPX1com (рис. 1e,f). Кроме того, личинки, получавшие rpx1-1, демонстрировали более высокую ферментативную активность GST и CYP450, которые являются биомаркерами повреждения органов или тканей (Cheng et al., 2018; Mikstacki et al., 2015), чем личинки на Col-0 и RPX1com (рис. 1g,h), что указывает на то, что личиночная ткань может быть повреждена при питании rpx1-1.

3.3|Средняя кишка личинок P. xylostella повреждается после питания растениями rpx1-1.

Мы заметили, что личинки, получавшие rpx1-1, потребляли меньше растительных тканей и производили гораздо меньше фекалий, чем личинки, которых кормили Col-0 дикого типа; поэтому мы предположили, что пищеварение личинок, питающихся rpx1-1, может быть нарушено. Чтобы проверить, произошла ли утечка в кишечнике личинок, которых кормили rpx1-1, мы провели «тест Смурфа». Личинки, которых кормили линиями Col-0 и RPX1com дикого типа, испражнялись красителем, и краситель визуально не оставался в теле личинок, тогда как личинки, получавшие rpx1-1, сохраняли значительное количество красителя в средняя кишка и окружающие ткани, личинки стали синими (рис. 2а). Количественный анализ голубых («Смурф») и нормальных («без Смурфа») личинок показал, что кормление растениями rpx1-1 приводило к более чем трехкратному увеличению количества особей, демонстрирующих «Смурф», по сравнению с теми, которых кормили Col‐{{ дикого типа. 14}} или RPX1com (рис. 2б). Эти результаты позволяют предположить, что кормление rpx1-1 может вызывать повреждения и повышенную проницаемость средней кишки личинок.

3,4|Перитрофический матрикс P. xylostella повреждается при подкормке проростков rpx1-1.

Далее мы препарировали и выделили перитрофический матрикс (ПМ) из личинок, которых кормили проростками Col-{{0}}, rpx1-1 и RPX1com, для структурного анализа под стереомикроскопом. По сравнению с неповрежденными и отвесными ПМ личинок, получавших Col-0 и RPX1com, личинки, получавшие rpx1-1, демонстрировали характеристики повреждения и были тонкими, рыхлыми и прерывистыми (рис. 2c-f). Для дальнейшего подтверждения характеристик повреждения ПМ были получены поперечные срезы личинок. Результаты окрашивания гематоксилин-эозином (HE) показали, что ПМ личинок, получавших Col-0, были толстыми и неповрежденными, а между ПМ и эпидермальными клетками средней кишки существовало эктоперитрофическое пространство (ES) (рис. 2g). Напротив, ПМ в средней кишке личинок, получавших rpx1-1, была сильно нарушена, и содержимое кишечника находилось близко к стенке кишечника (нет, рисунок 2h). Когда личинок кормили проростками RPX1com, их PM и ES существенно не менялись (рис. 2i,j). Эти результаты подтверждают, что нокдаун RPX1 повреждает ПМ личинок P. xylostella.

3,5|Накопление содержания DMNT в rpx1-1 обеспечивает устойчивость к личинкам P. xylostella.

Чтобы выяснить, изменяет ли нокдаун RPX1 метаболиты Arabidopsis и приводит ли к устойчивости к личинкам P. xylostella, мы сравнили летучие органические соединения (ЛОС), высвобождаемые из растений rpx1-1 и Col-0 дикого типа. Четыре ЛОС (гексанол, 3-этил-5-метил, октан, 2,6-диметил, нонан, 2,6-диметил и DMNT) дифференциально накапливались между rpx1-1 и Col-0 (рис. 3а). Для дальнейшего анализа молекулярного механизма rpx1-1 в устойчивости P. xylostella мы провели анализ RNA-seq. По сравнению с Col-0, мутант rpx1-1 демонстрировал 211 дифференциально экспрессируемых генов (DEG) (вспомогательная информация: набор данных S1). Анализ обогащения KEGG показал, что эти DEG принадлежали более чем к 20 различным метаболическим путям, включая биосинтез сесквитерпеноидов и тритерпеноидов, метаболизм альфа-линоленовой кислоты и пути метаболизма тирозина (рис. 3b, вспомогательная информация: таблица S2). Примечательно, что наиболее значительно обогащенным путем был биосинтез сесквитерпеноидов и тритерпеноидов, который состоял из трех ДЭГ: At4g15340, At5g42600 и At5g48010 (рис. 3b, вспомогательная информация: рис. S2a–c). Сообщается, что At4g15340 кодирует PEN1, оксидоскваленциклазу, которая превращает 2,3-оксидосквален в арабидиол и приводит к синтезу биоактивного DMNT посредством CYP705A1 (Field & Osbourn, 2008; Sohrabi et al., 2015). At5g42600 кодирует минеральную синтазу 1 (MRN1), которая является ключевым компонентом биосинтеза минералов. At5g48010 кодирует талианолсинтазу (THAS), фермент, участвующий в биосинтезе талианола. Сообщается, что марнерал и талианол участвуют в поддержании развития растений (Field & Osbourn, 2008; Go et al., 2012) (вспомогательная информация: рисунок S3). Мы изучили потенциальную роль MRN1 и THAS в устойчивости насекомых, исследуя предпочтения, смертность и скорость окукливания P. xylostella, скармливая им трансгенные проростки Arabidopsis, сверхэкспрессирующие MRN1 (35Spro: MRN1) и THAS (35Spro: THAS) (поддерживающий Информация: Рисунок S4a,b). Между двумя трансгенами и Col-0 дикого типа не было обнаружено существенных различий (вспомогательная информация: рисунок S4c-n), что позволяет предположить, что устойчивость rpx1-1 к насекомым, скорее всего, не зависит от этих двух генов.

РИСУНОК 2. Инактивация RPX1 повреждает структуру перитрофического матрикса (PM) в средней кишке личинки. (а) Репрезентативные изображения личинок, питавшихся линиями Col-0, rpx1-1 и RPX1com, демонстрирующие удержание красителя, о чем свидетельствует их синий цвет, как у мультяшного персонажа Смурфа. (б) Количественная оценка результатов показана в (а). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка; разные буквы указывают на значительную разницу (односторонний дисперсионный анализ, n=6). (c–f) Ультраструктура ПМ личинок, питавшихся линиями Col-0 (c), rpx1-1 (d) и RPX1com (e, f). Обратите внимание, что ПМ личинок, получающих Col-0 и RPX1com, плотный и неповрежденный, но ПМ личинок, получающих rpx1-1, тонкий, нежный и прерывистый в некоторых регионах. (g-j) Поперечный срез и окрашивание гематоксилин-эозином показывают повреждение ПМ личинок, питавшихся линиями Col-0 (g), rpx1-1 (h) или RPX1com (i, j). [Цветной рисунок можно посмотреть на сайте wileyonlinelibrary.com]

Обогащение биосинтеза терпеноидов в анализе KEGG (рис. 3b) и дифференциальное накопление DMNT, обнаруженное в rpx1-1 (рис. 3a), позволяют предположить, что DMNT может быть одним из соединений, участвующих в устойчивости растений к P. xylostella. Подобно предыдущим отчетам, в которых ДМНТ едва был обнаружен с помощью анализа ГХ-МС в Кол-0 (Лю и др., 2018; Сохраби и др., 2015), мы смогли обнаружить следовые количества DMNT в незараженных Col-0 (рис. 4a,b). Напротив, уровни DMNT были высоко обогащены (~ 8 нг/г) в rpx1-1, а линии RPX1com показали очень низкие уровни DMNT, аналогичные уровням в растениях Col-0 (рис. 4). Кроме того, при заражении P. xylostella уровни DMNT увеличивались (~20 нг/г) в rpx1-1, что было выше, чем в линиях Col-0 и RPX1com (рис. 4). . Мы синтезировали ДМНТ in vitro, используя модифицированный метод (Chen et al., 2021). В соответствии с предыдущими наблюдениями (Chen et al., 2021), DMNT подавлял рост P. xylostella, о чем свидетельствуют предпочтения (2,5 мкмоль/л) и эффективность отсутствия выбора (0,25–25 мкмоль/л) ( Вспомогательная информация: рисунок S5a,b). Более того, результаты окрашивания HE показали, что ПМ контрольных личинок были толстыми и неповрежденными (Подтверждающая информация: рисунок S5c), тогда как ПМ ​​личинок, обработанных DMNT в концентрации 2,5 мкмоль/л в течение 48 часов, были тонкими и прерывистыми в некоторых областях (Подтверждающая информация: Рисунок S5d). В совокупности наши результаты показывают, что мутация rpx1-1 вызывает накопление DMNT, что способствует уничтожению личинок P. xylostella у Arabidopsis. JA и SA — это вторичные метаболиты растений, тесно связанные с биотическим стрессом. Чтобы определить, способствуют ли эти вещества устойчивости rpx1-1 к насекомым, мы проверили уровни JA и SA Col-0 и rpx1-1 до и после заражения P. xylostella. В необработанных условиях не было значительной разницы в уровнях JA и SA между растениями rpx1-1 и Col-0 (вспомогательная информация: рисунок S6), а уровни обоих гормонов значительно увеличились через 24 часа после заражения P. xylostella. . Примечательно, что после заражения содержание SA было значительно ниже в rpx1-1 по сравнению с Col-0, тогда как содержание JA было намного выше в rpx1-1, чем в Col-0 (вспомогательная информация: рисунок S6).

РИСУНОК 3. Сравнение летучих соединений и экспрессии генов, дифференциально обогащенных между Col-0 и rpx1-1. (а) Дифференциально обогащенные летучие соединения в Col-0 и rpx1-1 были обнаружены методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка; звездочки указывают на значительную разницу (*p < 0.05, **p < 0.01, двусторонний непарный t-критерий). (б) Транскриптомный анализ Col-0 и rpx1-1. KEGG-анализ обогащения путей от по-разному экспрессируемых генов между Col-0 и мутантом rpx1-1. Один обогащенный путь (красная стрелка) связан с биосинтезом сесквитерпеноидов и тритерпеноидов и состоит из трех генов, как показано на рисунке. [Цветной рисунок можно посмотреть на сайте wileyonlinelibrary.com]

3,6|RPX1 регулирует накопление DMNT в зависимости от PEN1

Чтобы исследовать вклад PEN1 в накопление DMNT, регулируемое rpx1-1, мы создали конструкцию, содержащую искусственную микроРНК (PEN1amiR), и трансформировали ее в мутанты rpx1-1. Мы также создали конструкцию сверхэкспрессии PEN1, которая была преобразована в Col-0 (35pro: PEN1/Col-{{10}}). Анализ экспрессии генов показал, что PEN1 был подавлен (в 4-7 раз) в PEN1amiR/rpx1-1 по сравнению с rpx1-1 и сверхэкспрессирован (~2,5 раза) в 35Spro: PEN1 по сравнению с Col-0 (Рисунок 5а). В этих трансгенных линиях на экспрессию RPX1 не влияли нокдаун или сверхэкспрессия PEN1 (рис. 5b). При заражении P. xylostella в течение 6–24 часов экспрессия PEN1 значительно повышалась в Col-0 и rpx1-1, а гораздо более высокая экспрессия PEN1 была достигнута в rpx1-1 после 24 часов заражения (рис. 5c). . Затем мы измерили содержание DMNT в Col-0, rpx1-1, PEN1amiR/rpx1-1 и 35Spro: PEN1/Col-{{50}}. Без заражения P. xylostella rpx1-1 продуцировал более высокие уровни DMNT, чем Col-0 (рис. 5d,e,f,k,l), а когда PEN1 был подавлен искусственной микроРНК в rpx1-1 (PEN1amiR /rpx1-1), уровни DMNT были снижены, демонстрируя гораздо более низкий уровень, чем у rpx1-1 (рис. 5d,g,h,m,n). При заражении личинками уровни DMNT в проростках Col-0 и rpx1-1 значительно повышались, но в проростках PEN1amiR/rpx1-1 уровень DMNT не мог быть индуцирован и был намного ниже, чем у проростков rpx1-1 (рис. 5d, g,h,m,n), что позволяет предположить, что PEN1 может играть важную роль в биосинтезе DMNT, регулируемом RPX1, как показано в вспомогательной информации: рисунок S3. В соответствии с этим, DMNT был в высокой степени накоплен в проростках 35Spro: PEN1/Col-0 (рис. 5d, i,j,o,p).

РИСУНОК 4. Потеря RPX1 увеличивает накопление диметил-1,3,7-нонатриена (DMNT). (а) газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС) анализ DMNT в линиях Col-0, rpx1-1 и RPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1-1). Стандарт DMNT показан внизу. (б) Полная ионная хроматография (TIC) DMNT, захваченного из Col-0, rpx1-1 и RPX1com. (c) Содержание DMNT увеличивается у мутанта rpx1-1, но возвращается к уровням дикого типа в трансгенных растениях RPX1com. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка; разные буквы указывают на значительную разницу (односторонний дисперсионный анализ, n=3). [Цветной рисунок можно посмотреть на сайте wileyonlinelibrary.com]

3,7|PEN1 способствует уничтожению P. xylostella в rpx1-1.

Учитывая наблюдение, что нокдаун PEN1 может ослабить накопление DMNT, вызванное инактивацией RPX1 (рис. 5), мы провели биоанализы на нокдаун PEN1 и сверхэкспрессию трансгенного арабидопсиса, чтобы продемонстрировать его биологическую роль. Мы обнаружили, что личинки P. xylostella не отдавали предпочтения растениям amiR-PEN1/rpx1-1 по сравнению с Col-0 (вспомогательная информация: рисунок S7). Между тем, личинки P. xylostella, которых кормили PEN1-amiR/rpx1-1, показали значительно более низкую смертность и более высокие показатели окукливания, чем rpx1-1, тогда как личинки, которых кормили 35Spro: PEN1/Col-0, показали более высокую смертность и более низкое окукливание. ставки, чем у тех, кто получал Col-0 (рис. 6a,b). В соответствии с этими результатами дальнейшие эксперименты по «тесту Смурфа» и транссекции показали, что у PEN1-amiR/rpx1-1 был нормальный и неповрежденный кишечник и ПМ по сравнению с личинками, которых кормили rpx1-1 (рис. 6c,d,g,h). а чрезмерная экспрессия PEN1 вызвала серьезное повреждение средней кишки и ПМ личинок P. xylostella (рис. 6c,d, i,j). Эти результаты позволяют предположить, что нокдаун PEN1 может подавлять негативное воздействие на рост личинок, вызванное инактивацией RPX1, тем самым играя важную роль в токсическом влиянии, индуцированном rpx1-1-, на личинки P. xylostella.

3,8|ДМНТ транспортируется от корней к надземной части арабидопсиса. 

Сообщается, что PEN1 в основном экспрессируется в корнях арабидопсиса (AC Huang et al., 2019; Sohrabi et al., 2015) (вспомогательная информация: рисунок S8a), что отличается от результатов, полученных надземными частями rpx1-1. токсичность для P. xylostella в зависимости от PEN1 (рис. 6). Поэтому мы сформулировали альтернативную гипотезу: растения синтезируют ДМНТ преимущественно в корнях и транспортируют его в надземную часть, где он способствует устойчивости к насекомым. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели два анализа транспорта DMNT. В первом анализе (рис. 7а) мы инкубировали корни 3-3-недельных сеянцев арабидопсиса в жидкой среде для роста растений, содержащей 2,5 мкмоль/л ДМНТ, используя ДМСО в качестве контроля. После культивирования в течение 24 часов мы вырезали листья Arabidopsis и предлагали их личинкам P. xylostella. По сравнению с контролем ДМСО, листья растений, обработанных ДМНТ, вызывали значительно более высокую смертность личинок и более низкую скорость окукливания, чем контроль (рис. 7b,c). Во втором эксперименте, направленном на дальнейшее независимое подтверждение транспорта DMNT, мы пометили DMNT 2 H и добавили DMNT-2 H в жидкую среду для выращивания растений. После 24 часов инкубации DMNT-2H был сильно обогащен листьями (рис. 7d-i). Чтобы исключить возможность того, что ДМНТ может улетучиваться из жидкой питательной среды в воздух и загрязнять надземные части растений, мы организовали параллельный контроль, который проводился так же, как на рисунке 7а, за исключением того, что корни арабидопсиса не погружали в жидкость. среда роста. Результаты показали, что DMNT-2 H не был обнаружен в надземных частях растений (вспомогательная информация: рисунок S8b,c). Таким образом, мы предполагаем, что ДМНТ перемещается из корней, где он вырабатывается, в листья арабидопсиса, где он вызывает гибель вредителей.

РИСУНОК 5 PEN1 играет важную роль в накоплении диметил-1,3,7-нонатриена (DMNT) в rpx1-1. (a) Анализ экспрессии PEN1 в Col-0, rpx1-1, нокдауне PEN1 на фоне rpx1-1 (PEN1-amiR/rpx1-1) и сверхэкспрессии PEN1 (35Spro:PEN1/Col-{{2{{) 22}}}}) строк. (б) Экспрессия RPX1 в Col-{{30}}, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 и 35Spro:PEN1/Col-0. (c) Экспрессия PEN1 индуцируется заражением Plutella xylostella в Col-0 и rpx1-1. (d) Сравнение накопления DMNT между Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 и 35Spro:PEN1/Col-0. (e-j) газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС) анализ летучих веществ, выделяемых из Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) и 35Spro: строки PEN1/ Col‐0 (i, j). (k – p) TIC DMNT, полученный из линий Col-0 (k), rpx1-1 (l), PEN1-amiR/rpx1-1 (m, n) и 35Spro: PEN1/Col-0 (o, p) , что соответствует данным в (e–j). На (a–d) данные представлены как среднее ± стандартная ошибка; разные буквы указывают на значительную разницу (односторонний дисперсионный анализ, n=3). [Цветной рисунок можно посмотреть на сайте wileyonlinelibrary.com]

3,9|RPX1 разрушается в результате заражения P. xylostella и обработки ран.

Мы показали, что экспрессия PEN1 была повышена у rpx1-1 и сеянцев Arabidopsis, зараженных личинками P. xylostella (рис. 5a, c), что повышает вероятность того, что RPX1 может также реагировать на заражение личинками. Чтобы подтвердить этот прогноз, мы исследовали потенциальную реакцию RPX1 на заражение P. xylostella. Анализ экспрессии генов показал, что RPX1 экспрессируется в различных тканях (вспомогательная информация: рисунок S9a), но не оказывает существенного ответа на заражение личинками в течение 6–24 часов (вспомогательная информация: рисунок S9b). Поэтому мы проверили уровни белка RPX1 в трансгенных растениях RPX1pro: RPX1-GFP путем проведения иммуноблоттинга. Результаты показали, что без заражения личинками RPX1-GFP был стабильным в течение 0-12{{40}} минут; напротив, после заражения личинками в течение 15 минут RPX1-GFP начал деградировать; через 120 минут уровень белка RPX1-GFP постоянно снижался примерно до 6% от начальной точки времени (рис. 8a, вспомогательная информация: рисунок S10a). В качестве контроля у сеянцев арабидопсиса, содержащих трансген GFP, GFP был относительно стабильным после заражения личинками (рис. 8b). Чтобы исключить возможное влияние метки GFP на стабильность RPX1, мы создали трансгенные растения RPX1 с меткой FLAG (35Spro: RPX1-FLAG) для проведения экспериментов по заражению личинками, которые показали последовательные результаты, что RPX1-FLAG также может разрушаться личинками. заражение, аналогично RPX1-GFP (рис. 8c). Заражение насекомыми часто приводит к повреждению растений, а физические повреждения могут частично имитировать процесс питания травоядных насекомых. Чтобы продемонстрировать, может ли ранение вызвать деградацию RPX1, мы использовали иглу для создания отверстий в листьях растений, чтобы имитировать ранение, и обнаружили, что RPX1-GFP деградировал после 30 минут обработки (рис. 8d, вспомогательная информация: рисунок S10b). Чтобы лучше понять причину деградации RPX1 при заражении P. xylostella, мы инкубировали ткани трансгенных растений RPX1-GFP вместе в растворе в течение 15 минут с тканями Col-0, зараженными P. xylostella, в течение 15–120 минут. или ткани Col-0 без заражения. Анализ иммуноблоттинга показал, что уровень RPX1-GFP в образцах, инкубированных с предварительно зараженным Col-0, был намного ниже, чем в образцах с неинфицированным Col-0 (рис. 8e), что позволяет предположить, что заражение P. xylostella индуцирует некоторые факторы или сигналы в Col-0. это может привести к деградации RPX1.

3.10|Мутация rpx1-1 дает преимущество в развитии и размножении растений.

Общей чертой защитных реакций, специфичных для травоядных, является компромисс между устойчивостью к вредителям и ростом и размножением растений (Li et al., 2018). Чтобы определить, подвержен ли генотип локуса RPX1 таким компромиссам, мы сравнили продукцию семян у мутантов Col-{{10}} и rpx1-1. В отсутствие заражения P. xylostella урожай семян с растения был одинаковым для обоих генотипов (вспомогательная информация: рисунок S11). Напротив, подвергание 3-недельных растений rpx1-1 и Col-0 заражению P. xylostella 15-й возрастной стадии всего в течение 72 часов снижало конечный выход семян Col-0 в три раза, тогда как урожайность семян в rpx1-1 существенно не изменилась. Более того, урожайность семян RPX1com была аналогична урожайности Col-0, но намного ниже, чем у rpx1-1, что позволяет предположить, что инактивация RPX1 дает преимущество в производстве семян при заражении личинками (вспомогательная информация: рисунок S11). Мы также оценили производство семян у 35Spro: трансгенного арабидопсиса PEN1 и заметили, что сверхэкспрессия PEN1 приводит к более высокому выходу семян как в зараженных личинками, так и в незараженных условиях (вспомогательная информация: рисунок S11). Эти результаты позволяют предположить, что мутация rpx1-1 и более высокая экспрессия PEN1 придают устойчивость к P. xylostella при отсутствии обычно связанного с этим компромисса в отношении роста, подчеркивая потенциал RPX1 и PEN1 в программах молекулярной селекции, направленных на улучшение урожайности сельскохозяйственных культур.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

4|ОБСУЖДЕНИЕ

Вредители резко снижают агрономическую урожайность и качество, что делает защиту растений приоритетной и долгосрочной целью для фермеров и селекционеров. В этом исследовании мы идентифицировали мутант rpx1-1 Arabidopsis, который показал высокую устойчивость к P. xylostella, важному чешуекрылому вредителю сельскохозяйственных культур. Наш анализ показал, что мутация rpx1-1 привела к повышению уровня транскрипта PEN1, накоплению DMNT и повышению устойчивости растений к вредителям. Мы также показали, что белок RPX1 может разрушаться в результате заражения личинками и обработки ран.

РИСУНОК 6. PEN1 способствует повышению устойчивости rpx1-1 к Plutella xylostella. (а, б) Трансген PEN1-amiR значительно снижает устойчивость rpx1-1 к заражению P. xylostella, тогда как 35Spro: PEN1 усиливает эффект устойчивости, о чем свидетельствуют показатели смертности (а) и окукливания (б) личинок P. xylostella. . (c) Репрезентативные изображения личинок, которых кормили Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 и 35Spro: проростки PEN1 демонстрируют сохранение красителя, о чем свидетельствует их синий цвет, как в мультфильме о Смурфе. характер. (d) Результаты количественного анализа изображений, показанных на (c). (e-j) Поперечный срез и окрашивание гематоксилин-эозином показывают повреждение ПМ личинок, получавших Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, з) и 35Spro: проростки PEN1 (и, к). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка; разные буквы при каждом лечении указывают на значительную разницу в (a, b, d) (односторонний дисперсионный анализ, n=6). [Цветной рисунок можно посмотреть на сайте wileyonlinelibrary.com]

В тестах без выбора мутант rpx1-1 продемонстрировал значительную устойчивость к заражению P. xylostella (рис. 1c). И наоборот, личинки P. xylostella, которых кормили растениями rpx1-1, демонстрировали серьезные негативные нарушения развития (рис. 1d,e). Эти фенотипы объясняются инактивацией RPX1, поскольку линии комплементации RPX1 (RPX1com) так же восприимчивы, как и Col-0 дикого типа (рис. 1c-e), что подтверждает вывод о том, что RPX1 участвует в устойчивости к вредителям. Помимо уничтожения личинок, мутант rpx1-1 также оказывал долгосрочное воздействие на развитие личинок, включая окукливание (рис. 1f), что приводило к снижению воспроизводства вредителя.

РИСУНОК 7. Диметил-1,3,7-нонатриен (DMNT) транспортируется из корней арабидопсиса в листья. ( а ) Иллюстрация анализа транспорта DMNT с использованием проростков арабидопсиса. ДМНТ растворяли в жидкой среде Мурасиге и Скуга. После 24-часового культивирования корни вырезали, а листья использовали для кормления личинок Plutella xylostella для оценки смертности и скорости окукливания. (б, в) ДМНТ, транспортируемый из корней в листья, приводит к более высокой смертности (б) и снижению скорости окукливания (в) личинок P. xylostella. (d–f) 2 H-меченый DMNT (DMNT- 2 H) транспортируется от корня к листьям. DMNT-2H растворяли в жидкой среде МС, как указано в (а), в течение 24 часов, а затем собирали листья для анализа ГХ-МС (д). ДМСО использовали в качестве контроля (d). Стандарт DMNT‐2H показан для справки (f). (g-i) TIC DMNT-2H, полученный в ходе транспортных анализов, показанных на (d-f). Данные представлены как среднее значение ± sem, в (b, c) n=6 значения p показаны рядом со столбцами гистограммы, чтобы указать на значительную разницу (двусторонний непарный t-критерий). Обратите внимание, что дополнительные элементы управления для анализа транспорта включены в вспомогательную информацию: рисунок S8. [Цветной рисунок можно посмотреть на сайте wileyonlinelibrary.com]

Более того, тесты предпочтений показали, что мутанты Col-{{0}} и rpx1-1 дикого типа могут выделять разные летучие соединения; один из них — DMNT, который эффективен в отпугивании вредителей (рис. 1b, 3a, вспомогательная информация: рисунок S5a). На основании приведенных выше результатов мы предполагаем, что накопление ДМНТ в rpx1-1 является одной из причин отравления насекомыми. Сообщалось, что сигнальные пути JA и SA участвуют в устойчивости к насекомым (Costarelli et al., 2020; Lortzing & Steppuhn, 2016). В этом исследовании после 24 часов кормления насекомыми содержание JA и SA у мутантов Col-0 и rpx1-1 увеличивалось, при этом увеличение содержания SA у rpx1-1 было значительно ниже, чем у Col-0, тогда как увеличение содержания JA было намного выше (вспомогательная информация: рисунок S6), что позволяет предположить, что JA и SA также могут играть важную роль в устойчивости rpx1-1 к P. xylostella. Таким образом, мы предполагаем, что как прямые, так и косвенные эффекты rpx1-1 способствуют повышению устойчивости Arabidopsis к насекомым.

РИСУНОК 8. Деградация белка RPX1 индуцируется заражением Plutella xylostella и обработкой ран. (а) RPX1-GFP из RPX1pro: трансгенные растения RPX1-GFP разлагаются при заражении P. xylostella в течение 15-120 мин. (b) В качестве контроля для (a) сам GFP из 35Spro: трансгенные растения GFP не демонстрируют деградации при заражении личинками. (c) Флаг RPX1 из 35Spro: Трансгенные растения с флагом RPX1 разрушаются при заражении личинками. (d) RPX1-GFP из RPX1pro: трансгенные растения RPX1-GFP разрушаются в течение 15–120 минут обработки ран. (e) RPX1-GFP из RPX1pro: Трансгенные растения RPX1-GFP разрушаются, когда ткани инкубируются в растворе с тканями растений Col-0, зараженных P. xylostella, в течение 15–120 минут. Значения под полосами иммуноблоттинга показывают относительное содержание белка, определенное количественно с помощью ImageJ. Все эти эксперименты были повторены не менее трех раз, и показаны репрезентативные результаты. Дополнительные экспериментальные данные с независимыми трансгенными линиями показаны в вспомогательной информации: рисунок S10. [Цветной рисунок можно посмотреть на сайте wileyonlinelibrary.com]

Мы представляем несколько линий доказательств, демонстрирующих, как накопление DMNT, опосредованное PEN{{0}}, способствует функциям RPX1 в устойчивости растений к P. xylostella. PEN1, ключевой ген, принадлежащий к пути биосинтеза сесквитерпеноидов и тритерпеноидов, был идентифицирован в результате анализа KEGG данных РНК-seq от мутанта rpx1-1 (рис. 3b), что обеспечивает связь между RPX1, PEN1 и DMNT (Sohrabi et al. , 2015). В подтверждение того, что DMNT является одним из причинных соединений, убивающих личинки вредителей, DMNT накапливается выше у мутантов rpx1-1, чем у Col-0 (рис. 3a), но уровень в линиях RPX1com был изменен на Col-0 (рис. 3a). Рисунок 4а–в). Кроме того, химически синтезированный DMNT может отталкивать и убивать личинок P. xylostella (вспомогательная информация: рисунок S5a,b), что соответствует результатам rpx1-1 (рис. 1b,e). Более того, трансгенные растения, сверхэкспрессирующие PEN1, продуцируют более чем в четыре раза больше DMNT в Col-0 и обладают такой же устойчивостью к P. xylostella, что и rpx1-1 (рис. 5d, i,j,o,p и 6).

Важно отметить, что снижение уровней транскрипта PEN1 в rpx1-1 блокирует биосинтез DMNT (рис. 5d,g,h,m,n) и облегчает убивающий эффект на личинок P. xylostella, которые восприимчивы к заражению P. xylostella (рис. 6a,b). ). Эти совокупные результаты показывают, что мутация PEN1 может подавлять функцию инактивации RPX1 при устойчивости к вредителям. Поражение RPX1 вызывает более высокое содержание PEN1 (рис. 5a), однако то, как именно RPX1 регулирует PEN1 и опосредует биосинтез DMNT, требует дальнейших исследований. Поскольку RPX1 прогнозируется как новый кэп-связывающий белок, принадлежащий к семейству eIF4E (Rhoads, 2009; Ruud et al., 1998), вполне возможно, что RPX1 может влиять на PEN1, влияя на стабильность его мРНК или эффективность трансляции белка, что будет важным фактором. тема в будущем изучении. Более того, следует отметить, что уровни DMNT все еще могут быть индуцированы до более высокого уровня заражением P. xylostella у мутанта rpx1-1 (рис. 5d), что позволяет предположить, что могут существовать некоторые другие пути, регулирующие накопление DMNT, независимые от RPX1. ДМНТ был обнаружен у широкого спектра видов растений, таких как Arabidopsis (Sohrabi et al., 2015), хлопок (Liu et al., 2018) и кукуруза (Richter et al., 2016). Кроме того, он обеспечивает косвенную защиту от травоядных вредителей, привлекая хищников, позволяя растениям устранять угрозу со стороны вредителей (Kappers et al., 2005; Lee et al., 2010; Li et al., 2018). Недавно мы сообщили, что он может отталкивать и убивать личинок P. xylostella, повреждая ПМ в средней кишке личинок (Chen et al., 2021). Здесь мы обнаружили, что структура PM может быть серьезно повреждена, когда личинок кормят проростками, сверхэкспрессирующими rpx1-1 или PEN1 (рис. 2c-j и 6i,j). Эти результаты согласуются с результатами экспериментов по лечению DMNT, которые мы описали ранее (Chen et al., 2021), что еще раз подтверждает предположение о том, что накопление DMNT в rpx1-1 может быть одним из факторов, способствующих отталкиванию и гибели вредителей. RPX1 принадлежит к семейству генов eIF4E (Rhoads, 2009) и участвует в межклеточном перемещении вирусов растений (Keima et al., 2017). Однако остается неясным, связано ли накопление ДМНТ с вирусной устойчивостью растений. PEN1 специфически экспрессируется в корнях Arabidopsis, где он катализирует биосинтез DMNT (Sohrabi et al., 2015).

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

В этом исследовании мы последовательно обнаружили высокую экспрессию PEN1 в корнях и очень низкую экспрессию в листьях (вспомогательная информация: рисунок S8a). Мы заметили, что листья мутанта rpx1-1 были токсичны для личинок P. xylostella (рис. 1), что позволяет предположить, что накопление DMNT и связанная с ним устойчивость к вредителям в листьях не могут быть просто объяснены незначительной экспрессией PEN1 в этих тканях. Важно отметить, что мы обнаружили, что DMNT может транспортироваться от корней растений к надземным частям, как показали анализы транспорта DMNT и анализ ГХ-МС экстрактов листьев растений, инкубированных с DMNT-2 H в их корнях (рис. 7). Как это соединение транспортируется внутри растений, неясно, и это может стать темой для дальнейшего исследования. Растения обладают способностью переносить нападения насекомых и бороться с ними различными способами. Здесь, выполнив иммуноблоттинг-анализ трансгенных растений RPX1pro: RPX1-GFP и 35Spro: RPX1-FLAG, мы обнаружили, что при заражении P. xylostella белок RPX1 может быстро разрушаться (рис. 8a, c, вспомогательная информация: рисунок S10a), тогда как на уровне экспрессии мРНК RPX1 остался незатронутым (вспомогательная информация: рисунок S9b). В настоящее время то, как разрушается белок RPX1, остается неясным, но наши данные в первую очередь позволяют предположить, что механизм деградации белка может быть вовлечен в сигнальные пути ранения (рис. 8d, вспомогательная информация: рис. S10b).

Более того, P. xylostella, предварительно зараженная Col-0, вызывала деградацию RPX1-GFP у разных растений (рис. 8e), что позволяет предположить, что заражение P. xylostella может вызывать накопление сигналов в растениях, что, в свою очередь, может привести к Деградация RPX1. В будущем будет интересно выяснить идентичность сигналов. Эта характеристика деградации RPX1 важна для растений, поскольку может привести к накоплению DMNT и обеспечить быструю реакцию на повреждение вредителями (вспомогательная информация: рисунок S3). Повышенная толерантность растений к вредителям часто достигается за счет их приспособленности. Наблюдение того, что мутация rpx1-1 приводит к повышенной устойчивости (рис. 1) и более высокой продуктивности семян (вспомогательная информация: рис. S11) у арабидопсиса без существенных компромиссов, открывает многообещающие возможности для создания инженерных культур с более высокой устойчивостью к вредителям. Например, редактирование генома с помощью CRISPR-Cas9 — мощный инструмент для улучшения сельскохозяйственных культур (Yang et al., 2017), который позволяет вводить мутации в RPX1 и потенциально расширяет его применение на различные культуры.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

Аримура Г., Одзава Р., Симода Т., Нисиока Т., Боланд В. и Такабаяши Дж. (2000) Летучие вещества, индуцированные травоядными животными, вызывают защитные гены в листьях фасоли Лимы. Природа, 406, 512–515.

Чен К., Чен Х., Хуан С., Цзян Т., Ван К., Тао З. и др. (2021) Летучий DMNT напрямую защищает растения от Plutella xylostella, разрушая перитрофический матриксный барьер в средней кишке насекомых. еЛайф, 10, e63938.

Ченг X., Ху Дж., Ли Дж., Чен Дж., Ван Х., Мао Т. и др. (2018)Повреждение шелковой железы и транскрипционная реакция на гены, связанные с детоксикационными ферментами, Bombyx mori при воздействии фоксима. Хемосфера, 209, 964–971.

Клаф, С.Дж. и Бент, А.Ф. (1998) Цветочное погружение: упрощенный метод агробактериальной трансформации Arabidopsis thaliana. Журнал растений, 16, 735–743.

Костарелли А., Бланше К., Эдерли Л., Салерно Г., Пьерсанти С., Ребора М. и др. (2020) Салициловая кислота, вызываемая кормлением травоядных животных, противодействует опосредованной жасмоновой кислотой защите растений от нападения насекомых. Сигнализация и поведение растений, 15, e1704517.

Дуглас, А.Е. (2018) Стратегии повышения устойчивости сельскохозяйственных культур к насекомым-вредителям. Ежегодный обзор биологии растений, 69, 637–660.

Фэн Ю. и Чжан А. (2017) Цветочный ароматизатор метилбензоат является эффективным зеленым пестицидом. Научные отчеты, 7, 42168.

Филд, Б. и Осборн, А.Е. (2008)Независимая от метаболической диверсификации сборка опероноподобных генных кластеров у разных растений. Наука, 320, 543–547.

Го, Ю.С., Ли, С.Б., Ким, Х.Дж., Ким, Дж., Пак, ХИ, Ким, Дж.К. и др. (2012)Идентификация минеральной синтазы, которая имеет решающее значение для роста и развития Arabidopsis. Журнал растений, 72, 791–804.

Голс, Р. (2014) Прямая и косвенная химическая защита от насекомых в мультитрофической среде. Растение, клетка и окружающая среда, 37, 1741–1752.

Гомес М.А., Лин З.Д., Молл Т., Чаухан Р.Д., Хайден Л., Реннингер К. и др. (2019) Одновременное CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование изоформ eIF4E маниоки nCBP-1 и nCBP-2 снижает тяжесть и заболеваемость симптомами болезни коричневых полос маниоки. Журнал биотехнологии растений, 17, 421–434.

Гуэнгене, С., Пикетт, Дж. А., Вадхамс, Л. Дж., Биркетт, М. А. и Терлингс, TCJ (2005) Электрофизиологические реакции антенн трех паразитических ос на индуцированные гусеницами летучие вещества кукурузы (Zea mays), хлопка (Gossypium herbaceum) и вигны. (Вигна гунгикулата). Журнал химической экологии, 31, 1023–1038.

Хэндрик В., Роберт САМ, Ахерн К.Р., Чжоу С., Мачадо РАР, Мааг Д. и др. (2016)Биосинтез 8-O-метилированных защитных соединений бензоксазиноидов в кукурузе. Растительная клетка, 28, 1682–1700 гг.

Хуанг, А.С., Цзян, Т., Лю, И.С., Бай, Ю.К., Рид, Дж., Цюй, Б. и др. (2019)Специализированная метаболическая сеть избирательно модулирует микробиоту корня арабидопсиса. Наука, 364, eaau6389.

Хуанг, Х.Дж. и Ян, В.Б. (2007)Синтез моеноцинола и его аналогов с использованием BT-сульфона при олефинировании по Джулии-Коценски. Письма о тетраэдре, 48, 1429–1433 гг.

Цзин Т., Ду В., Гао Т., Ву Ю., Чжан Н., Чжао М. и др. (2020) DMNT, индуцируемый травоядными животными, катализируемый CYP82D47, играет важную роль в индукции JA-зависимой устойчивости травоядных животных соседних чайных растений. Растение, клетка и окружающая среда, 44, 1178–1191.

Джонсон, С.Н. и Зюст, Т. (2018) Изменение климата и насекомые-вредители: сопротивление не бесполезно? Тенденции в науке о растениях, 23, 367–369.

Джузани Г.С., Валиджанян Э. и Шарафи Р. (2017) Bacillus thuringiensis: успешный инсектицид с новыми экологическими характеристиками и новостями. Прикладная микробиология и биотехнология, 101, 2691–2711.

Капперс, И.Ф., Ахарони, А., ван Херпен, TWJM, Лукерхофф, ЛЛП, Дикке, М. и Баумистер, Х.Дж. (2005) Генная инженерия терпеноидного метаболизма привлекает телохранителей к арабидопсису. Наука, 309, 2070–2072.

Кейма Т., Хагивара-Комода Ю., Хасимото М., Нерия Ю., Коинума Х., Ивабучи Н. и др. (2017) Дефицит изоформы eIF4E nCBP ограничивает межклеточное перемещение растительного вируса, кодирующего белки тройного генного блока у Arabidopsis thaliana. Научные отчеты, 7, 39678.

Ли, С., Бадиян, С., Беван, Д.Р., Херде, М., Гатц, К. и Толл, Д. (2010) Летучие монотерпены, индуцированные травоядными и цветочными животными, биосинтезируются одним ферментом P450 (CYP82G1) у арабидопсиса. . Труды Национальной академии наук, 107, 21205–21210.

Ли Б., Фёрстер К., Роберт САМ, Зюст Т., Ху Л., Мачадо РАР и др. (2018)Конвергентная эволюция метаболического переключения между устойчивостью к тле и гусеницам в зерновых. Успехи науки, 4, eaat6797.

Лю Д., Хуанг Х., Цзин В., Ань Х., Чжан Ц., Чжан Х. и др. (2018)Идентификация и функциональный анализ двух ферментов P450 Gossypium hirsutum, участвующих в биосинтезе DMNT и TMTT. Журнал биотехнологии растений, 16, 581–590.

Лортцинг Т. и Степпун А. (2016) Передача сигналов жасмоната в растениях формирует экологию взаимодействия растений и насекомых. Текущее мнение в области науки о насекомых, 14, 32–39.

Лу Х., Луо Т., Фу Х., Ван Л., Тан Ю., Хуанг Дж. и др. (2018)Устойчивость риса к насекомым-вредителям, опосредованная подавлением биосинтеза серотонина. Природные растения, 4, 338–344.

Лусиоли ​​А., Тавацца Р., Байма С., Фатиол К., Бургян Дж. и Тавацца М. (2022) Нацеливание CRISPR-Cas9 на ген eIF4E1 расширяет спектр устойчивости картофеля к Y-вирусу Solanum. Tuberosum L. сорт. желание. Границы микробиологии, 13, 873930.

Ма, Ф., Ян, X., Ши, З. и Мяо, X. (2019)Новые перекрестные помехи между реакциями путей этилена и жасмоновой кислоты на колюще-сосущее насекомое в рисе. Новый фитолог, 225, 474–487.

Минц, А.К., Чен, С.П., Райчелт, М., Лу, Х.Х., Бартрам, С., Йе, К.В. и др. (2019) Летучий ДМНТ системно индуцирует независимую от жасмоната прямую защиту от травоядных в листьях растений сладкого картофеля (Ipomoea batatas). Научные отчеты, 9, 17431.

Микстацкий А., Закерска-Банашак О., Скшипчак-Зелинска М., Тамович Б., Салата М. и Сломски Р. (2015) Глутатион S-трансфераза как индикатор токсичности при общей анестезии: генетика и биохимическая функция. Журнал клинической анестезии, 27, 73–79.

Роудс, RE (2009) eIF4E: новые члены семьи, новые партнеры по связям, новые роли. Журнал биологической химии, 284, 16711–16715.

Рихтер А., Шафф К., Чжан З., Липка А.Е., Тиан Ф., Кёлльнер Т.Г. и др. (2016)Характеристика путей биосинтеза продукции летучих гомотерпенов DMNT и TMTT у Zea mays. Растительная клетка, 28, 2651–2665.

Рууд К.А., Кулов С., Госс DJ и Браунинг К.С. (1998) Идентификация и характеристика нового кэп-связывающего белка из Arabidopsis thaliana. Журнал биологической химии, 273, 10325–10330.