Ингибирующее действие циклогетерофиллина на синтез меланина

Абстрактный:Это исследование было проведено для выяснения ингибирующего действия циклогетерофиллина на синтез меланина. Для выяснения ингибирующего действия циклогетерофиллина на клеточную линию B16F10 измеряли жизнеспособность клеток, экспрессию матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК), анализ активности тирозиназы и анализ продукции меланина. Определяли влияние циклогетерофиллина на экспрессию мРНК белка 1, родственного тирозиназе (TYRP1)/TYRP2/тирозиназу (TYR)/фактора транскрипции, ассоциированного с микрофтальмом (MITF), и содержание меланина. Количественная RT-PCR в реальном времени показала, что циклогетерофиллин снижал уровень экспрессии мРНК генов TYRP1/TYRP2/TYR/MITF и содержание продукции меланина по сравнению с клетками B16F10, обработанными MSH. Анализ активности тирозиназы показал, что циклогетерофиллин снижает выработку меланина в клетках B16F10. Эти данные показывают, что циклогетерофиллин усиливает эффект отбеливания клеток B16F10; таким образом, циклогетерофиллин является мощным ингредиентом для отбеливания кожи. Таким образом, необходимо провести дальнейшие исследования механизма действия циклогетерофиллина для разработки функциональных материалов.

Согласно соответствующим исследованиям, цистанхе — распространенное растение, известное как «чудодейственное растение, продлевающее жизнь». Его основным компонентом является цистанозид, который обладает различными эффектами, такими как антиоксидантное, противовоспалительное и стимулирующее иммунную функцию. Механизм между цистанхе и отбеливанием кожи заключается в антиоксидантном действии гликозидов цистанхе. Меланин в коже человека вырабатывается путем окисления тирозина, катализируемого тирозиназой, причем реакция окисления требует участия кислорода, поэтому свободные радикалы кислорода в организме становятся важным фактором, влияющим на выработку меланина. Цистанхе содержит цистанозид, который является антиоксидантом и может снижать образование свободных радикалов в организме, подавляя тем самым выработку меланина.

maca ginseng cistanche sea horse

Нажмите «Как использовать Cistanche».

Для получения дополнительной информации:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ключевые слова:циклогетерофиллин; меланин; тирозиназа; фактор транскрипции, связанный с микрофтальмом

1. Введение

Цвет кожи определяется гемоглобином в крови, пигментом меланином в эпидермальном слое и -каротином в подкожной клетчатке. Среди них цвет кожи в основном определяется количеством и распределением пигмента меланина [1]. Меланин представляет собой пигмент, синтезируемый меланосомой в меланоците, который присутствует в базальном слое. Он поглощает или рассеивает ультрафиолетовые (УФ) лучи и имеет полезную функцию для подавления повреждения клеток или тканей кожи. Однако чрезмерное накопление меланина может вызвать появление пятен, веснушек и пигментации. Известно, что он вызывает гиперпигментацию [2,3].

Пигмент меланин является репрезентативным раздражителем, вызывающим экзогенное старение. Он вырабатывается в результате меланогенеза меланоцитов, подвергшихся воздействию УФ-лучей, и имеет полезную функцию защиты кожи от УФ-лучей путем затемнения цвета кожи. Пигмент меланина состоит из эумеланина (черный) и феомеланина (красно-коричневый) [4,5]. Меланин производится с использованием L-тирозина, типа аминокислоты, в качестве субстрата, и через L-ДОФА (3,4-дигидроксифенилаланин) и далее окисляется до ДОФА-хинона с помощью основных ферментов тирозиназы (TYR), родственный тирозиназе белок-1 (TYRP1) и TYRP2. ДОФА-хинон далее окисляется до красно-желтого феомеланин в присутствии сульфгидрильных групп. DOPA-хинон также декарбоксилируется, окисляется и катализируется в эумеланин, когда сульфгидрильные группы истощаются [4,5]. Фермент тирозиназа является ключевым ферментом, ответственным за выработку меланина, и известно, что экстракт солодки, экстракт японского дуба, арбутин и койевая кислота, которые являются репрезентативными отбеливающими материалами, ингибируют активность фермента тирозиназы [6,7]. В частности, арбутин играет роль в ингибировании активности тирозиназы, реагируя конкурентно с L-тирозином, который является сырьем для меланина, и койевой кислотой, связанной с активным центром тирозиназы посредством Cu2 plus. Известно, что койевая кислота и арбутин обладают сильным отбеливающим эффектом, но сообщалось о побочных эффектах, связанных с безопасностью, таких как раздражение кожи [8,9]. Проводится множество исследований для открытия новых эффективных материалов, таких как разработка функциональных материалов природного происхождения [8,9].

cistanche tubulosa adalah

Циклогетерофиллин (C30H30O7), тип пренилфлавона, в изобилии содержится в Artocarpus heterophyllus и, как сообщается, обладает фармакологическими и биологическими функциями, включая противовоспалительную, антитромбоцитарную активность и антиоксидантную эффективность [10–13]. Кроме того, сообщалось, что он оказывает антиоксидантное и омолаживающее действие на дермальные фибробласты человека, индуцированное УФ-А [14,15].

Таким образом, сообщалось, что циклогетерофиллин эффективен при различных заболеваниях, но исследований влияния циклогетерофиллина на выработку меланина не проводилось. В этом исследовании я изучил влияние циклогетерофиллина на экспрессию маркеров TYRP1, TYRP2, TYR и MITF в клетках B16F10, клеточной линии меланомы, полученной от мышей, связанной с механизмом продукции меланина.

2. Результаты и обсуждение

Анализ CCK{{0}} проводили для определения цитотоксичности циклогетерофиллина в клеточной линии B16F10. Различные концентрации циклогетерофиллина были добавлены для измерения жизнеспособности клеток (рис. 1). Было подтверждено, что при обработке концентрацией 20 мкг/мл или более выживаемость клеток B16F10 значительно снижается по сравнению с контрольной группой. При добавлении циклогетерофиллина в концентрации 10 мкг/мл выживаемость клеток B16F10 была аналогична контрольной группе. Поэтому циклогетерофиллин добавляли в концентрациях 10, 1 и 0,1 мкг/мл в дополнительных экспериментах.

maca ginseng cistanche

Фермент тирозиназы реагирует с L-тирозином с образованием L-ДОФА, а L-ДОФА, наконец, производит меланиновый пигмент через ДОФАхинон с помощью тирозиназы, которая известна как ключевой фермент, регулирующий меланогенез [4,5]. В этом эксперименте койевая кислота использовалась в качестве положительного контроля для оценки степени ингибирования активности фермента тирозиназы. Степень угнетения активности фермента тирозиназы подтверждали обработкой циклогетерофиллином в концентрациях 10, 1 и 0,1 мкг/мл. Было подтверждено, что активность фермента тирозиназы ингибируется циклогетерофиллином в зависимости от концентрации (рис. 2). Было подтверждено, что в группах, получавших циклогетерофиллин в концентрациях 10, 1 и 0,1 мкг/мл, ингибирующее действие фермента тирозиназы составило 58,0, 27,4 и 16,9% соответственно.

cistanche portugal

УФ-лучи стимулируют кератиноциты в эпидермисе, вызывая экспрессию -меланоцитстимулирующего гормона (-МСГ), гормона, который стимулирует меланоциты и секретируется вне клетки, а секретируемый -МСГ стимулирует меланоциты. Связываясь с рецептором меланокортина 1 (MC1R), он индуцирует передачу сигналов, связанных с синтезом меланина в клетке, вызывая выработку пигмента меланина [5]. В этом эксперименте для индукции продукции меланина в клетках B16F10 использовали 200 нМ -MSH для индукции продукции меланина в клетках B16F10 [16]. RT-PCR в реальном времени уровней экспрессии генов TYRP1, TYRP2, TYR и MITF, которые являются маркерами, которые увеличиваются при обработке -MSH, определяли при обработке циклогетерофиллином в клетках B16F10, обработанных -MSH. Клетки B16F10 обрабатывали циклогетерофиллином, и экспрессию маркера подтверждали с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. В результате было подтверждено, что экспрессия TYRP1, TYRP2, TYR и MITF была значительно снижена в группе, получавшей циклогетерофиллин, по сравнению с группой, получавшей -MSH. В частности, в экспериментальной группе, получавшей 10 мкг/мл циклогетерофиллина, экспрессия генов TYRP1, TYRP2, TYR и MITF снизилась на 53,3, 26,6, 58 и 34 процента соответственно (рис. 3). В экспериментальной группе, получавшей 1 мкг/мл циклогетерофиллина, было подтверждено, что экспрессия маркеров была значительно снижена, и экспрессия генов TYRP1 и TYRP2 была аналогичным образом снижена в группе, получавшей 0,1 мкг/мл циклогетерофиллина.

После подтверждения того, что обработка циклогетерофиллином снижает уровень экспрессии мРНК маркера, связанного с меланогенезом, была подтверждена скорость производства пигмента меланина, чтобы определить, было ли существенно снижено производство пигмента меланина в клетках B16F10 (рис. 4). . Собирали клеточные линии B16F10, обработанные циклогетерофиллином в концентрациях 10, 1 и 0,1 мкг/мл соответственно, и подтверждали степень продукции меланина. В результате было подтверждено, что циклогетерофиллин значительно снижал выработку пигмента меланина при концентрациях 10 и 1 мкг/мл (рис. 4А). Кроме того, было подтверждено, что выработка пигмента меланина в условиях лечения циклогетерофиллином была снижена по сравнению с контрольной группой (рис. 4В). При добавлении 10 и 1 мкг/мл циклогетерофиллина скорость выработки пигмента меланина снижалась на 44,6 и 37,8% соответственно, что было значительно ниже по сравнению с контрольной группой (рис. 4В). Эти результаты, как правило, согласуются с экспериментальными результатами ОТ-ПЦР в реальном времени по уровням экспрессии мРНК маркеров, связанных с меланогенезом.

cistanche in urdu

Известно, что антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, являются важным отбеливающим веществом, которое ингибирует синтез пигментов меланина за счет восстановления ДОФАхинона, промежуточного вещества в процессе производства эумеланина, до L-ДОФА [16,17]. Сообщалось также, что циклогетерофиллин обладает антиоксидантным действием [11,12]. Показано, что циклогетерофиллин может быть эффективен в отбеливании с этим антиоксидантным эффектом. В результате подтверждения антиоксидантного эффекта in vitro с помощью этого анализа удаления радикалов DPPH было подтверждено, что он обладает антиоксидантным эффектом, сравнимым с эффектом аскорбиновой кислоты, что является положительным контролем при высокой концентрации циклогетерофиллина (рис. 5). В будущем следует провести дальнейшие исследования антиоксидантного действия циклогетерофиллина в меланоцитах и экспрессии антиоксидантных ферментов, таких как каталаза, СОД1, СОД2 и СОД3.

cistanche tablets benefits

cistanche sold near me

3. Материалы и методы

3.1. Экспериментальные материалы и культура клеток

Клеточная линия B16F10 была приобретена в Корейском банке клеточных линий (Корея), а среда для культивирования клеток представляла собой 10-процентную эмбриональную бычью сыворотку (FBS, SFBU-0500, Equitech-bio, Керрвилл, Техас, США) в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM). , LM 001-05, Welgene, Gyeongsan-si, Korea), и добавляли 1% пенициллин/стрептомицин (Gibco, 15140-122, Waltham, MA, USA). Клетки культивировали в инкубаторе при 37 ◦C и 5% CO2 [16]. Циклогетерофиллин, использованный в этом эксперименте, был экстрагирован из Artocarpus heterophyllus с использованием ДМСО и приобретен у ChemFaces Co. (CFN97748, Ухань, Китай, чистота больше или равна 98%).

3.2. Клетка для анализа жизнеспособности клеток

жизнеспособность оценивали с помощью раствора CCK-8 (набор для подсчета клеток; EZ-3000, EZ-Cytox, Seoul, DoGen). Клеточные линии B16F10 высевали на культуральную среду с плотностью 2 × 104 клеток/96-луночные планшеты. Через 24 часа добавляли циклогетерофиллин (CFN97748, Chemfaces). Клетки линии B16F10, обработанные циклогетерофиллином, инкубировали в течение 24 ч и добавляли раствор CCK-8 на 30 мин в инкубаторе при 37°С. Поглощение измеряли при 450 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов (Epoch, Winooski, VT, USA, BioTek), а жизнеспособность клеток рассчитывали на основе поглощения контрольной группы без клеток [16].

cistanche powder bulk

3.3. Анализ DPPH

Для анализа удаления радикалов DPPH (Sigma-Aldrich, 382051, Дармштадт, Германия) DPPH растворяли в смеси метанол: вода (3:2) при концентрации 0,1 мМ. Разбавленный циклогетерофиллин (50 мкл, CFN97748, Chemfaces) добавляли к раствору DPPH (500 мкл) и оставляли реагировать при комнатной температуре в течение 20 минут, после чего измеряли спектрофотометр для микропланшетов (Epoch, Winooski, VT, USA, BioTek) и определяли оптическую плотность. измеряли при длине волны 517 нм. Аскорбиновую кислоту (1043003, Мюнхен, Германия, Sigma-Aldrich) использовали в качестве положительного контроля.

3.4. Активность грибной тирозиназы in vitro

Грибную тирозиназу (КФ 1.14.18.1, Sigma-Aldrich) растворяли в 1/15 М PBS (pH 6,8) до концентрации 276 единиц/мл и использовали. Около 15 0 мкл грибной тирозиназы (13,8 единиц/мл) реагировали с L-тирозином (T-3754, Sigma-Aldrich) и циклогетерофиллином (10, 1, 0,1 мкг/мл) в течение 5 минут, и поглощение измеряли при длине волны 475 нм. Каждую экспериментальную группу тестировали независимо три раза, и степень ингибирования фермента тирозиназы (в процентах) материала рассчитывали, применяя следующую расчетную формулу. В качестве положительного контроля использовали койевую кислоту (K3125, Sigma-Aldrich) в концентрации 100 мкг/мл.

Коэффициент ингибирования тирозиназы (в процентах)=(1 — поглощение при лечении/поглощение при отсутствии лечения) × 100

3.5. Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (Q-RT-PCR)

Тотальную РНК выделяли с использованием тризола (15596018, Карлсбад, Калифорния, США, Thermo Fisher Scientific). Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически (BioTek). Четыре микрограмма РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора для обратной транскрипции ReverTra Ace® (Toyobo, FSQ101, Осака, Япония). Обратную транскрипцию останавливали добавлением трис-ЭДТА-буфера (рН 8,0) к 200 мкл раствора кДНК. Наборы для анализа экспрессии генов TaqMan® были приобретены у Applied Biosystems. Q-RT-PCR проводили в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 20 мкл смеси Q-PCR содержали 10 мкл 2× TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США), 1 мкл 20× Taqman для анализа экспрессии (Applied Biosystems) и 50 нг кДНК. Смесь Q-PCR подвергали реакции при 95°C в течение 20 с и 40-кратном циклировании реакции (95°C в течение 1 с и 60°C в течение 20 с) с помощью системы StepOnePlus (Applied Biosystems). Идентификационные номера генов для анализа экспрессии TaqMan, использованного в анализах Q-RT-PCR, представлены в таблице 1. GAPDH человека (Applied Biosystems) использовали для нормализации вариаций количества кДНК из разных образцов.

cong rong cistanche

3.6. Тест на меланин

Для измерения количества пигмента меланина метод Хосоя был частично модифицирован [17]. В общей сложности 1 × 105 клеток B16F10 инокулировали в чашку для культивирования тканей диаметром 60 мм. После культивирования клеток в течение 24 ч добавляли 200 нМ β-меланоцитстимулирующего гормона (-MSH; M4135, Sigma-Aldrich) и циклогетерофиллин (10, 1, 0,1 мкг/мл) на 72 ч в каждой концентрации. После удаления культуральной среды добавляли 200 мкл раствора NaOH (1 н.; S8045, Sigma-Aldrich) и инкубировали при 60°С в течение 2 ч для растворения меланина. Поглощение измеряли на спектрофотометре (405 нм, Epoch). В качестве положительного контроля использовали 100 мкг/мл арбутина (A4256, Sigma-Aldrich). Ингибирование продукции пигмента меланина выражали в процентах от количества меланина, продуцируемого в условиях обработки -MSH. Это было выполнено путем независимого выполнения трех независимых экспериментов.

3.7. Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Результаты выражены как среднее значение ± стандартное отклонение по крайней мере трех независимых экспериментов.

4. Выводы

УФ-излучение, встречающееся в повседневной жизни, имеет полезные функции, такие как синтез и стерилизация витамина D, но в других аспектах оно вызывает потерю эластичности кожи, появление морщин, пигментацию, эритему, воспаление и т. д. в результате цепной реакции активных форм кислорода [18, 19]. Кроме того, экзогенное старение, вызванное внешними факторами, такими как УФ, препятствует функционированию нормальных тканей и регенерации при повреждении ткани из-за уменьшения и ухудшения составляющих ее клеток в живом организме [20,21].

Благодаря этому исследованию удалось подтвердить подходящую концентрацию циклогетерофиллина для лечения клеток B16F10. Подтверждено, что концентрация 10 мкг/мл не влияет на жизнеспособность клеток, как показано на рис. 1. По результатам измерения активности ингибирующего действия фермента тирозиназы подтверждено, что концентрации циклогетерофиллина и 0,1 мкг/мл значительно снижали активность фермента тирозиназы (рис. 2). Кроме того, было подтверждено, что циклогетерофиллин значительно снижал экспрессию маркеров (ген TYRP1, TYRP2, TYR и MITF) по сравнению с состоянием, обработанным -MSH (рис. 3). Кроме того, было подтверждено, что циклогетерофиллин снижает количество синтеза меланина в клетках B16F10 (рис. 4). Основываясь на этих результатах, циклогетерофиллин демонстрирует потенциал в качестве нового кандидата на отбеливание.

cistanche nutrilite

Это исследование является первым, подтверждающим ингибирующее действие циклогетерофиллина на синтез меланина, и предполагает возможность ингибирования старения кожи, вызванного УФ-лучами. Кроме того, представляется необходимым более глубокое его влияние на сигнальные механизмы клеток B16F10, на сигнальные системы, участвующие в отбеливании, и на различные антиоксидантные ферменты, присутствующие в меланоцитах.

Финансирование:Эта статья была поддержана исследовательским грантом Университета Семьюнг в 2021 году.

Заявление Институционального контрольного совета:Непригодный.

Заявление об информированном согласии:Непригодный.

Заявление о доступности данных:Данные, представленные в этом исследовании, доступны в статье.

Конфликт интересов:Автор заявляет об отсутствии известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений.

Наличие образца:Образцы соединений отсутствуют у автора.