Исследование токсичности ифосфамида индуцирует общий восходящий регулятор в печени и почках

Контактное лицо: emily.li@wecistanche.com

Хён-Юн Хан и др.

Абстрактный:

Ифосфамид — алкилирующий агент, синтетический аналог циклофосфамида, применяемый для лечения различных солидных раковых заболеваний. В этом исследовании токсичность ифосфамида оценивали с помощью однократного и многократного внутрибрюшинного введения крысам в соответствии с рекомендациями по надлежащей лабораторной практике, а для подтверждения токсикологических результатов был проведен дополнительный эксперимент с микроматрицами. Однократное введение ифосфамида (50 мг/кг) не вызывало каких-либо патологических изменений. Между тем, тяжелая почечная токсичность наблюдалась в группах с последовательным введением 7 и 28 дней со значительным повышением уровня азота мочевины в крови и уровней креатинина. В анализе токсикологического списка гены, связанные с синтезом холестерина, в основном были затронуты в печени, а гены, связанные с почечной недостаточностью, были затронуты в печени.почкапосле введения ифосфамида. Более того, регуляторный фактор интерферона 7 был выбран в качестве основного восходящего регулятора, который изменялся как впеченьа такжепочка, и было обнаружено, что он взаимодействует с другими генами-мишенями, такими как убиквитин-специфическая пептидаза 18, радикальный S-аденозилметиониновый домен, содержащий 2, и интерферон-стимулируемый ген 15, что было дополнительно подтверждено анализом RT-PCR в реальном времени. В заключение, повторно подтвердили токсичность ифосфамида для органов почек и идентифицировали идентичные измененные гены в обоихпеченьа такжепочка. Необходимы дальнейшие всесторонние токсикогеномные исследования, чтобы выявить точную взаимосвязь между генами, индуцированными ифосфамидом, и органной токсичностью.

Ключевые слова:ифосфамид; гепатотоксичность; нефротоксичность; внутрибрюшинная токсичность

Цистанхе полезен для печени и почек

1. Введение

Ифосфамид — алкилирующий агент, синтетический аналог циклофосфамида, используемый для лечения различных солидных раковых заболеваний, включая саркомы и лимфомы. Ифосфамид является неспецифическим противоопухолевым препаратом клеточного цикла, который препятствует репликации ДНК и продукции РНК [1]. Хотя ифосфамид относительно хорошо переносится по сравнению с другими токсичными алкилирующими агентами, известно, что он связан с многочисленными опасными для жизни побочными эффектами, которые ограничивают его клиническое применение [2]. Основные побочные эффекты ифосфамида включают серьезное повреждение почек в результате реактивных токсических частиц ифосфамида, в том числе остроепочка рана, интерстициальный нефрит, геморрагический цистит и синдром Фанкони [3]. В клиниках сообщалось о тяжелой полиорганной токсичности у пациентов, которые испытали раннюю нефротоксичность и повторную недостаточность одного органа, вызванную высокими дозами ифосфамида, которая привела к последующей органной недостаточности [4,5].

Токсичный метаболит ифосфамида, акролеин и хлорацетальдегид, является основным фактором органной токсичности ифосфамида. Предыдущие исследования в основном были сосредоточены на факторах, влияющих на превращение ифосфамида в токсичные метаболиты, особенно на цитохром Р450 (CYP) [6]. Относительно большое количество CYP3A4 и CYP3A5 в почках приводит к токсическим изменениям ифосфамида и вызывает нефротоксичность [7]. Акролеин представляет собой высокореактивный альдегид, который может активировать внутриклеточный путь реактивных окислительных генов и повреждать клеточные органеллы. Хлорацетальдегид сообщил о подавлении активации комплекса I в митохондриальной дыхательной цепи, что может привести к истощению внутриклеточного глутатиона (GSH) и гибели клеток [8].

Токсикологическое исследование нескольких органов более полезно для понимания системных эффектов лекарств, чем изучение конкретных органов для изучения токсичности. Печень и почки являются основными органами, участвующими в метаболизме и выведении лекарств, и эти основные органы предрасположены к побочным реакциям на лекарства; часто следует органная токсичность. Более того, интегративная токсикологическая оценка может выявить различные патологические данные, которые могут помочь понять и предсказать токсичность, вызванную лекарственными препаратами, в организме.

Многие исследования использовали профили экспрессии генов для прогнозирования потенциального негативного воздействия химических веществ. Тем не менее, большинство более ранних исследований были сосредоточены на оценке токсичности одного органа-мишени с ограниченными патологическими симптомами [9]. Более того, в сочетании с генным профилированием на основе микрочипов это даст всестороннее понимание токсичности на системном уровне, что может предотвратить потенциальную токсичность, связанную с лекарствами [10]. В связи с этим интегративные многоорганные токсикологические подходы с профилированием экспрессии генов использовались в исследованиях моделей прогнозирования токсичности, чтобы преодолеть данные о токсичности, полученные из оценки токсичности одного органа, что недостаточно для понимания механизмов токсичности лекарств в системе [11].

В этом исследовании мы описываем токсичность ифосфамида впочкаа такжепеченьпосле острого и многократного воздействия на крыс Sprague-Dawley (SD). Для выявления общего гена-мишени, который был изменен ифосфамидом как в печени, так и впочка, предполагая понимание интегративной токсичности ифосфамида.

2. Результаты

2.1. Исследование токсичности однократной дозы

В группах, получавших ифосфамид в дозе 12,5, 25 и 50 мг/кг, токсичности не наблюдалось — ни смерти, ни токсических симптомов, ни изменений массы тела, ни результатов гистопатологического исследования.

Между тем, в гематологическом исследовании относительное количество ретикулоцитов (RET) и абсолютное количество нейтрофилов (NEUA) и лимфоцитов (LYMA) снижалось дозозависимым образом.

2.2. Однонедельное исследование токсичности повторных доз

Общая масса тела снизилась через 1 неделю приема ифосфамида, а средние значения потери массы тела в группе 100 мг/кг были выше, чем в группе 75 мг/кг (таблица 1). Между тем относительная масса органов постепенно увеличивалась в группах, получавших ифосфамид (таблица 2).

Одна неделя последовательного внутрибрюшинного введения ифосфамида снижала гематологический индекс, включая RBC, HGB, HCT, MCV и PLT, дозозависимым образом (таблица 3). Кроме того, BUN и CREA увеличились в 1,2 раза в контрольной группе по сравнению с группой ифосфамида (таблица 4).Почкаранабыло дополнительно подтверждено гистологическим исследованием.

Никаких гистопатологических признаков не наблюдалось в печени мышей в группах 75 и 100 мг/кг ифосфамида (рис. 1А). Между тем,почкив группах ифосфамида 75 и 100 мг/кг были обнаружены патологические изменения от минимальной до легкой степени, включая дегенерацию/дилатацию канальцев (1 умеренная в группе 100 мг/кг), одноклеточный некроз, гиперплазию уротелия и очаговое кровоизлияние /заторы (таблица 5). Кроме того, наблюдалось явное увеличение экспрессии KIM-1 в области почечных канальцевпочкагруппы 100 мг/кг (рис. 1В).

2.3. Четырехнедельное исследование токсичности повторных доз

Смертность наблюдалась в группах, получавших 50 (5/10) и 70 (10/10) мг/кг после 21 и 10 дней последовательного введения соответственно. Кроме того, снижение массы тела при увеличении относительной массы органов,печень, а такжепочка, во всех группах, получавших ифосфамид, поддерживает 4-недельную токсичность повторных доз.

Гематологический и биохимический анализы сыворотки были выполнены у выживших субъектов. Несколько параметров крови, включая RET, RBC, MONA, EOSA и LUCA, значительно снизились через 4 недели введения ифосфамида.

По сравнению с контрольной группой биохимические анализы показали статистические различия через 4 недели приема ифосфамида. Например, уровни AST и CK были значительно повышены, а соотношение A/G, GLU и GGT снизились (p < 0,01)="" в="" группе,="" получавшей="" 50="" мг/кг,="" по="" сравнению="" с="" контрольной="" группой.="">

2.4. Ифосфамид-индуцированный анализ экспрессии генов

Ифосфамид-индуцированные ДЭГ были идентифицированы в печени ипочкаткани (табл. 6). Для печени дифференциально экспрессируемые гены включали 2672 гена при дозе 100 мг/кг МТ/день, 1283 гена были активированы, а 1389 генов подавлены. В почках 401 ген по-разному экспрессировался при дозе 100 мг/кг МТ/день: 149 генов активировались, а 252 гена подавлялись. Как в печени, так и в почках количество генов с отрицательной регуляцией было больше, чем количество генов с положительной регуляцией. Это может свидетельствовать о том, что лечение ифосфамидом ингибирует экспрессию генов.

Результаты анализа биологической функции приведены в Таблице 7. Было обнаружено, что введение ифосфамида в течение 1-недели изменяет гены, связанные с развитием органов, в основном в печени. впочкабыло подтверждено, что в наибольшей степени затронуты гены, связанные с локализацией иммунных клеток.

При анализе канонического пути ДЭГ изменения в генах, связанных с путями пути презентации антигена и синтеза холестерина, были очевидны впеченьа такжепочкатканей соответственно (рис. 2). Более того, LXE/RXR и передача сигналов острофазового ответа были общими каноническими путями, регулируемыми сверху впеченьа такжепочка, которые были вовлечены в гомеостаз липидов и передачу сигналов воспалительных цитокинов соответственно.

При анализе токсического списка печени в основном были затронуты гены, связанные с синтезом холестерина, за ними следовали белки положительного ответа острой фазы и панель острой почечной недостаточности (таблица 8). Кроме того, результаты списка почек показали, что гены, связанные с почечной недостаточностью, в целом были затронуты ифосфамидом, включая биомаркеры обратимого гломерулонефрита и панель острой почечной недостаточности.

Основываясь на базе знаний IPA, общий вышестоящий регулятор регулирует экспрессию генов в печени и почках после лечения ифосфамидом (рис. 3). IRF7 был основным регулятором, который изменялся как в печени, так и в почках, и было обнаружено, что он взаимодействует с другими генами-мишенями, такими как USP18, RSAD2 и ISG15. Кроме того, анализ ОТ-ПЦР в реальном времени подтвердил экспрессию IRF7, USP18, RSAD2 и ISG15. Хотя степень изменений в каждом гене была разной в печени и почках, экспрессия подавлялась в тканях печени и почек после 1 недели введения ифосфамида. RSAD2 и USP18 имеют в основном измененные гены при лечении ифосфамидом в печени и почках соответственно.

3. Обсуждение

В этом исследовании была изучена комплексная токсичность ифосфамида в различных органах при различных дозах и условиях воздействия внутрибрюшинным путем у крыс в соответствии со стандартом GLP. В клинике ифосфамид может оказывать бимодальное противоопухолевое действие с цитотоксическим и иммуномодулирующим действием в сочетании с адоптивной иммунотерапией [12]. Известно, что ифосфамид в основном выводится почками, и около 80 процентов дозы находится в неизмененной форме, нефротоксичность является общеизвестным побочным эффектом ифосфамида, а метаболиты, такие как хлорацетальдегид и акролеин, ответственны за его клиническое применение [13, 14].

В настоящем исследовании 1-недельное повторное исследование токсичности было подходящим для изучения органной токсичности ифосфамида. Одна неделя приема ифосфамида приводила к дозозависимому подавлению индекса крови, что может отражать типичную миелосупрессию, вызванную ифосфамидом. Наряду с нефротоксичностью в нескольких сообщениях указывается, что миелосупрессия является одним из основных ограничивающих дозу токсических эффектов ифосфамида, а лейкопения, как правило, более тяжелая, чем тромбоцитопения [15,16]. Нефротоксичность ифосфамида может приводить к синдрому Фанкони, при котором происходит нарушение функции проксимальных канальцев, приводящее к необратимым повреждениям, а токсический метаболит акролеин провоцирует уротоксичность с геморрагическим циститом [17]. Это соответствует результатам настоящего исследования. При гистопатологическом исследовании были исследованы почки и печень для изучения патологических изменений, вызванных ифосфамидом. В обеих группах, получавших ифосфамид в дозе 75 и 100 мг/кг, были обнаружены обширные участки дегенерации и дилатации канальцев с гиперплазией уротелия в области почечной лоханки. Кроме того, экспрессия KIM-1, молекулы повреждения проксимальных канальцев почек, подтверждает наличие нефротоксичности, связанной с ифосфамидом. При этом в печени наблюдалась лишь минимальная перипортальная вакуолизация. Более того, хотя значения АСТ и АЛТ снижались дозозависимым образом, изменения находились в пределах референтного диапазона [18]. Необходимо дальнейшее изучение более глубоких причин снижения уровня ферментов печени. Общепризнано, что ифосфамид является алкилирующим агентом, который редко связан с гепатотоксичностью, и лишь в нескольких случаях сообщалось о повреждении печени, особенно в сочетании с другими химиотерапевтическими препаратами, такими как доксорубицин [19].

В последнее время заметный прогресс в данных об экспрессии генов в токсикологии с помощью высокопроизводительных технологий привел к созданию достаточно больших наборов данных в исследованиях токсичности, и было предпринято множество попыток применить профиль гена для прогнозирования химической токсичности [10,20]. В этом исследовании был проведен анализ микрочипов для анализа ответа транскриптома, вызванного введением ифосфамида, и в качестве гена-мишени были выбраны ДЭГ с кратностью изменения больше или равной 1,5, а биологическая функция, канонический путь и анализ Tox list были использованы. чтобы понять функцию генов, индуцированных ифосфамидом. Был проведен дополнительный анализ вышестоящих регуляторов для оценки возможности полиорганной токсичности в печени и почках.

В этом исследовании были отобраны DEG, измененные в 1,5-кратно, и гены с пониженной экспрессией были немного более доминирующими, чем гены с повышенной экспрессией как в печени (52 процента), так и в почках (62 процента). Результаты анализа биологических функций показали, что ифосфамид изменяет гены с биологическими функциями, связанными с развитием тканей, которые обычно наблюдаются как в печени, так и в почках.

Предыдущее исследование Snouber et al. [21] сообщили, что лечение ифосфамидом подавляет опосредованные Nrf-2 пути стресс-окислительной реакции в микрофлюидной культуре [21]. В соответствии с предыдущими исследованиями, NRF2-опосредованный путь реакции на окислительный стресс был значительно модулирован верхними сетями, что было подтверждено как настоящим каноническим путем, так и анализом токсикологического списка. Нынешние измененные Nrf-2-опосредованные пути стресс-окислительной реакции могут быть тесно связаны с токсичным метаболитом ифосфамида. Множественные токсичные метаболиты ифосфамида могут реагировать с GSH, мощным антиоксидантом, с образованием конъюгатов на разных участках пути, а снижение уровня GSH приводит к повышению токсичности, что указывает на причастность окислительного стресса к органной токсичности ифосфамида [8,22]. ]. В связи с этим месну и N-ацетилцистеин применяли для снижения органной токсичности ифосфамида. Месна служит региональным детоксикантом, связываясь с токсичным метаболитом ифосфамида, главным образом против акролеина, посредством присоединения Михаэля с образованием менее вредного вещества [23]. Кроме того, сообщается, что N-ацетилцистеин обладает антиоксидантной активностью и улучшает истощение GSH в условиях окислительного стресса [24]. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить точную взаимосвязь между антидотом ифосфамида и механизмом, регулируемым в нефротоксических условиях. Мы можем предположить, что уменьшение токсичности ифосфамида с помощью месны или N-ацетилцистеина может сопровождаться улучшением Nrf-2-опосредованного окислительного ответа на стресс.

В этом исследовании сигналы, связанные с воспалением, обычно усиливались как в печени, так и в почках, что можно распознать по сигналам острой фазы при анализе канонического пути. Этот результат указывал на причастность воспалительной реакции к патофизиологии органной токсичности ифосфамида в обеих тканях, что дополнительно подтверждалось анализом предшествующих регуляторов. При анализе вышестоящих регуляторов гены, связанные с сигналами IRF7 и интерферона (IFN), включая USP18, RSAD2 и ISG15, были выбраны в качестве общих вышестоящих регуляторов в печени и почках. IRF7 является лимфоид-специфическим фактором, который конститутивно экспрессируется в цитоплазме иммунных клеток, а также может индуцироваться интерфероном I типа, вирусной инфекцией и внешними стимулами в различных клетках [25]. В предыдущем исследовании сообщалось о противоречивых про- или антионкогенных свойствах IRF7 в различных опухолевых клетках, а изменения экспрессии IRF7 были связаны с повреждением ДНК [26–28].

Сообщалось, что в дополнение к его важной регулирующей роли в противовирусных функциях IFN I типа IRF7 подавляет воспалительные реакции через сигнальный путь TLR4 [29]. Более того, Стаут-Дельгадо и соавт. [30] сообщили, что вызванное старением окислительное увеличение снижает активность IRF7, тогда как снижение стресса антиоксидантными агентами улучшает активность IRF7. В этом исследовании введение ифосфамида подавляло экспрессию вышестоящих регуляторов, и характер экспрессии был идентичным как в печени, так и в почках. Существующие изменения в экспрессии IRF7 могут быть связаны с воспалительной реакцией и свойством цитотоксического алкилирующего агента ифосфамида, что может указывать на то, что IRF7 является многообещающей мишенью для органной токсичности ифосфамида.

В этом исследовании мы обнаружили ген, который одинаково ингибировался как в печени, так и в почках после введения ифосфамида, но интерпретация его токсикологического значения была сосредоточена только на почках, что ограничивает текущее открытие. Кроме того, дальнейшие подтверждающие исследования, связанные с влиянием коммерчески доступного антидота ифосфамида на измененный в настоящее время ген, могут подтвердить настоящие выводы.

В заключение, повторное исследование токсичности (1 неделя) введения ифосфамида выявило необъективную нефротоксичность, а не гепатотоксичность. Кроме того, настоящие результаты свидетельствуют об индуцированном ифосфамидом механизме гепатотоксичности и нефротоксичности, который включает ингибирование IRF-7. Необходимы дальнейшие токсикогеномные исследования органов, связанных с иммунной системой, для выяснения системного токсикологического механизма ифосфамида и для подтверждения взаимосвязи между генной и органной токсичностью.

4. Материалы и методы

4.1. Изучение животных

Восьминедельных самцов крыс Sprague-Dawley (SD), не содержащих специфических патогенов (SD) (n=140), получали от Orient Bio Inc. (Соннам, Корея). Животных обследовали и адаптировали к условиям лабораторной среды за неделю до эксперимента. Всех животных содержали в пластиковых клетках в контролируемых лабораторных условиях (температура 23 ± 3 ◦ C, влажность 55 ± 10 процентов и 12-часовой цикл свет/темнота) с лабораторным кормом и водой без ограничений. Исследование на животных было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Корейского института токсикологии (Тэджон, Корея), и все процедуры проводились в соответствии с Руководством по тестированию для оценки безопасности лекарств Корейского управления по контролю за продуктами и лекарствами. Исследование на животных было разделено на три части: однократная доза (острая) и многократная доза (1 неделя и 4 недели) исследование токсичности при последовательном введении. Сорок крыс были случайным образом разделены на четыре группы (контроль, t1, t2 и t3) с использованием системы Path/Tox (версия 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA) в каждом исследовании токсичности.

4.2. Эксперимент по токсичности

Исследование токсичности было разделено на три части: исследования токсичности с однократной дозой (острая) и с двумя повторными дозами (последовательная доза в течение 1 недели или 4 недель). Для каждого исследования токсичности крыс случайным образом распределяли по соответствующим группам (контроль, доза 1, доза 2 и доза 3 для однократного и 4-недельного исследования токсичности; контроль, доза 1 и доза 2 для 1- недельное исследование токсичности) с использованием системы Path/Tox (версия 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA). В исследовании токсичности ифосфамид вводили внутрибрюшинно (IP), а контрольная группа получала дистиллированную воду (DW). Доза ифосфамида, использованная в исследовании токсичности, была следующей: исследование острой токсичности (12,5, 25 и 50 мг/кг), 1-недельное исследование токсичности (75 и 100 мг/кг МТ/день) и {{19 }}недельное исследование токсичности (25, 50 и 70 мг/кг МТ/день). Во время введения ежедневно регистрировали общие клинические симптомы, массу тела и смертность животных, и всех животных умерщвляли через 24 ч после последнего введения ифосфамида. Образцы крови собирали и помещали в микроцентрифужные пробирки и пробирки с ЭДТА-К2 для биохимического и гематологического анализа сыворотки соответственно. Ткани печени и почек фиксировали в формальдегиде и подвергали гистопатологическому анализу. Дополнительную иммуногистохимию, микрочиповый анализ и ОТ-ПЦР в реальном времени проводили на тканях печени и почек из исследования подострой токсичности (100 мг/кг массы тела/день).

4.3. Гематологический и биохимический анализ сыворотки

Стандартные гематологические тесты выполняли с использованием гематологической системы ADVIA 120 (Bayer, Fernwald, Германия). Использовали следующие показатели: количество лейкоцитов (WBC), количество эритроцитов (RBC), гематокрит (HCT), концентрацию гемоглобина, средний корпускулярный объем (MCV), средний корпускулярный гемоглобин (MCH), количество тромбоцитов (PLT), количество лимфоцитов (LYM), моноцитов (MON), нейтрофилов (NEU), базофилов (BAS), эозинофилов (EOS), крупных неокрашенных клеток (LUC) и ретикулоцитов (RET).

Биохимический анализ проводили с использованием автоматического анализатора (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Токио, Япония) с центрифугированной сывороткой. Основными биохимическими показателями были аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), азот крови в моче (АМК), креатинин (КРЕА), глюкоза (ГЛУ), общий холестерин (ОХО), альбумин/глобулиновое соотношение. (A/G), триглицериды (TG), общий билирубин (TB), гамма-глутамилтрансфераза (GGT), фосфолипиды (PL), кальций, хлорид, неорганический натрий, фосфор и калий.

4.4. Гистопатологическое и иммуногистохимическое исследование

Залитые парафином ткани делали срезы толщиной 5- мкм, окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и исследовали под микроскопом.

Ткань почки подвергали иммуногистохимии. Депарафинированные и промытые срезы предварительно инкубировали с 10% козьей сывороткой для предотвращения неспецифического окрашивания. Затем предметные стекла инкубировали в течение ночи с первичным антителом против KIM1 (1:750; Санта-Круз, Калифорния, США). После удаления первичных антител срезы обрабатывали набором VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Vector Laboratories, Питерборо, Великобритания) и исследовали экспрессию KIM1 под световым микроскопом.

4.5. Анализ микрочипов и анализ белок-белковых взаимодействий (PPI)

Печень и почки из группы 1-недель (100 мг/кг) гомогенизировали, а общую РНК экстрагировали с помощью мини-набора РНКазы (Qiagen). Синтез кДНК осуществляли с использованием набора для синтеза кДНК (Affymetrix, Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния, США) и подвергали анализу на микрочипах и PPI.

Анализ микроматриц выполняли с использованием Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 с GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, USA) и результаты обрабатывали с использованием программного обеспечения для анализа GeneSpring GX v13.0 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Дифференциально экспрессируемые гены (DEG), которые изменились более чем в 1,{6}} раз после введения ифосфамида, были отобраны с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным тестом Тьюки. Биологические функции и канонические пути выбранных DEG были проанализированы с использованием программного обеспечения Ingenuity Pathway Analysis (IPA, версия 9.0; Ingenuity Systems, Редвуд-Сити, Калифорния, США), и был проведен анализ вышестоящих регуляторов, чтобы идентифицировать вышестоящие регуляторы, которые могут несут ответственность за ДЭГ, возникающие в результате токсичности ифосфамида. Дополнительный сетевой анализ белок-белкового взаимодействия (PPI) DEG был выполнен с использованием программного обеспечения STRING (версия 10), и взаимодействие было подтверждено, когда средний показатель достоверности был выше 0,4. Белковое взаимодействие — это приблизительная вероятность существования предсказанной связи между двумя белками в пути Киотской энциклопедии генов и геномов.

4.6. Количественное исследование ОТ-ПЦР в реальном времени

Экспрессия общих генов-регуляторов в исследовании микрочипов была подтверждена с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Ген-специфические праймеры были получены от Bioneer (Тэджон, Корея). Последовательности праймеров были следующими: регуляторный фактор интерферона 7 (IRF7): прямой 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 и обратный 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; убиквитин-специфическая пептидаза 18 (USP18): прямая, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 и обратная 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; радикальный S-аденозилметиониновый домен, содержащий 2(RSAD2): прямой 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 и обратный 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; интерферон-стимулируемый ген 15 (ISG15): прямой, 5-AAGTCTCCAAGACCAATTC-3и обратный, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

Тотальную РНК обратно транскрибировали в кДНК с использованием SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, USA) и праймеров oligo-dT в соответствии с инструкциями производителя. Уровни экспрессии мРНК вышестоящих регуляторных генов анализировали с использованием системы ПЦР в реальном времени StepOnePlus (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США) с мастер-миксом SYBR Green (Applied Biosystems) в соответствии с протоколом производителя. Праймер рибосомной РНК 18S использовали в качестве внутреннего контроля, и результаты выражали как кратное изменение по сравнению с нормальной контрольной группой.

4.7. Статистический анализ

Данные были подвергнуты статистическому анализу с использованием нескольких методов сравнения. Когда критерий Бартлетта не показал значительных отклонений от однородности дисперсии, дисперсионный анализ (ANOVA) использовался для определения того, различались ли какие-либо из групповых средних на уровне значимости p < {{0}},05.="" кроме="" того,="" критерий="" даннета="" использовался="" для="" определения="" различий="" в="" данных="" между="" контрольной="" и="" лечебной="" группами,="" когда="" данные="" были="" признаны="" значимыми="" из="" теста="" anova.="" кроме="" того,="" когда="" по="" критерию="" бартлетта="" наблюдались="" значительные="" отклонения="" от="" однородности="" дисперсии,="" был="" проведен="" непараметрический="" сравнительный="" тест,="" критерий="" крускала-уоллиса="" (h),="" чтобы="" определить,="" различаются="" ли="" какие-либо="" из="" средних="" групп="" при="" p=""><0,05. когда="" в="" тесте="" крускала-уоллиса="" (h)="" наблюдалась="" значительная="" разница,="" был="" проведен="" ранговый="" подтест="" данна="" для="" количественной="" оценки="" конкретных="" пар="" групповых="" данных,="" которые="" значительно="" отличались="" от="" среднего.="" для="" сравнения="" пар="" данных="" (включая="" распространенность="" и="" процентное="" соотношение)="" был="" проведен="" точный="" критерий="" фишера.="" уровень="" вероятности="" был="" установлен="" на="" 1="" или="" 5="" процентов.="" статистический="" анализ="" проводили="" путем="" сравнения="" данных="" различных="" лечебных="" групп="" с="" данными="" контрольной="" группы="" с="" использованием="" программы="" path/tox="" (версия="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" лоуренсвилль,="" штат="" нью-джерси,="">

Заявление о доступности данных:

Данные содержатся в статье или Дополнительных материалах.

Конфликт интересов:

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

использованная литература

1. Пальмерини, Э.; Сетола, Э.; Гриньяни, Г.; Д'Амброзио, Л.; Командоне, А .; Риги, А .; Лонги, А .; Чезари, М .; Пайоли, А .; Хаким, Р .; и другие. Высокие дозы ифосфамида у пациентов с рецидивирующей и нерезектабельной остеосаркомой высокой степени: ретроспективная серия. Cells 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Кластерский Дж. Побочные эффекты ифосфамида. Онкология 2003, 65, 7–10. [Перекрестная ссылка]
3. Спрангерс, Б.; Лапман, С. Болезни роста ифосфамида. клин. Kidney J. 2020, 13, 500–503. [Перекрестная ссылка]
4. Элиас, А. Д.; Аяш, ЖЖ; Уиллер, К.; Шварц, Г.; Теплер, И.; Макколи, М .; Мазанет, Р.; Шниппер, Л.; Фрей, Э., 3-й; Антман, К. Х. Высокие дозы ифосфамида/карбоплатина/этопозида с поддержкой аутологичных гемопоэтических стволовых клеток: безопасность и будущие направления. Семин. Онкол. 1994, 21, 83–85. [В паблике]
5. Молленкопф, А.; Дюбуа, А .; Meerpohl, HG Последовательное течение и перспективное лечение полиорганной токсичности, вызванной ифосфамидом. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525–528. [Перекрестная ссылка]
6. Алекса К.; Матселл, Д.; Краус, К .; Гелбойн, Х .; Ито, С .; Корен, Г. Цитохром P450 3A и 2B6 в развивающейся почке: значение нефротоксичности ифосфамида. Педиатр. Нефрол. 2005, 20, 872–885. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
7. Ловенберг, Д.; Торн, CF; Деста, З .; Флокхарт, Д.А.; Альтман, РБ; Кляйн, Т. Е. Резюме PharmGKB: Пути применения ифосфамида, фармакокинетика и фармакодинамика. Фармакогенет. Геном. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. Макаллистер, С.Л.; Мартин-Бризак, Н.; Лау, В.; Ян, К .; О'Брайен, П.Дж. Акролеин и хлорацетальдегид: исследование клеточных и бесклеточных биомаркеров токсичности. хим. биол. Взаимодействовать. 2013, 202, 259–266. [Перекрестная ссылка]
9. Ким, Дж.; Шин М. Интегративная модель предсказания полиорганной токсичности, вызванной лекарствами, с использованием данных экспрессии генов. БМК Биоинформ. 2014, 15, С2. [Перекрестная ссылка]
10. Александр-Данн, Б.; Прутяну, Л.Л.; Ортон, Э.; Шарма, Н.; Бериндан-Неаго, И.; Модос, Д.; Бендер, А. Развитие токсикогеномики: понимание и прогнозирование токсичности, вызванной соединением, на основе данных об экспрессии генов. Мол. Омикс 2018, 14, 218–236. [Перекрестная ссылка]
11. Ан, Ю.Р.; Ким, JY; Ким, Ю.С. Построение прогностической модели для оценки полиорганной токсичности. Мол. Клеточный токсикол. 2016, 12, 1–6. [Перекрестная ссылка]
12. Бинотто, Г.; Трентин, Л.; Semenzato, G. Ифосфамид и циклофосфамид: влияние на иммунный надзор. Онкология 2003, 65, 17–20. [Перекрестная ссылка]
13. Швердт, Г.; Горджани, Н .; Бенешич, А .; Фрейдингер, Р.; Воллни, Б .; Кирхгоф, А .; Гекле, М. Индуцированная хлорацетальдегидом и акролеином гибель клеток проксимальных канальцев человека. Педиатр. Нефрол. 2006, 21, 60–67. [Перекрестная ссылка]
14. Энсерге, Г.; Паллет, Н.; Джоли, Д.; Леви, К.; Шове, С.; Тривин, К.; Аугусто, Дж. Ф.; Буде, Р .; Абудагга, Х .; Тушар, Г.; и другие. Нефротоксичность ифосфамида у взрослых пациентов. клин. Kidney J. 2020, 13, 660–665. [Перекрестная ссылка]
15. Дешан, КЛ; Брогден, Р.Н.; Пилкингтон, Т.; Фолдс, Д. Ифосфамид/месна. Обзор его противоопухолевой активности, фармакокинетических свойств и терапевтической эффективности при раке. Наркотики 1991, 42, 428–467. [Перекрестная ссылка]
16. Пронк, Л.С.; Шрийверс, Д.; Шелленс, JHM; Де Брюйн, EA; Посадка, А.; Лоччи-Тонелли, Д.; Гроулт, В.; Вервей, Дж.; Van Oosterom, AT Исследование I фазы по доцетакселу и ифосфамиду у пациентов с запущенными солидными опухолями. бр. Дж. Рак. 1998, 77, 153–158. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
17. Скиннер Р. Хроническая нефротоксичность ифосфамида у детей. Мед. Педиатр Онкол. 2003, 41, 190–197. [Перекрестная ссылка]
18. Шарп П.; Вилано, Дж. С. Лабораторная крыса; CRC Press: Бока-Ратон, Флорида, США, 2012 г.
19. Ченг, MC; Джонс, Р.Л.; Джадсон И. Острая гепатотоксичность ифосфамида при лечении саркомы: клинический случай. Дж. Мед. Case Rep. 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Цуй, Ю.; Paules, RS Использование транскриптомики для понимания механизмов лекарственной токсичности. Фармакогеномика 2010, 11, 573–585. [Перекрестная ссылка]
21. Сноубер, Л.С.; Жак, С .; Монж, М.; Легале, К.; Леклерк, Э. Транскриптомный анализ действия ифосфамида на клетки MDCK, культивируемые в микрожидкостных биочипах. Геномика 2012, 100, 27–34. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
22. Дирвен, HA; Мегенс, Л.; Оудсхорн, MJ; Дингеманс, Массачусетс; ван Оммен, Б.; Ван Бладерен, П.Дж. Конъюгация глутатиона цитостатического препарата ифосфамида и роль глутатион-S-трансфераз человека. хим. рез. Токсикол. 1995, 8, 979–986. [Перекрестная ссылка]
23. Джилани Р.; Джаханбахш, С .; Кохан-Гадр, HR; Тхакур, М .; Хан, С .; Альдахери, SR; Ян, З .; Андреана, П .; Моррис, Р.; Abu-Soud, HM Mesna (2-меркаптоэтансульфонат натрия) действует как регулятор миелопероксидазы. Свободный Радик. биол. Мед. 2017, 110, 54–62. [Перекрестная ссылка]

24. Алнахди, А.; Джон, А .; Raza, H. N-ацетилцистеин ослабляет окислительный стресс и глутатион-зависимый окислительно-восстановительный дисбаланс, вызванный обработкой высоким содержанием глюкозы/пальмитиновой кислоты в Rin-5F-клетках поджелудочной железы. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [Перекрестная ссылка]

25. Чжан, Л.; Pagano, JS IRF-7, новый регуляторный фактор интерферона, связанный с латентностью вируса Эпштейна-Барр. Мол. Клеточная биол. 1997, 17, 5748–5757. [Перекрестная ссылка]
26. Пагано, Дж. С. Вирусы и лимфомы. Н. англ. Дж. Мед. 2002, 347, 78–79. [Перекрестная ссылка]
27. Ромье-Мурез, Р.; Солис, М.; Нардин, А .; Губо, Д.; Барон-Бодо, В.; Лин, Р .; Мэсси, Б.; Сальседо, М .; Хискотт, Дж. Различная роль регуляторного фактора IFN (IRF)-3 и IRF-7 в активации противоопухолевых свойств макрофагов человека. Рак Рез. 2006, 66, 10576–10585. [Перекрестная ссылка]
28. Нин, С.; Пагано, Дж. С.; Барбер, GN IRF7: активация, регулирование, модификация и функция. Гены Иммун. 2011, 12, 399–414. [Перекрестная ссылка]
29. Чен, PG; Гуань, Ю.Дж.; Жа, гроссмейстер; Цзяо, XQ; Чжу, ХС; Чжан, CY; Ван, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 ослабляет воспалительные реакции через сигнальный путь TLR4. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Стаут-Дельгадо, Х.В.; Ян, X .; Уокер, WE; Тесар, Б.М.; Гольдштейн, Д.Р. Старение нарушает активацию регуляторного фактора 7 IFN в плазмоцитоидных дендритных клетках во время активации TLR9. Дж. Иммунол. рез. 2008, 181, 6747–6756. [Перекрестная ссылка]