Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Нажмите здесь для получения информации о части II (Введение, материалы и методы) этой статьи.

Почти одноклеточное протеомное профилирование проксимальных канальцев и клубочков нормальной почки человека

Тара К. Сигдель¹, Пол Д. Пьеховски², Судешна Рой¹, Джулиана Либерто¹, Джошуа Р. Хансен², Адам С. Свенсен², Жуй Чжао³, Ин Чжу³, Приянка Рашми¹, Эндрю Шредер¹, Изабелла Дамм¹, Свастика Сур¹, Цзинхуэй Луо4, Инбао Ян4, Вэй-Цзюнь Цянь²* и Минни М. Сарвал¹* для Консорциума Проекта точной медицины почек (KPMP)

¹Отдел мультиорганной трансплантации, кафедра хирургии, Калифорнийский университет, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Калифорния, США

²Тихоокеанская северо-западная национальная лаборатория, отдел биологических наук, Ричленд, Вашингтон, США

³Лаборатория молекулярных наук об окружающей среде, Тихоокеанская северо-западная национальная лаборатория, Ричленд, Вашингтон, США

⁴Кафедра патологии, Мичиганский университет, Анн-Арбор, Мичиган, США

Ключевые слова:клубочек, масс-спектрометрия, анализ одиночных клеток, протеомика,почка

Молекулярные оценки на уровне отдельных клеток могут ускорить биологические исследования, предоставляя подробные оценки клеточной организации и гетерогенности тканей как при заболеваниях, так и при нормальных условиях. Человекпочкаимеет сложные многоклеточные состояния с различной функциональностью, большая часть которых теперь может быть полностью использована с последними технологическими достижениями в протеомике тканей почти на уровне одной клетки. Мы обсудим основные шаги в первом применении этого метода протеомики, основанного на масс-спектрометрии (МС), для анализа подразделов нормального человеческого тела.почка, в рамках Проекта точной медицины почек (KPMP). Используя примерно 30–40 клеток почки, полученных с помощью лазера, мы идентифицировали более 2500 белков человека, обладающих специфичностью кпроксимальный трубчатый(PT; n=25 белков) и клубочковых (Glom; n=67 белков) областейпочкаи их уникальные метаболические функции. Это экспериментальное исследование представляет собой дорожную карту для применения нашего рабочего процесса протеомики, близкого к одиночной клетке, для анализа других почечных микрокомпартментов в более широком масштабе, чтобы распутать нарушения почечной субклеточной функции в нормальной почке, а также различные этиологии острых и хроническихБолезнь почек.

цистанхе может улучшить функцию почек

Введение

Недавние достижения в молекулярном профилировании, в частности анализе транскрипции на уровне отдельных клеток, могут выявить популяции редких клеток в гетерогенных клинических тканях, что способствует нашему пониманию биологии почек и ее молекулярных процессов (1–7). Существует неудовлетворенная потребность в разработке методов, которые могут предоставить исчерпывающую биологическую информацию на уровнях РНК и ДНК, а также позволяют проводить анализ протеомных тканей одной клетки.

Протеомные технологии, в отличие от геномики, могут предоставлять функциональную информацию о клеточных состояниях и регуляторных сетях (2). Технологическая проблема протеомики на основе масс-спектроскопии (МС) заключается в ограничении исходного материала. В отличие от транскриптомики, протеомика не допускает молекулярной амплификации. Этот факт привел к существенным усилиям по повышению аналитической чувствительности протеомики на основе МС, включая миниатюризацию технологии и более высокую эффективность источника ионизации электрораспылением (8, 9), так что теперь аналитическая чувствительность достаточна для обнаружения белков в отдельных клетках млекопитающих. клетки. Несмотря на высокую аналитическую чувствительность, протеомные приложения к малым объемам образцов создают дополнительные проблемы, такие как неспецифическая адсорбция белков и пептидов на поверхности реакционных пробирок, неэффективная кинетика расщепления, необходимость очистки и проблемы с доставкой. Наша группа недавно сообщила о методе почти одноклеточной протеомики (nscProteomics) в клетках HeLa, который обеспечивает высокоинновационную и чувствительную технологию для протеомных измерений образцов с субнанограммовым количеством белка из небольшого числа клеток (10). Этот метод требует специализированного оборудования для обработки образцов, и его трудно передать другим исследовательским лабораториям в его нынешнем состоянии развития. Обработка человекапочкаткани через этот трубопровод потребовали пристального внимания к разработке протокола, чтобы оптимизировать сохранение тканей и захват клеток.

В этом исследовании мы сосредоточились на предоставлении дорожной карты для успешного измерения протеомного опроса различных субкомпартментов мозга.почка, почти на уровне отдельных клеток, со следующими результатами: (i) оценка оптимального сбора и хранения почечной ткани для nscProteomics; (ii) определение соответствующего эталонного стандарта для nscProteomics; (iii) Оптимизация толщины ткани почки для микродиссекции с лазерным захватом (LCM); iv) оптимизация параметров LCM; (v) Описание метода nscProteomics с использованием полностью автоматизированного микро-метода POTS на основе ЖХ-МС (μPOTS; обработка в одном сосуде для следовых образцов) (11); (vi) Анализ данных для nscProteomics.

Для достижения вышеуказанных задач мы обработали 11 уникальных человеческихпочкабиопсии и разработали протоколы и методологии для сбора, обработки и исследования протеомной экспрессии человеческогопочкаобразцы по µPOTS. В сочетании с высокочувствительной ЖХ-МС мы демонстрируем полностью автоматизированный метод μPOTS, который обеспечивает воспроизводимость и обеспечивает количественные протеомные измерения ~ 3, 000 белков от 10 до 100 лазерного захвата микрорассеченных (LCM) клеток почки, уровень охвата, достигнутый ранее только для тысяч ячеек (12–17). Это исследование поможет для молекулярной характеристики тканевой клеточной гетерогенности и патологии в биоптатах почек у пациентов с различными причинами острого и хронического заболевания почек. Эта уникальная технология может раскрыть протеомную гетерогенность и уникальные белковые маркеры в различныхпочкаподтипы и подструктуры заболевания, которые будут коррелировать с патогенезом заболевания, прогнозом и стратификацией риска. Результаты исследования представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Рабочий процесс почти одноклеточной протеомики (nscProteomics) оптимизирован для обработки данных человека.почкаткани. Рабочий процесс включает определение оптимальныхпочкасбор и хранение тканей, контроль качества лазерного захвата, микродиссекция, создание метода nscProteomics для клеток почки.

Экспериментальные процедуры

Дизайн исследования

Схематическое изображение протеомных исследований, проведенных на 11 уникальных нормальных человеческихпочкипоказано на рисунке 2А. В общей сложности было выполнено 28 масс-спектрометрических (МС) масс-спектрометрических (МС) анализов объемных и лазерных микродиссекции (LCM) nscProteomics на парных гломерулярных (Glom) и проксимальных извитых трубчатых (PT) срезах. Ткани из первых двухпочкибыли сохранены в виде FFPE и в смеси с оптимальной температурой резки (OCT). Ткани почек из еще 9 почек были обработаны только в ОКТ (рис. 2А).

Рисунок 2. (A) Резюме образцов исследования и анализов. (B) График контроля качества для воспроизводимости процесса с использованием ткани ОКТ. Различия спектрального подсчета между белками для 2 отдельных прогонов с использованием ткани ОКТ были нанесены на график в сравнении со средним спектральным подсчетом белка для 1257 белков. На графике синяя линия изображает среднюю разницу; красная и зеленая линии обозначают пределы 2 SD и 3 SD соответственно. 97,96% белков находятся в пределах расчетного предела воспроизводимости 13,52, что указывает на высокую степень воспроизводимости. Также видно, что межсерийная вариабельность процесса с участием ткани ОКТ ниже, чем у процесса с участием ткани FFPE (расчетный предел воспроизводимости: 24,43). (C) Сравнение спектрального распределения 374 распространенных белков в OCT и FFPE. Большее количество белков из ткани ОКТ демонстрирует высокие спектральные значения, в то время как более высокое преобладание низких спектральных значений наблюдается для белков из ткани FFPE. (D) Сравнение спектрального распределения 76 уникальных белков в FFPE и 244 уникальных белков в OCT. Более высокое преобладание белков с низким спектральным счетом наблюдается в ткани ОКТ. Это может указывать на то, что метод ОКТ тканей лучше подходит для обнаружения белков с низким содержанием в текущем сценарии. Коэффициент корреляции между белками, идентифицированными из 2 замороженных тканей ОКТ, составил 0,96 (P <>

Получение образца ткани почки

Человекткани почекбыли собраны в общей сложности из 11 деидентифицированных частичных нефрэктомий, полученных из Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF) и Мичиганского университета (UM) с одобрением IRB в рамках пилотного технико-экономического обоснования технологии в NIH Kidney Precision Medicine. Проект (КПМП). Только здоровая областьпочкакак определено обученным патологом, использовалось для этой цели. Образцы были анонимными с единственной оговоркой, что ткани были взяты у взрослых. Чтобы оценить оптимальный протокол сбора образцов для технологии, первоначально ~1{9}}0 мг ткани из 2 почек разделяли поровну и либо готовили в виде срезов ткани, фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE), либо замораживали в Состав OCT Tissue-Plus™ (Fisher Scientific). Из каждого блока ОКТ с помощью криомикротома вырезали один 5 мкм и три последовательных среза толщиной 10 мкм и помещали на предметные стекла с мембраной из полиэтилентерефталата (ПЭТ) 1,0 (Zeiss) для клубочкового ипроксимальный каналецрассечение. Срез толщиной 5 мкм окрашивали H&E для визуализации основных гистологических структур. Остальные срезы толщиной 10 мкм оставляли неокрашенными. Все слайды хранились при температуре -80 градусов до вскрытия.

Цистанхе для улучшения почечной дисфункции

Оценка влияния транспортировки и обработки тканей на протеомный выход

Чтобы оценить влияние задержек на протеомный анализ замороженной ткани ОКТ,почкаtissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 ч уходят, а перерабатываются во втором центре, и наоборот. Массовая протеомика была выполнена на двух уникальныхпочки(почка № 3, № 4), закупленные в Мичиганском университете и отправленные в 2 разных места (Университет штата Огайо и Калифорнийский университет в Сан-Франциско) для анализа МС с использованием одного и того же протокола и параметров МС на обоих сайтах. Затем результаты МС сравнивали между двумя сайтами.

Экстракция белка и осаждение

Это было проведено как для ОКТ, так и для методов подготовки ткани FFPE для выбора оптимального метода протеомики ткани. Ткань ОКТ разрезали на срезы толщиной 10 мкм с помощью криомикротома. Для отбора минимального количества ткани, необходимого для экстракции белка при МС, три локона (срез, который помещают в пробирку Эппендорфа, а не раскладывают на предметном стекле) и 5 ​​роллов замороженной ткани вырезали, оттаивали и переносили в микроцентрифужные пробирки. содержащий 5 мм шарик из нержавеющей стали (Qiagen), обработанный буфером для лизиса клеток млекопитающих (включая раствор ингибитора нуклеазы и протеазы Benzonase®; Qiagen) и гомогенизированный в TissueLyser LT (Qiagen) при 50 об/с в течение 3 мин. Концентрацию белка определяли количественно (анализ Бредфорда; Thermo Scientific) и хранили при температуре -20 градусов до использования. Ткань хранится для<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

Трипсиновое пищеварение

Приблизительно 150 мкг общего белка (~15 процентов доступного количества) подвергалось воздействию восстановителей (200 мМ ДТТ и 100 мМ Трис-HCl) и алкилирующих реагентов (200 мМ йодацетамида и 100 мМ Трис-HCl). и затем разбавляли водой, свободной от РНКазы/ДНКазы, для снижения концентрации мочевины до 0,6 М. Добавляли четыре мкг свиного трипсина (Sigma) и образец переваривали при 37°С. Концентрацию белка определяли количественно (анализ Бредфорда; ThermoScientific) и использовали 10 мкг белка для MS.

MS для объемной протеомики для оценки оптимального метода обработки почечной ткани

Смесь триптических пептидов подкисляли муравьиной кислотой, очищали с помощью колонок C18 Monospin и анализировали на приборе Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). МС/МС выполняли с использованием диссоциации C-ловушки с более высокой энергией (HCD). Масс-спектры были проанализированы с использованием Byonic v2.14.27 (Protein Metrics) с допусками по массе 12 частей на миллион. Допускались различные посттрансляционные модификации, включая окисление, метилирование, карбамилирование и фосфорилирование. Белки были ограничены теми, у кого показатель ложных открытий (FDR) был выше 1%. Сравнение содержания белка и данных МС было сделано для выбора оптимального метода дляпочкасбор тканей между FFPE и OCT.

Лазерный захват Микродиссекция

Неокрашенные срезы толщиной 5, 10 и 20 мкМ, закрепленные на ПЭТ-препаратах, помещали на предметный столик системы лазерной микродиссекции Zeiss PALM MicroBeam (Zeiss) для проверки оптимальной толщины среза. Клубочковая ипроксимальный каналецобласти были выбраны с помощью инструмента от руки, и рассечение было выполнено с объективом 10X. Были захвачены срезы площадью ~ 4580 мкм2 и толщиной 10 мкм, что соответствовало ~ 40 гломерулярным клеткам на основе ранее опубликованной формулы для оценки гломерулярных клеток у здорового взрослого человека.почка(18). Дляпроксимальный трубчатыйклеток мы захватили ~2900 мкм2проксимальный трубчатыйклеток, что составило ~36 клеток. Вырезанные срезы катапультировали в непрозрачный клейкий колпачок объемом 200 мкл (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) и хранили при -80°С.

Почти одноклеточная протеомика (nscProteomics)

Для солюбилизации белков, собранных в улавливающих колпачках с помощью LCM, каплю 10 мкл 0,1% ДДМ 50 мМ Трис, рН 8, добавляли непосредственно в колпачок. Образцы инкубировали в течение 30 минут при 37 градусах в термомиксере Eppendorf ThermoTop для уменьшения испарения с последующим центрифугированием при 2,000 × g в течение 1 минуты для переноса лизата во флакон. Белки восстанавливали 5 мМ дитиотреитола и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Алкилирование проводили в 10 мМ йодацетамида с инкубацией 45 мин в темноте при 25°С. Затем добавляли аликвоту 10 нг Ls-C с последующей 3-часовой инкубацией при 25°С. Затем добавляли 10 нг аликвоту трипсина с последующим расщеплением в течение ночи при 25°С. Расщепленные пептиды смешивали с аликвотой 15 мкл воды с сопротивлением 18 МОм.

Платформа ЖХ-МС для сверхмалых образцов

Образцы пептидов (25 мкл) разделяли с использованием колонки длиной 60 см с внутренним диаметром 50 мкм и встроенным эмиттером (New Objective). Колонки были заполнены средой Waters BEH диаметром 1,7 мкм. Градиент 100-мин создавался с использованием нанонасоса Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific). Эта система была соединена с масс-спектрометром QExactive Plus (Thermo Scientific). Масс-спектры были собраны в диапазоне от 300 до 1800 m/z с использованием 12 лучших методов сбора данных, зависящих от данных. Спектры MS1 были собраны с разрешением по массе 35К, а спектры MS2 с разрешением 17,5К. Максимальное время ИТ 100 мс использовалось для увеличения идентификации ионов с низким содержанием.

Извлечение протеомных данных

Все необработанные файлы были обработаны с помощью MaxQuant (версия 1.5.3.30) для обнаружения признаков, поиска в базе данных и количественного определения белков/пептидов (19) с использованием настроек, описанных ранее (10). Поиск тандемных масс-спектров проводился в базе данных человека UniProtKB/Swiss-Prot (загружена 29 декабря 2018 г. и содержит 20 417 проверенных записей). Данные протеомики MS для nscProteomics были переданы консорциуму ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE (20) с идентификатором набора данных PXD015058 и 10.6019/PXD015058.

Анализ данных

Данные МС были получены в результате прогонов, выполненных в PNNL (nscProteomics) и Стэнфордском университете (массовая протеомика). Для объемной протеомики. Для выбора оптимальных значений использовались следующие статистические методы.почкаметод сбора тканей, либо замороженных в OCT, либо обработанных как FFPE, по оценке количественной протеомики объема ткани, (i) рассчитывали выход белка/мг эквивалентной исходной ткани; (ii) Воспроизводимость МС была проверена на выходе МС из срезов FFPE и ОКТ из каждой из 2 почек, приготовленных одним и тем же человеком с использованием одного и того же протокола, проанализированных на одном и том же приборе для МС с использованием установленного протокола с интервалом в несколько дней (21). Предел воспроизводимости (22) использовался для обеспечения приблизительной границы различий в измерениях между последовательными запусками одного процесса, а также для оценки точности для сравнения между процессами. Рассчитывали коэффициент корреляции, который обеспечивал степень совпадения между последовательными прогонами (с использованием одной и той же ткани); (iii) Содержание белка и распределение размеров пептидных фрагментов были рассчитаны для оценки вариаций, возникающих в результате деградации белка, образования поперечных связей из-за формалина и т. д. Другие аспекты контроля качества включали (iv) оценку дрейфа процесса в повторах и во времени с использованием общего пулапочкассылка и (v) расчет погрешности. Строгий количественный анализ и идентификация уникальных белков использовали данные только для белков со спектральным числом больше или равным 5 (23). Точный критерий Фишера использовали для оценки обогащения общих и уникальных белков, картированных между двумя нормальными человеческими почками (№1 и №2). На основании приведенного выше анализа (см. результаты) замороженная ткань ОКТ была выбрана в качестве метода сбора для всех последующих анализов.

Следующим шагом анализа данных была идентификация, количественная оценка и проверка наборов белков, обогащенных или специфичных для ~ 10–100 клеток, полученных из каждого из двух выбранныхпочкасубкомпартменты — регионы Glom и PT, полученные из одного и того жепочка, навалом и LCM замороженного ОСТпочечная ткань(n=9; почки № 3–11) под управлением nscProteomics.

Для решения проблем с отсутствующими/неполными данными был принят {{0}}шаговый полуконсервативный подход к фильтрации, а G-тест (24) использовался для определения того, были ли данные пропущены случайным образом (MAR). или пропавших без вести не случайно (MNAR). Дополнительную оценку достоверности данных проводили путем строгого отбора белков, наблюдаемых в более чем или равном 50 процентам всех образцов. Т-критерий использовали для выявления значительного обогащения белков в гломминге или PT, и применяли коррекцию множественного тестирования (FDR Бенджамини-Хохберга) с порогом значимости 0,1. Для целей анализа данные МС относительной интенсивности (преобразованные log 2), полученные из Glom, PT и объемных фракций из одногопочкасчитались парными. Мы идентифицировали белки, обогащенные Glom (с низкими уровнями в PT/массе) и уникальные для Glom (отсутствующие в PT), а также белки, обогащенные PT (с низкими уровнями в Glom/массе) и уникальные для PT (отсутствующие в Glom). . Анализ обогащения проводился только для данных без пропущенных значений в каждой группе для повышения достоверности. Корреляцию между значениями распространенности общих белков использовали для оценки степени соответствия между обогащенными белками субкомпартментов между отдельными запусками одного и того же эксперимента. Мы также выполнили перекрестную проверку значительно обогащенных белков в каждом компартменте путем анализа этих сравнений из уникальных наборов образцов между двумя разными запусками, запуском 1 и запуском 2. Биологическая проверка наборов белков с обогащенным субкомпартментом (Glom и PT) была проведена запрос, могут ли известные белки, обогащенные субкомпартментами, быть локализованы обратно в их конкретные области в общедоступных данных из Атласа белков человека (https://www.proteinatlas.org/) (25).

Цистанхе при симптомах почечной недостаточности

Сравнение/интеграция кросс-омных данных

Для оценки согласованности экспрессии белка на уровне РНК использовали данные, полученные в результате секвенирования одноклеточной РНК (scRNA Seq), выполненного на 10 нативных нефрэктомиях, 9 из которых перекрывались спочкииспользуется в nscProteomics. Для этого использовалась платформа 10x Genomics Chromium с химией v3 с использованием метода, оптимизированного в лаборатории Sarwal в качестве сайта исследования тканей (TIS) консорциума KPMP (рукопись с подробным описанием метода и результатов находится в стадии подготовки). Для этого перекрестного анализа мы использовали данные транскриптома 45 411 человек.почкаклетки разделены на девять основных типов клеток: подоциты, мезангиальные клетки, эндотелий клубочков, строму/интерстиций, иммунные клетки,проксимальный каналец, толстая восходящая часть петли Генле, дистальный/соединительный каналец и собирательная трубочка. Анализ одноклеточных данных был выполнен с использованием пакета Seurat R версии 2.3.4. Более глубокий анализ этих данных находится в разработке (26).

Из: «Профилирование почти одноклеточной протеомикиПроксимальный трубчатыйа такжеКлубочекнормального человекаПочкаТара К. Сигдел1, Пол Д. Пьеховски2, Судешна Рой1, Джулиан Либерто1, Джошуа Р. Хансен2, Адам С. Свенсен2, Руй Чжао3, Ин Чжу3, Приянка Рашми1, Эндрю Шредер1, Изабелла Дамм1, Свастика Сур1, Цзинхуэй Луо4, Инбао Yang4, Wei-Jun Qian2* и Minnie M. Sarwal1* заПочкаКонсорциум проектов точной медицины (KPMP)

---ОРИГИНАЛЬНАЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ статья Front. Мед., 17 сентября 2020 г. |