Продольное иммунное профилирование выявило доминантные эпитопы, опосредующие долгосрочный гуморальный иммунитет у лиц, выздоравливающих от COVID-19

Фон: Коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) — высокопатогенный и заразный коронавирус, вызвавший глобальную пандемию, унесшую на сегодняшний день 5,2 миллиона жизней. Вопросы, касающиеся серологических особенностей долговременного иммунитета, особенно доминантных эпитопов, опосредующих стойкий гуморальный ответ после заражения SARS-CoV-2, еще предстоит выяснить.

Цель: Мы стремились проанализировать кинетику и продолжительность иммунных реакций у пациентов с коронавирусной болезнью 2019 года (COVID-19), а также эпитопы, ответственные за устойчивый долговременный гуморальный иммунитет против SARS-CoV-2.

Методы: Мы оценили иммунную динамику SARS-CoV-2 в период от 180 до 220 дней после начала заболевания у 31 человека, у которого преимущественно наблюдались умеренные симптомы COVID-19, а затем выполнили полнопротеомное профилирование доминантных эпитопов, ответственных за стойкие гуморальные иммунные реакции.

Полученные результаты: Продольный анализ выявил устойчивые антитела, специфичные к спайковому белку SARS-CoV-2, и нейтрализующие антитела у пациентов с COVID-19, а также активацию выработки цитокинов на ранних стадиях после заражения SARS-CoV-2. Было показано, что высокореактивные эпитопы, способные опосредовать долгосрочные реакции антител, локализуются в белках спайка и ORF1ab. Ключевые эпитопы шиповидного белка SARS-CoV-2 были картированы в N-концевом домене субъединицы S1 и субъединицы S2 с различной степенью гомологии последовательностей среди эндемичных коронавирусов человека и высокой идентичностью последовательностей между ранними SARS-CoV и высокой идентичностью последовательностей между ранними SARS-CoV и субъединицами S2. CoV-2 (Ухань-Ху- 1) и текущие циркулирующие варианты.

Преимущества добавки цистанхе – как укрепить иммунную систему

Заключение: Инфекция SARS-CoV-2 индуцирует стойкий гуморальный иммунитет у лиц, выздоравливающих от COVID-19, воздействуя на доминантные эпитопы, расположенные в шипах, и белки ORF1ab, которые опосредуют долгосрочные иммунные реакции. Наши результаты открывают путь к содействию рациональному дизайну вакцин и разработке средств диагностики. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)

Ключевые слова:

SARS-CoV-2, COVID-19, долговременный иммунный ответ, гуморальный иммунитет, полнопротеомный пептидный микрочип, доминантный эпитоп

Коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV- 2), возбудитель продолжающейся пандемии коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19), принадлежит к роду Betacoronavirus, который включает еще 2 известных высокопатогенных человека. Коронавирусы: коронавирусы тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) и ближневосточного респираторного синдрома (MERS).1 С момента появления первого зарегистрированного случая в конце декабря 2019 года в результате заражения SARS-CoV-2 заразилось более 263 миллионов человек. подтвержденных случаев и 5,2 миллиона смертей во всем мире по состоянию на ноябрь 2021 года, что затронуло 220 стран и регионов на 5 континентах.2 После заражения клинические проявления широко варьируются, включая бессимптомные инфекции, легкие или умеренные симптомы или даже опасную для жизни тяжелую пневмонию.3 Несмотря на Несмотря на наличие нескольких типов подходов к вакцинации, многие страны все еще пытаются сдержать новые волны инфекций, при этом появляются варианты вируса, которые, по-видимому, демонстрируют повышенную трансмиссивность и устойчивость к противовирусным иммунным реакциям. Эффективный гуморальный иммунный ответ, опосредованный нейтрализующими антителами, должен обладать мощным и незаменимым адаптивным иммунитетом для блокирования инфекции и элиминации вирусных патогенов. После заражения SARS-CoV-2 высокий уровень (более 90%) устойчивой сероконверсии среди инфицированных лиц наблюдался через 7–14 дней после начала заболевания.4-6 Выработка антигенспецифических IgA, IgG, и IgM, распознающие белок-шип (S) и белок нуклеокапсида (N) SARS-CoV-2, обнаруживались во время острой фазы заболевания и на ранней стадии выздоровления.4,5,7 Количество нейтрализующих антител, по-видимому, быть связаны с возрастом, симптоматической инфекцией и тяжестью заболевания. У пожилых пациентов и лиц с тяжелыми симптомами COVID-19, как правило, развиваются более высокие уровни нейтрализующих антител.4,8-10 Несколько исследований, посвященных продолжительности реакции антител, показали, что, несмотря на потерю реактивности сыворотки/плазмы к вирусу, антигенов и снижением титров нейтрализующих антител с течением времени в некоторых симптоматических случаях COVID-19, устойчивый уровень общего долговременного гуморального иммунитета наблюдался в течение 8–12 месяцев после заражения у выздоравливающих людей-19 .10-13 Кроме того, количество В-клеток памяти, специфичных к антигену SARS-CoV-2, оставалось стабильным в течение как минимум 6–12 месяцев,12,13 наряду с постоянным отбором и накоплением клонов В-клеток, экспрессирующих нейтрализующие антитела,12,14 что указывает на сохранение стойкого гуморального иммунитета после заражения SARSCoV-2.

Преимущества добавки цистанхе – повышение иммунитета

Нейтрализующие антитела играют фундаментальную роль в защите организма хозяина от вирусной инфекции. Была идентифицирована группа высокоэффективных моноклональных антител к SARS-CoV-2,15-17 в первую очередь нацеленных на эпитопы, расположенные в рецептор-связывающем домене белка S, который собирается в тримеры на поверхности вириона и облегчает проникновение вируса. и слияние при вовлечении рецептора ангиотензинпревращающего фермента 2.18 Другие области белка S, включая N-концевой домен (NTD) субъединицы S1 и субъединицы S2, также содержат иммуногенные эпитопы, которые способны индуцировать нейтрализующие антитела.16 ,19,20 Помимо нейтрализации, антитела SARS-CoV-2 могут обеспечивать защиту in vivo посредством Fc-опосредованных эффекторных функций, таких как антителозависимый фагоцитоз, запускаемый естественными клетками-киллерами, и антителозависимая цитотоксичность моноцитов или макрофагов. 21,22 Помимо борьбы с вирусными инфекциями, антитела, вырабатываемые в результате естественной инфекции или вакцинации, могут способствовать патогенезу вируса либо за счет усиления активации воспаления, либо за счет усиления инфекционности вируса за счет образования иммунного комплекса антиген/антитело, либо за счет Fc-зависимых функций,23-25 хотя усиленная вирусная инфекция не наблюдалась в контексте SARS-CoV-2 in vivo. Эти различные роли ответов антител требуют систематической характеристики эпитопов SARSCoV-2, а также свойств антител длительного действия, нацеленных на нейтрализующие или ненейтрализующие эпитопы. Несмотря на недавний прогресс в изучении кинетики и продолжительности гуморального иммунного ответа после заражения SARS-CoV-2, продольный анализ выраженных эпитопов, которые поддерживают долгосрочные гуморальные иммунные ответы, все еще ограничен. Предыдущие исследования профилировали эпитопы иммунного ответа у людей, инфицированных COVID-19, в основном с использованием анализов на основе ELISA26,27, подходов на основе фагового или бактериального дисплея28-31 и технологий на основе микрочипов.30,{{ 38}} Идентифицировано несколько иммунодоминантных эпитопов S-белка SARS-CoV-2; наиболее часто обнаруживаемые области были картированы рядом или охватывают слитый пептид (FP) субъединицы S2, повторы второй гептады внутри субъединицы S2 и на C-концевом домене субъединицы S1.26,28-30, 32,33 Кроме того, серологический скрининг также выявил эпитопы, расположенные в других белках протеома SARS-CoV-2, включая N-белок, мембранный белок (M), а также ORF1ab, ORF3a и ORF7a.28-30, 34,35 Хотя предыдущие исследования предоставили важную информацию об антигенных эпитопах, эти исследования в основном были сосредоточены на профилировании эпитопов у пациентов с COVID-19 на ранней фазе выздоровления. Точные эпитопы, опосредующие устойчивые реакции антител, специфичные к SARS-CoV-2, а также динамику распознавания эпитопов еще предстоит выяснить. Здесь, чтобы получить более глубокое понимание кинетики и продолжительности гуморальных иммунных ответов у пациентов с COVID-19, особенно эпитопов, ответственных за устойчивый долговременный иммунитет против SARS-CoV-2, мы провели комплексный продольный анализ. иммунного профиля у 31 пациента с COVID-19 в течение 180–220 дней после появления симптомов. На основании оценки антигенсвязывающих и нейтрализующих антител, а также уровней цитокинов в сыворотке мы дополнительно идентифицировали панель эпитопов, расположенных в белках ORF1ab, S и N SARSCoV-2, которые опосредуют стойкие гуморальные иммунные ответы с использованием пептида. микроматрица, включающая полный протеом SARS-CoV-2. Наши результаты проливают свет на особенности долговременного иммунитета для преодоления вирусной инфекции и помогут разработать рациональную разработку вакцин и усовершенствованные серологические диагностические инструменты.

МЕТОДЫ

Участники исследования и сбор образцов

Для продольной оценки кинетики иммунных ответов, направленных на SARS-CoV-2, был взят 101 образец сыворотки от 31 человека, инфицированного SARS-CoV-2, которые были госпитализированы в Третью больницу Наньтун, связанную с Университетом Наньтун (Наньтун , Китай) в период с января по март 2020 г. У всех пациентов была диагностирована инфекция SARS-CoV-2, подтвержденная методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией; тяжесть заболевания определялась как легкая, умеренная (нетяжелая) или тяжелая форма COVID-19 в соответствии с версией 7 Протокола диагностики и лечения новой коронавирусной пневмонии, опубликованного Национальной комиссией здравоохранения Китайской Народной Республики.36 Пациенты находились под наблюдением. в продольном направлении в течение 4–8 месяцев после выздоровления от острой инфекции. Образцы крови собирались продольно в период от 4 до 219 дней после появления симптомов у 20 пациентов из 31 участника исследования (в среднем 4,5 образца на человека в диапазоне от 2 до 8), в то время как отбор проб в одну временную точку проводился для каждого из участников исследования. еще 11 человек, которые находились в поздней фазе выздоровления (дни от 122 до 214 после начала заболевания). Соответственно, сыворотки (n 5 20) здоровых доноров соответствующего возраста и пола также были включены в качестве контрольной группы. Ни у одного из участников исследования не было документально подтвержденной предшествующей инфекции SARS или MERS.

Исследование было одобрено этическим комитетом Третьей больницы Наньтун при Университете Наньтун (одобрение EL2020006). От каждого участника исследования было получено письменное информированное согласие. Сыворотку отделяли от периферической крови в пробирках с сывороточным гелем посредством центрифугирования, формовали аликвоты и хранили при 280°С перед использованием.

Сотовые линии

Клетки HEK293T и Huh7 культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс), дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (Gibco), 100 ед/мл пенициллина (Gibco) и 100 мг/мл пенициллина. мл стрептомицина (Gibco) при 378°C и 5% CO2.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Обнаружение антител IgG методом ИФА

Уровни антигенсвязывающих антител IgG в образцах сыворотки человека определяли методом ELISA. Девяностошестилуночные планшеты для ИФА (Corning, Corning, NY) были предварительно покрыты нуклеокапсидным белком SARS-CoV-2 (Sino Biological, Пекин, Китай, каталожный номер 40588-V08B , 50 нг на лунку) или белок-шип (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 нг на лунку), белок-шип SARS-CoV (Sino Biological, 40634-V08B, 100 нг на лунку) лунку) или шиповидный белок MERS-CoV (Sino Biological, 40069-V08B, 50 нг на лунку) в течение ночи при 48°С. После блокирования 5% обезжиренным молоком в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,05% Tween 20 (PBS-T), в течение 2 часов при 37°C, 3-кратно серийно разведенные образцы сыворотки, инактивированной нагреванием, при начальном разведении 1. :200 добавляли в предварительно покрытые пластины в течение 2 часов при 37°С. Лунки промывали 3 раза между каждым этапом PBS-T. Реакции визуализировали путем инкубации с антителом против IgG человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (Abcam, Кембридж, Великобритания, 1:100, разведение 000) в течение 1 часа при 37°С, с последующим добавлением субстрата тетраметилбензидина (Life Technologies, Карловы Вары). , Калифорния). Развивающиеся реакции останавливали 2 моль H2SO4 и измеряли поглощение при 450 нм с корректирующей длиной волны, установленной на 630 нм (OD450 2 OD630). Для расчета конечного титра связывающихся антител данные были линеаризованы путем построения графика log10 разведений сыворотки в зависимости от скорректированных значений оптической плотности (OD) (OD450 2 OD630) в пределах линейного участка кривой (y 5 kx 1 b , r2 > 0,99) и разведение сыворотки, при котором рассчитывали скорректированное значение OD (OD450 2 OD630) 5 0 для получения конечного титра. Антигенспецифические антитела IgG у мышей, иммунизированных пептидом, оценивали с помощью ELISA на основе пептидов. Кратко, 96-луночные планшеты для ELISA (Thermo Fisher Scientific) покрывали 1 мг на лунку 4 смешанных пептидов (пептиды 318, 356, 510 и 530) в карбонатном буфере (рН 9,6) в течение ночи при 48°С. После блокирования PBS-T, содержащим 5% обезжиренного молока, лунки инкубировали с образцами сыворотки, разбавленными в соотношении 1:40, в течение 1 часа при 37°C. Затем планшеты промывали и инкубировали с антителами против мышиного IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена (Abcam). Реакции визуализировали с использованием тетраметилбензидинового субстрата (Life Technologies), а поглощение при 450 нм измеряли после остановки реакции 2 моль H2SO4.

Производство псевдовирусов и титрование

Ген с оптимизированными кодонами, кодирующий шиповый белок SARS-CoV-2 (NC_045512) или SARS-CoV (AY291315.1) с делецией C-концевого 19 аминокислот или MERS-CoV (JX{{10 }}) белок-шип, усеченный с С-концевыми 16 аминокислотами, клонировали в вектор pcDNA3.1(1) соответственно. Клетки HEK 293T, культивированные в чашке для культуры ткани диаметром 100 мм, котрансфицировали 1 мг плазмиды, кодирующей шиповидный белок, и 15 мг env-дефицитного, экспрессирующего люциферазу скелета (pNL4-3.luc.RE) с использованием полиэтиленимина (Polysciences , Уоррингтон, Пенсильвания). Супернатанты культур клеток, содержащие псевдовирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и хранили при 280°С в аликвотах. Для определения титров вируса (50% инфекционная доза для тканевой культуры) серийные разведения псевдовирусов добавляли к клеткам 1 3 104 Huh7, предварительно посеянным в планшеты с лунками 96-. Через 12 часов заражения вируссодержащую среду заменяли свежей питательной средой и клетки культивировали еще 48 часов. Люциферазную активность лизиса клеток измеряли с помощью системы анализа люциферазы Steady-Glo (Promega, Madison, Wisc) с использованием устройства для считывания микропланшетов (BioTek Instruments, Winooski, Vt), а лунки, производящие относительные единицы люминесценции, более чем в 10 раз превышающие среднее фоновое значение. положительный.

Псевдовианализ на нейтрализацию руса

Образцы сыворотки, инактивированной нагреванием, от пациентов с COVID-19 или здоровых доноров 2-кратно серийно разбавляли и инкубировали с 200 псевдовирусами в 50% инфекционной дозе для тканевой культуры в течение 1 часа при температуре 37°C. Затем смеси применяли для инфицирования клеток Huh7, предварительно посеянных в планшеты с лунками 96- в двух экземплярах. Лунки заполняли свежей питательной средой через 12 часов после заражения, а люциферазную активность клеток определяли через 48 часов. Титры 50% нейтрализации (NT50) против псевдовирусов SARS-CoV-2 и SARS-CoV рассчитывали методом нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния); а NT50 псевдовируса MERS-CoV определяли как наибольшее разведение сыворотки, которое приводило к снижению относительных единиц люминесценции на 50% по сравнению с контролем вируса без применения образцов сыворотки.

Обнаружение цитокинов на основе белковых микрочипов

Количественное измерение нескольких цитокинов (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 , IL-13, MCP-1, IFN-g и TNF-a) в образцах сыворотки определяли с использованием мультиплексной матрицы ELISA (RayBiotech, Peachtree Corners, Джорджия) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, стеклянные предметные стекла, предварительно покрытые цитокин-специфичными антителами, блокировали разбавителем образцов при комнатной температуре в течение 30 минут с последующим добавлением 60 мл 2-кратно разведенных образцов сыворотки или стандартных разведений цитокинов. После инкубации в течение ночи при 48°C предметные стекла промывали 5 раз и окрашивали 80 мл коктейля биотинилированных детектирующих антител, а затем Cy3-эквивалентного конъюгированного с красителем стрептавидина при комнатной температуре в течение 1 часа. Интенсивность флуоресценции определяли с помощью микроматричного сканера InnoScan 300 (Innopsys, Чикаго, Иллинойс) при длине волны 532 нм, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Q-Analyzer (RayBiotech).

Синтез пептидов и конъюгация с бычьим сывороточным альбумином

Всего на основе аминокислотной последовательности SARS-CoV синтезировано 515 пептидов (длиной 15 а.к., перекрывающихся на 11 а.к.), покрывающих протеом SARS-CoV-2. Компания GL Biochem (Шанхай, Китай) -2 штамм Ухань-Ху-1. Пептиды конъюгировали с бычьим сывороточным альбумином (БСА) с использованием сшивающего агента Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, Sulfo-SMCC добавляли в 30--кратном молярном избытке к BSA с последующим диализом в PBS. Затем добавляли пептид, содержащий цистеин, в соотношении 1:1 (мас./мас.), инкубировали в течение 2 часов и дополнительно диализовали PBS для удаления свободных пептидов.

Изготовление пептидных микрочипов

Для приготовления пептидного микрочипа необходимо использовать пептиды SARS-CoV-2, а также отрицательный контроль (BSA) и положительный контроль (антитела против человеческого IgG и против человеческого IgM; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). , были иммобилизованы на предметных стеклах-субстратах PATH (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) в трех экземплярах с использованием принтера Super Marathon (Arrayjet, Эдинбург, Шотландия, Великобритания). Затем пептидные микрочипы консервировали при 280°С для дальнейшего использования.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Картирование эпитопов на основе микрочипов

Анализ сыворотки на основе микрочипов проводился как Li et al,37 с небольшими модификациями. Чтобы создать отдельные камеры для идентичных субчипов, на каждое предметное стекло пептидного микрочипа устанавливали резиновую прокладку 14-камеры. Перед использованием массивы слайдов нагревали до комнатной температуры, затем блокировали 3% BSA в PBS-T на 3 часа. Образцы сыворотки от пациентов с COVID-19 или объединенные сыворотки от 20 здоровых доноров (контрольная группа) были разведены в соотношении 1:200 в PBS-T для большинства образцов, а затем инкубированы с каждым подмассивом в течение 2 часов при 48С. Массивы промывали PBS-T и инкубировали с Cy3-конъюгированными козьими античеловеческими IgG и конъюгированными с Alexa Fluor 647 ослиными античеловеческими IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Вест Гроув, Пенсильвания) в разведении 1:1000. каждый в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации массивы промывали PBS-T, а затем полностью сушили центрифугированием при комнатной температуре. Впоследствии массивы сканировали с помощью микрочипового сканера LuxScan 10K-A (CapitalBio, Пекин, Китай), а данные интенсивности флуоресценции FL получали и анализировали с помощью программного обеспечения GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния).

Рис. 1. Продольная динамика реакций антител у пациентов с COVID-19. Схема дизайна исследования. Всего в исследовании приняли участие 31 человек, инфицированный SARS-CoV-2, и 20 здоровых доноров. Сбор образцов сыворотки проводился продольно в несколько моментов времени у 20 пациентов из 31 человека, инфицированного SARS-CoV-2, тогда как отбор проб в один момент времени проводился у остальных 11 пациентов. Указано количество участников и образцы сыворотки, использованные в различных анализах. B и C. В общей сложности 101 образец сыворотки от 31 пациента с COVID-19 был протестирован методом ELISA на белок N SARS-CoV-2 (B) и белок S (C), связывающие антитела IgG в разные моменты времени. после появления симптомов (дни 1-30, n 5 37; дни 31-61, n 5 18; дни 100-150, n 5 21; дни {{21 }}, n 5 25). Образцы сыворотки от 20 здоровых доноров были включены в качестве контрольной группы. D, NT50 против псевдовирусов SARS-CoV-2 с течением времени рассчитывали методом нелинейной регрессии. E. Представлено распределение нейтрализующей активности сыворотки у пациентов с COVID-19 в указанные моменты времени после начала заболевания. Образцы с титром NT50 ниже 20 определялись как не нейтрализующие.

Анализ данных пептидного микрочипа

Данные IgG и IgM анализировали соответственно. Интенсивность сигнала каждого пятна определяли как передний план минус фон и усредняли тройные пятна для каждого пептида. Пороговое значение для положительного пептидного ответа в образцах COVID-19 было установлено в два раза выше интенсивности сигнала контрольного здорового донора. Пептиды с долей положительных результатов выше 80% среди образцов, протестированных во всех трех временных точках отбора проб (дни 10-60, 100-150 и 180-220 после начала заболевания) определялись как доминантные и персистентные пептиды и пептиды с частота положительных ответов выше 60 % во все 3- моменты времени считалась субдоминантной и постоянной. Рассчитывали среднюю интенсивность сигнала каждого пептида в 3 группах точек отбора проб; также были отобраны пептиды, демонстрирующие высокую интенсивность сигнала (выше среднего 1 стандартного отклонения интенсивности сигнала всех протестированных образцов). Обработка и анализ данных выполнялись с помощью программного обеспечения R v3.6.3 (https://www.r-project.org/), а значительные изменения интенсивности сигнала между различными группами моментов времени выборки оценивались на основе Limma. Различия с P < 0,05 считались статистически значимыми.

Иммунизация мышей

Самки мышей BALB/c в возрасте от 6 до 8 недель были приобретены у компании Beijing Vitalstar Biotechnology (Пекин, Китай). Все мыши содержались в специальных помещениях, свободных от патогенов, а исследование на животных было одобрено Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Тяньцзиньского медицинского университета (Тяньцзинь, Китай). Для иммунизации группам мышей (n 5 5) внутримышечно вводили по 25 мг на дозу каждого пептида (пептиды 318, 356, 510 и 530 соответственно), смешанного с 50 мг квасцов (InvivoGen, Сан-Диего, Калифорния). и 10 мг адъювантов CpG, и дважды усиливали дозой пептидов по 50 мг на дозу в присутствии адъювантов с 2-недельными интервалами. Вакцинация только адъювантами служила отрицательным контролем. Сыворотку собирали у иммунизированных мышей на 10-й или 14-й день после второй и третьей иммунизации.

Статистический и структурный анализ

Все графики были построены с помощью GraphPad Prism. Статистические сравнения между группами на рисунках 1, 2 и 4 были выполнены с помощью 1-способа ANOVA с множественным сравнением Тьюки. Корреляции, показанные на рис. 1, рис. E9 и рис. E10 в онлайн-репозитории, доступном на сайте www.jacionline.org, были определены с помощью корреляционного анализа Пирсона. Различия с P < 0,05 считались статистически значимыми. Структуры шиповидного белка SARS-CoV-2 (Банк данных белков [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX и PDB ID: 6ZGI) и домена димеризации SARS-CoV{{ 13}} нуклеокапсидного белка (PDB ID: 6YUN) использовали для анализа структурных деталей идентифицированных эпитопов, расположенных на белке-шипе и домене димеризации белка нуклеокапсида. Выравнивание последовательностей и анализ гомологии различных коронавирусов человека проводили с помощью алгоритма Clustal W в программном обеспечении MEGA v10.1.6.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Инфекция SARS-CoV-2 индуцирует устойчивое антигенспецифическое связывание и нейтрализующие антитела.

Для продольной оценки реакции антител после заражения SARS-CoV-2 был взят 101 образец сыворотки от 31 человека с ПЦР-подтвержденной инфекцией SARS-CoV-2 (рис. 1, А). В число участников исследования вошли 26 пациентов с умеренным течением COVID-19, 1 с бессимптомным течением, 2 с легким заболеванием и 2 с тяжелыми симптомами (см. Таблицу E1 в онлайн-репозитории, доступном на сайте www.jacionline.org). Возраст пациентов, включенных в это исследование, составлял от 17 до 66 лет (медиана возраста 45 лет), с примерно равным распределением мужчин (51,6%) и женщин (48,4%). Наиболее распространенными симптомами среди участников исследования были лихорадка (83,9%), кашель (67,7%), миалгия (22,6%) и озноб (22,6%), при этом средняя продолжительность заболевания составляла 15 дней. Всего было собрано 90 образцов сыворотки от 20 пациентов с COVID-19 во время госпитализации и выписки после выздоровления в различные моменты времени вплоть до 219 дней после появления симптомов (рис. 1, A и см. таблицу E2 в онлайн-репозитории). Отбор проб у остальных 11 участников проводился в один момент времени во время позднего выздоровления (дни от 122 до 214 после появления симптомов). Кроме того, в качестве контрольной группы были включены образцы от 20 здоровых доноров соответствующего возраста и пола (Таблица E1). Антигенспецифические антитела IgG в образцах сыворотки определяли количественно с помощью ELISA, предварительно покрытых белком N или S белка SARS-CoV-2. По сравнению со здоровыми донорами у пациентов с COVID-19 в течение 30 дней после появления симптомов вырабатывались антитела IgG как против N, так и против S, со средним геометрическим титром конечной точки 4,10 (log10 анти-N IgG) и 4,20 (log10 анти-S IgG) (рис. 1, B и C; и см. таблицу E3 в онлайн-репозитории на сайте www.jacionline.org; рис. E1, A и B; и рис. E2), в соответствии с предыдущими наблюдениями о том, что сероконверсия происходит через 1–2 недели после заражения SARS-CoV-2.5,38 После этого титры антигенсвязывающих антител снижались в разной степени с течением времени. У пациентов с COVID-19 наблюдалось быстрое и резкое снижение уровня антител анти-N IgG, тогда как более высокие уровни титров анти-S IgG сохранялись до 180–220 дней после начала заболевания по сравнению со здоровыми донорами (рис. 1, Б). и С). Корреляционный анализ выявил значительную корреляцию между log10 титром анти-N IgG и титром анти-S IgG (r 5 0.50 и P < .001; рис. 1, F). Помимо количественного определения связывающих антител, динамика функциональных нейтрализующих антител у людей с COVID-19 была дополнительно определена с использованием псевдотипированного SARS-CoV-2. Более 95% образцов сыворотки пациентов (35 из 37), собранных в период от 4 до 30 дней после появления симптомов, обладали высокой нейтрализующей активностью в отношении SARS-CoV-2, а большая часть образцов демонстрировала умеренную (NT50 80-320) ) до сильной (NT50 > 320) нейтрализующей активности (рис. 1, D и E). Следует отметить, что 2 образца с низким или отсутствующим титром нейтрализации (NT50 при минимальном разведении сыворотки 1:20) были собраны в ранний период после вирусной инфекции (на 4-й и 11-й день после появления симптомов) до появления мощных нейтрализующих антител (рис. 1, D и рис. E1, C). Несмотря на снижение уровней нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 у пациентов с COVID{104}} с течением времени, у большинства образцов сыворотки пациентов (24/25), полученных в течение 180–220 дней после появления симптомов, сохранялась положительная реакция на нейтрализацию SARS-CoV. CoV-2, со снижением средних геометрических титров NT50 в 2,8- раза (рис. 1, D и E; таблица E3; рис. E3). Как и ожидалось, по сравнению с антителами против N IgG, была выявлена ​​более сильная корреляция между титрами SARS-CoV-2 S-связывающих IgG и титрами нейтрализующих антител (r 5 0,61 и P < 0,001; рис. 1). , G и H), что согласуется с выводами о том, что белок S SARS-CoV-2 S является основной мишенью нейтрализующих антител. Белок S SARS-CoV-2 имеет высокое сходство последовательностей с высоковирулентным SARS-CoV (76% идентичности последовательностей) и демонстрирует низкую гомологию последовательностей с MERS-CoV (34% идентичности последовательностей). Сообщалось о серологической перекрестной реактивности среди коронавирусов;8,10,28,29 однако данные о продольной последующей оценке перекрестной реактивности антител против SARS-CoV-2 по отношению к другим коронавирусам остаются ограниченными. Мы определили перекрестно-связывающие и перекрестно-нейтрализующие антитела в продольных сыворотках людей, инфицированных SARS-CoV-2. Результаты показали, что более 80% образцов сыворотки пациентов связывались с S-белками SARS-CoV и/или MERS-CoV в течение 1 месяца после появления симптомов, при этом 27% образцов проявляли двойную перекрестную реактивность (рис. 1, I). Среди образцов, протестированных в ранний период (1-30 дней после начала заболевания) реактивность к S-белку SARS-CoV имела большую долю (73%), чем к MERS-CoV (35%) (рис. 1, I). Количество антител с двойным перекрестным связыванием и перекрестного связывания с SARS-CoV демонстрировало постепенное снижение с течением времени: только 8% образцов с двойным перекрестным связыванием и 20% образцов с одинарным перекрестным связыванием с SARS-CoV через 180–220 дней после начала заболевания (рис. 1). , I; в онлайн-репозитории, доступном на сайте www.jacionline.org, см. рис. E4, A; рис. E5, A; и рис. E6 в онлайн-репозитории этой статьи на www.jacionline.org). Интересно, что позитивность антител, реагирующих на S-белок БВРС-КоВ, оставалась относительно постоянной с течением времени (рис. 1, I). В отличие от высокой способности к перекрестному связыванию, лишь небольшое количество образцов сыворотки пациентов перекрестно нейтрализовали псевдовирусы SARS-CoV и/или MERS-CoV (рис. 1, I; рис. E4, B; рис. E5, B; см. рис. E7 на Интернет-хранилище). Примерно 27% образцов, собранных через 1–30 дней после появления симптомов, продемонстрировали перекрестно-нейтрализующую активность, и это число снизилось до 20% через 180–220 дней с более резкими изменениями в перекрестно-нейтрализующей активности SARS-CoV (рис. 1, I). ). Более высокая доля образцов перекрестно нейтрализовала SARSCoV, чем MERS-CoV, в течение 30 дней после начала заболевания. Стоит отметить, что, несмотря на схожие пропорции образцов, показавших перекрестную нейтрализацию SARS-CoV и MERS-CoV, значения NT50 для MERS-CoV были намного ниже, чем у SARSCoV среди образцов сыворотки, которые были положительными по перекрестной нейтрализации (рис. E4, Б; Рис. Е5, Б; Рис. Е7).

растение цистанхе, повышающее иммунную систему

Инфекция SARS-CoV-2 приводит к активации выработки цитокинов.

Чтобы всесторонне охарактеризовать иммунологические изменения после заражения SARS-CoV-2, мы дополнительно оценили изменения в динамике уровней цитокинов в сыворотках пациентов с COVID-19. Пятьдесят пять продольных образцов сыворотки, которые были собраны в течение первых 2 месяцев после появления симптомов, были использованы для обнаружения продукции цитокинов с помощью белкового микрочипа. В течение первого месяца болезни наблюдалось повышение сывороточных уровней нескольких цитокинов, включая IL-1a (провоспалительный), IL-6 (провоспалительный) и IL-10 (противовоспалительный). ), которые связаны с синдромом высвобождения цитокинов в тяжелых случаях COVID-19,39,40 а также IFN-g (тип TH1) и IL-4 (тип TH2) (рис. 2, A, и рис. E8 в онлайн-репозитории, доступном на сайте www.jacionline.org). В частности, уровни IL-6, IL-10 и IFN-g в сыворотке крови увеличивались в течение 15 дней после появления симптомов у пациентов и снижались на более поздних стадиях, тогда как высвобождение IL-1 Было показано, что a и IL-4 значительно повышаются в течение 16–30 дней от начала заболевания и впоследствии быстро снижаются до нормального уровня (рис. 2, А). Корреляционный анализ показал слабую или отсутствие линейной связи между ответами антигенспецифических антител и выработкой цитокинов после заражения SARS-CoV-2, хотя статистическая значимость наблюдалась между уровнями IL-10 и SARS-CoV{{ 34}} Антитело, связывающее N-белок (r 5 0.321 и P < .05), между продуцированием IL-1b и антителом, связывающим белок S (r 5 20.335 и P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

Картирование эпитопов всего протеома идентифицирует доминантные эпитопы, опосредующие стойкие гуморальные иммунные реакции у пациентов с COVID-19.

Чтобы лучше охарактеризовать отличительные особенности гуморального иммунитета к SARS-CoV-2 с течением времени, мы применили картирование эпитопов всего протеома с использованием микрочипов на основе пептидов. Была создана и иммобилизована на предметных стеклах пептидная библиотека, охватывающая протеом SARS-CoV-2, в которой каждый пептид имел длину 15 аминокислот с перекрытием в 11 аминокислот. Всего был взят 51 продольный образец сыворотки от 19 пациентов с бессимптомным течением (n 5 1), от легкой (n 5 2) до умеренной (n 5 15) или тяжелой (n 5 1 ) Были протестированы инфекции SARS-CoV-2 (Таблица I). Чтобы добиться относительно сбалансированного количества образцов, интервалов и моментов времени, образцы собирались последовательно в 2 или 3 момента времени у каждого участника COVID-19 в диапазоне от 16 до 219 дней после появления симптомов. У большинства пациентов (18/19) после вирусной инфекции вырабатывались нейтрализующие антитела, за исключением одного человека с бессимптомной инфекцией (таблица I). В зависимости от различных моментов времени отбора пробы были разделены на 3 группы: дни 10-60 (n 5 18), дни 100-150 (n 5 18) и дни {{28). }} (n 5 15). Продольная оценка профилей эпитопов вируса у пациентов с COVID-19 проводилась для сывороточных антител IgG и IgM, при этом объединенные сыворотки от 20 здоровых доноров использовались в качестве отрицательного контроля. С использованием протеомного микрочипа SARS-CoV-2 была определена кинетика реакций антител, связывающихся с пептидами, и проанализирована на предмет (1) интенсивности сигнала связывания и (2) процента положительно реагирующих образцов (положительная доля) для каждого пептида. . На основании порогового значения для положительного ответа на связывание пептида, которое было установлено как удвоенная интенсивность сигнала отрицательного контроля, мы идентифицировали в общей сложности 460 положительных пептидов для IgG и 479 положительных пептидов для IgM, которые были реактивны по крайней мере у 1 пациента. образец сыворотки. Число положительных пептидов и распределение ответов по различным открытым рамкам считывания (ORF) SARS-CoV-2 были относительно стабильными среди разных групп выборки, с тенденцией к небольшому уменьшению числа положительных пептидов с течением времени (рис. 3, А). Наибольшая реактивность выявлена ​​у репликазного полипротеина ORF1ab, который является крупнейшей ORF, охватывающей более двух третей всего генома (рис. 3, А). Интересно, что мы наблюдали корреляцию между положительными реакциями на связывание пептидов и уровнями цитокинов в сыворотке крови от умеренной до сильной на раннем этапе после заражения SARS-CoV-2 (дни 10-60 после начала заболевания; см. рис. E10 в онлайн-репозитории по адресу: www.jacionline.org). Было показано, что количество положительно связывающихся пептидов для IgM связано с уровнями IL-6 и IL-10 в сыворотке; аналогичным образом, средняя интенсивность сигнала общих реактивных пептидов и пептидов, связывающих ORF1ab для IgM, продемонстрировала положительную связь с продукцией IL-6 и IFN-g в образцах сыворотки. Эти данные позволяют предположить, что изменения уровней цитокинов после заражения SARS-CoV-2 могут влиять на величину и ширину эпитопов, распознаваемых антигенспецифическими гуморальными реакциями. На основании выявления положительных эпитопов мы дополнительно выбрали наиболее распространенные эпитопы, которые постоянно оставались реактивными в более чем 80% образцов COVID-19 среди каждой из 3 групп выборки (называемые доминантными и персистентными эпитопами). Результаты показали, что эти высокодоминантные эпитопы, способные опосредовать долгосрочные гуморальные иммунные ответы, были расположены в полипротеине SARS-CoV-2 ORF1ab и белке S, причем большее количество эпитопов распознавалось антителами IgM (n 5 33), чем Антитела IgG (n 5 10) (рис. 3, B и таблица II; см. рис. E11 и рис. E12 в онлайн-репозитории на сайте www.jacionline.org). Полипротеин ORF1ab обладал максимальным количеством доминантных эпитопов, опосредующих долговременные ответы, причем эпитопы были широко распределены в областях неструктурных белков (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14, nbsp 12-14, и nbsp 16 (таблица II). Примечательно, что мы идентифицировали один иммунодоминантный эпитоп, 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), который мог распознаваться антителами IgG и IgM от 100% пациентов с COVID-19, независимо от времени отбора проб сыворотки (рис. 3, B и Таблицу II; см. Рис. E13 и Рис. E14 в онлайн-репозитории). Этот высокореактивный пептид расположен в области геликазы (nsp 13) полипротеина ORF1ab, которая необходима для раскручивания двухцепочечных матриц РНК во время репликации SARS-CoV-2.41 Среди выбранных пептидов ORF1ab есть 2 иммунодоминантных пептида. с самой высокой средней интенсивностью сигнала, распознаваемой антителами IgG, номер 1985 (ORF1ab, а.а. 5449-5463) и номер 2073 (ORF1ab, а.а. 5801-5815), оба расположены на nsp 13. Для ответов IgM пептид 685 (ORF1ab, aa 249-263) на nsp 2 и пептид 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) на nsp 13 продемонстрировали наиболее устойчивую интенсивность связывания (рис. 3, B). Учитывая вариации исходных сигналов (объединенные сыворотки здоровых доноров) для различных пептидов (рис. 3, Б), мы дополнительно рассчитали кратные изменения интенсивности сигналов каждого ключевого пептида по сравнению со здоровой контрольной группой. Результаты показали, что пептид 2073 (связывание IgG) и пептид 1985 (связывание IgM), расположенные в области nsp 13, сохраняли максимальную интенсивность связывания пептида (кратное изменение) среди сывороток пациентов, собранных в течение периода от 180 до 220 дней (рис. E13 и рис. E14).

Рис. 2. Кинетика продукции цитокинов у пациентов с COVID-19. А. Уровни продукции цитокинов в 55 образцах сыворотки, собранных у 16 ​​пациентов с COVID-19 во время острой фазы и ранней стадии выздоровления, были обнаружены с помощью ИФА на основе белковых микрочипов (дни 1-15, n 5 11; дни 16-30, n 5 26; дни 31-61, n 5 18; здоровые доноры, n 5 20). Каждая точка представляет отдельный образец сыворотки; пунктирные линии обозначают предел обнаружения. Статистическую значимость определяли с помощью 1-способа ANOVA с множественными сравнениями Тьюки. *P < 0,05, **P < 0,01 и ****P < 0,0001. B. Кратное изменение уровня продукции каждого цитокина у пациентов с COVID-19, показанное в (A), по сравнению со средними значениями 20 образцов от здоровых доноров. В каждом столбце указан отдельный образец сыворотки, взятый в указанные моменты времени после появления симптомов; каждая строка представляет 1 отдельный протестированный цитокин.

ТАБЛИЦА I. Характеристики пациентов с COVID-19 и групп выборок при картировании эпитопов

Рис. 3. Распознавание IgM и IgG доминантных эпитопов, которые способствуют долговременному ответу антител у лиц, инфицированных SARS-CoV-2. Продольный анализ распознавания эпитопов сывороткой у 19 человек с COVID-19 с использованием пептидного микрочипа, покрывающего протеом SARS-CoV-2. Пороговое значение для положительного ответа на связывание пептида в образцах пациентов (n 5 51) ​​было установлено как удвоенная интенсивность сигнала объединенных сывороток от 20 здоровых доноров. A. Количество пептидов и распределение пептидов с положительным связыванием, которые были обнаружены в 1 или более образцах, собранных через 10-60 дней (n 5 18), 100-150 дней (n 5 18), и 180- 220 дней (n 5 15) после начала заболевания. Цифры указывают общее количество идентифицированных эпитопов IgG и IgM из каждой ORF. B. Интенсивность сигналов доминантных и персистентных эпитопов IgG и IgM (ось X), которые были устойчиво реактивными в более чем 80% образцов во всех трех временных точках отбора проб. Каждая точка обозначает объединенную сыворотку здоровых доноров (вверху) или отдельный образец сыворотки пациента, собранный в указанные моменты времени после появления симптомов. E, Белок оболочки.

TABLE II. Epitopes with >80% положительных результатов во всех трех временных точках отбора проб

Доминантные и персистентные эпитопы белка S SARS-CoV-2 расположены в субъединицах NTD и S2.

Всего было идентифицировано 4 доминантных и персистентных эпитопа S-белка SARSCoV-2: пептид 318 (S, аа 45-59) и пептид 356 (S, аа 197-211), которые расположены в регионе NTD; пептид 510 (S, а.а. 813-827), который покрывает сайт расщепления S2' и части FP субъединицы S2, и пептид 530 (S, а.к. 893-907), который расположен в соединительной области между FP и первой областью гептадного повтора субъединицы S2 (рис. 3, Б и таблица II). Среди этих ключевых пептидов белка S, которые мы выбрали, пептид 318, расположенный в NTD белка S, обладал наиболее устойчивой интенсивностью связывания (кратное изменение относительно контроля; Фиг. E13 и Фиг. E14). Структурный анализ показал, что эти эпитопы полностью экспонируются на поверхности мономерного S-белка; однако некоторые остатки эпитопов пептидов 318, 356 и 530 скрыты под поверхностью тримерного белка S (рис. 4, А и Б), что позволяет предположить, что структуры как мономера, так и тримера S эффективно распознаются иммунной системой хозяина при определенных условиях. обстоятельства. Точнее, два сегмента петли пептида 318 (аа 45-46 и аа 56-59) экспонируются на тримерном белке S, причем центральная b-цепь скрыта внутри; и большинство остатков пептида 356 доступны на поверхности, включая основную b-цепь (аа 203-209) и сегмент петли (аа 210-211). Пептид 510 содержит сайт расщепления S2' и центральную спираль FP, оба из которых полностью представлены на поверхности белка S; остатки пептида 530 в основном криптичны, и лишь небольшая часть петли (а.а. 893-895) экспонируется на тримерном белке S (рис. 4, В). Анализ гомологии последовательностей семи распространенных коронавирусов человека показал, что два эпитопа, расположенные в субъединице S2 (пептиды 510 и 530), имеют высокую идентичность последовательностей с другими коронавирусами, что позволяет предположить серологическую перекрестную реактивность в отношении этих эпитопов среди коронавирусов человека (рис. 4, D). Последовательность пептида 318 продемонстрировала высокое сходство с SARSCoV, в то время как среди коронавирусов был показан низкий уровень гомологии последовательности пептида 356, что позволяет предположить SARS-CoV-2-специфические реакции антител, направленные на эту область (рис. 4, D). Учитывая новые возникающие и циркулирующие во всем мире варианты SARS-CoV-2, мы дополнительно выполнили выравнивание последовательностей в отношении ключевых эпитопов белка S между ранним штаммом SARS-CoV-2 (Ухань-Ху{{52}) }) и 5 ​​вызывающих беспокойство вариантов (Альфа, Бета, Гамма, Дельта и Омикрон), а также 2 представляющих интерес варианта (Лямбда и Мю), согласно классификации вариантных вирусов Всемирной организации здравоохранения (обновлено 30 ноября 2021 г.). ). Результаты показали, что последовательности этих доминантных и персистентных эпитопов практически идентичны среди проанализированных вариантов, за исключением единственной мутации N211I, выявленной в новом варианте Omicron (рис. 4, E). Эти данные указывают на то, что антитела, вырабатываемые ранними штаммами SARS-CoV-2, могут постоянно распознавать текущие циркулирующие варианты и что эти доминантные эпитопы могут быть способны опосредовать устойчивые долгосрочные реакции антител при заражении SARS-CoV-2 варианты. Для дальнейшего определения иммунологических характеристик идентифицированных эпитопов белка S и дальнейшего изучения потенциальной ценности этих эпитопов S-белка в качестве кандидатов на пептидные вакцины мы провели исследование иммунизации мышей с использованием выбранных пептидов. Мышам BALB/c инокулировали 3 раза каждым пептидом в присутствии квасцов и адъювантов CpG (рис. 4, F). Среди 4 выбранных пептидов вакцинация пептидом 356 вызывала появление антигенспецифических антител после второй и третьей доз (рис. 4, Ж). Результаты анализа нейтрализации сыворотки показали, что иммунизация линейными пептидами не приводит к образованию значительных уровней нейтрализующих антител против SARS-CoV-2 (рис. 4, H), что позволяет предположить, что эти линейные пептиды плохо индуцируют устойчивые реакции нейтрализующих антител.

В белке N SARS-CoV-2 отсутствуют большинство реактивных эпитопов, опосредующих стойкий гуморальный ответ после вирусной инфекции.

Ряд исследований выявил сильную антигенность белка N SARS-CoV-2.4,11,12 Однако нам не удалось идентифицировать доминантные и персистентные эпитопы, локализованные в белке N, на основе текущих критериев отбора. (выше 80% положительных результатов во всех трех временных точках отбора проб). Для продольной оценки профилей эпитопов белка N у лиц с COVID-19 мы провели второй раунд скрининга эпитопов, который был основан на данных, полученных с помощью пептидного микрочипа, для отбора субдоминантных эпитопов, которые стабильно сохраняли положительную реактивность. в более чем 60% образцов COVID-19 для каждой из 3 временных точек отбора проб (так называемые субдоминантные и персистентные эпитопы). Всего было идентифицировано 4 субдоминантных и персистентных эпитопа белка N SARS-CoV-2, среди которых пептид 2455 (N, aa 213-227) проявлял реактивность как к антителам IgG, так и к антителам IgM при COVID{{16 }} пациентов с относительно более высокими уровнями интенсивности сигнала (рис. 5, A и B, а также см. таблицу E4 в онлайн-репозитории на сайте www.jacionline.org). Два перекрывающихся пептида, пептид 2455 (N, aa 213-227) и пептид 2456 (N, aa 217-231), расположены в богатой Ser/Arg линкерной области между N-концевым РНК-связывающим доменом. и С-концевой домен димеризации белка N. Пептид 2482 (N, а.а. 321-335) и пептид 2491 (N, а.а. 357-371) полностью или частично расположены внутри домена димеризации белка N (таблица E4). Из-за отсутствия структур 3-D, касающихся интактной конформации белка N, мы провели структурный анализ только двух идентифицированных эпитопов на димерной структуре С-концевого домена димеризации. Остатки пептида 2482 образуют 2 b-цепи, располагающиеся антипараллельно на границах раздела димеризации, тогда как аа 357-364 пептида 2491 образуют спиральные структуры, расположенные на противоположных концах димера (рис. 5, В). . Сравнивание последовательностей между ранним SARS-CoV-2 (штамм Wuhan-Hu-1) и семью новыми вариантами дополнительно выявило, что последовательности этих субдоминантных и персистентных эпитопов в N-белке практически идентичны среди ныне циркулирующих вариантов, с единственная замена G215C пептида 2455, встречающаяся в варианте Delta, и единственная мутация G214C пептида 2455, выявленная в варианте Lambda, что позволяет предположить, что антитела, нацеленные на эти пептиды, потенциально распознают антиген новых вариантов SARS-CoV-2 (рис. 5, D). ).

Рис. 4. Доминантные эпитопы шиповидного белка SARS-CoV-2 с точки зрения обеспечения устойчивых гуморальных иммунных ответов. A и B, Расположение доминантных и персистентных эпитопов на структурах 3-D мономерного (A) и тримерного (B) белка S (ID PDB: 6VXX). Эпитопы выделены зеленым (пептид 356, а.а. 197-211), красным (пептид 318, а.а. 45-59), синим (пептид 510, а.а. 813-827) и фиолетовым (пептид 530, а.а. 813-827). 893-907) соответственно. Три S-мономера в закрытой конформации изображены серым, розовым и голубым цветом соответственно. C. Детальный анализ структуры доминантных эпитопов S-белка SARS-CoV-2 в закрытом состоянии S-тримера (ID PDB: 6VXX). D. Выравнивание последовательностей идентифицированных эпитопов среди распространенных коронавирусов человека. Остатки эпитопов, консервативные между SARS-CoV-2 и другими коронавирусами человека, заштрихованы серым цветом. E. Анализ сохранения эпитопа раннего SARS-CoV-2 (штамм Wuhan-Hu-1) и 7 новых вариантов. Черные точки представляют собой идентичные остатки между штаммом Wuhan-Hu-1 и указанным.

Рис. 5. Субдоминантные эпитопы, расположенные в белке нуклеокапсида SARS-CoV-2, способны опосредовать стойкие гуморальные реакции. Частоты распознавания A, IgG и IgM субдоминантных пептидов (длительно реактивных в более чем 60% образцов) среди образцов сыворотки пациентов, собранных в несколько моментов времени после начала заболевания. B. Кинетика интенсивности сигнала идентифицированных субдоминантных эпитопов с течением времени. Каждая точка представляет отдельный образец сыворотки пациента, полученный от пациентов с COVID-19 в указанные моменты времени после появления симптомов. Пунктирные горизонтальные линии обозначают пороговые значения положительного ответа для каждого пептида. C. Детальный анализ структуры эпитопов C-концевого домена димеризации белка N (ID PDB: 6YUN). Эпитопы помечены синим (пептид 2482, а.а. 321-335) ​​и коричневым (пептид 2491, а.а. 357-364). Две мономерные структуры изображены серым и голубым цветом соответственно. D. Анализ выравнивания последовательностей идентифицированных эпитопов N-белка раннего SARS-CoV-2 (штамм Wuhan-Hu-1) и семи новых вариантов. Черные точки обозначают идентичные последовательности между штаммом Wuhan-Hu-1 и указанным вариантом. Изменения в аминокислотной последовательности выделены красным.

Рис. 6. Линейные эпитопы с высокой интенсивностью связывания и снижающейся частотой реактивности с течением времени, распознаваемые людьми, инфицированными SARS-CoV-2. A и B. Продольный анализ и распределение идентифицированных пептидов, демонстрирующих высокую интенсивность сигнала связывания (выше среднего 1 стандартного отклонения интенсивностей сигналов всех тестируемых образцов), но снижающихся с течением времени частоты положительных результатов. Частоту распознавания (A) и интенсивность сигнала (B) эпитопов наносили на график с использованием 3 временных точек выборки после появления симптомов. Каждая точка в (B) обозначает образец сыворотки отдельного пациента, собранный в указанные моменты времени после появления симптомов; пунктирные горизонтальные линии указывают пороговые значения положительности для каждого пептида. Анализ статистической значимости проводили на основе программного обеспечения Limma of R v3.6.3. *P < 0,05 и **P < 0,01. C. Сравнение местоположения и последовательностей двух соседних эпитопов, пептида 510 (доминантного и постоянного) и пептида 511 (высокая интенсивность сигнала и снижение положительности с течением времени), на структуре S-белка SARS-CoV-2 (ID PDB: 6ZGI). . Перекрывающиеся области между двумя эпитопами выделены зеленым цветом; уникальные последовательности отмечены красным и синим цветом.

Продольный серологический анализ идентифицирует эпитопы с высокой интенсивностью сигнала, но с течением времени снижающейся реактивностью.

В дополнение к выбранным высокореактивным эпитопам, которые ответственны за устойчивые гуморальные иммунные реакции, упомянутые выше, мы дополнительно идентифицировали и охарактеризовали панель из 9 положительных пептидов, которые показали устойчивую интенсивность связывания (выше среднего 1 стандартного отклонения интенсивностей сигналов всех протестированных образцов) с тенденция к снижению реактивности (положительные изменения выше 20%) среди образцов сыворотки от пациентов с COVID-19 с течением времени в соответствии с общей тенденцией к ослаблению гуморальных иммунных ответов. Эти эпитопы расположены внутри трех доминантных антигенов: белков ORF1ab, S и N (рис. 6, A; и см. таблицу E5 в онлайн-репозитории на сайте www.jacionline.org). Кроме того, наблюдалось значительное снижение интенсивности сигналов 4 пептидов белков ORF1ab (пептиды 784-IgG, 1617-IgM и 1986-IgM) и N (пептид 2457-IgG). между образцами из раннего периода отбора проб (дни 10-60 после начала заболевания) и поздней фазы отбора проб (дни 100-150 или дни 180-220 после появления симптомов) (рис. 6). , Б). Примечательно, что, несмотря на значительное перекрывание друг друга, два пептида S-белка пептид 510 (доминантный и персистирующий; рис. 3, Б) и пептид 511 (высокая интенсивность сигнала и снижающаяся с течением времени частота положительных результатов; рис. 6, А) демонстрировали разные закономерности реактивность образцов сыворотки пациентов с течением времени. Анализ последовательности и местоположения показал, что пептид 510 содержит сайт расщепления S2' и дополнительные аминокислоты 813-SKRS-816, тогда как пептид 511 полностью находится внутри FP с расширенным 828-LADA{{29). }} остатки, полностью экспонированные на поверхности тримерного белка S (рис. 6, В). Эти результаты выявили новые особенности эпитопов, которые могут в конечном итоге способствовать более продолжительному и сильному гуморальному иммунитету против SARS-CoV-2.

ОБСУЖДЕНИЕ

Систематическая характеристика долгосрочных иммунных ответов на инфекцию SARS-CoV-2 имеет решающее значение для разработки улучшенной диагностики, эффективных терапевтических вмешательств и вакцин. В текущем исследовании мы провели комплексный продольный анализ пациентов с COVID-19 в течение периода наблюдения от 180 до 220 дней, показавший стойкие гуморальные иммунные реакции и активацию выработки цитокинов после вирусной инфекции.

Примечательно, что, воспользовавшись преимуществами микроматрицы на основе пептидов, охватывающей протеом SARS-CoV-2, мы дополнительно выявили кинетику распознавания эпитопов и идентифицировали панель доминантных эпитопов, способных опосредовать долгосрочный гуморальный иммунитет. Результаты, о которых мы сообщаем здесь относительно продолжительности гуморального иммунного ответа после заражения SARS-CoV-2, подтверждают некоторые ранее опубликованные данные5,10,12,13,42, но расширяют их за счет выполнения глубокого серологического профилирования и эпитопного скрининга с использованием продольных образцов сыворотки. от людей с COVID-19 с помощью полнопротеомного микрочипа. В этом исследовании мы идентифицировали 4 доминантных эпитопа (пептиды 318, 356, 510 и 530) в белке S SARS-CoV-2, который был способен устойчиво реагировать с более чем 80% пациентов с COVID-19. образцы протестированы через 180–220 дней после появления симптомов. Пептид 510 (S, а.а. 813-827), включающий сайт расщепления S2 и FP субъединицы S2, обычно выявлялся в предыдущих исследованиях других групп.26,28,32-34 Функциональные анализы показали наличие антител. нацеливание на эту область может проявлять ограниченную эффективность нейтрализации против SARS-CoV-226,33 несмотря на то, что он сильно подвергается воздействию на поверхности белка S (рис. 4, AC). В случае пептида 530 (S, а.а. 893-907), который расположен между FP и первой гептадной областью повтора субъединицы S2, остатки обычно похоронены внутри тримерной структуры белка S, что делает его труднодоступен благодаря надежным нейтрализующим антителам против SARS-CoV-2 (рис. 4, AC). Кроме того, были также выбраны 2 пептида, направленных на S1-NTD, которые могли бы опосредовать долгосрочные реакции антител на SARS-CoV-2. Анализ последовательности и местоположения пептида показал, что остатки этих двух пептидов — пептида 318 (S, aa 45-59) и пептида 356 (S, aa 197-211) — находятся в непосредственной близости от известных эпитопов. с помощью антител, усиливающих инфекцию23,25, но за исключением ключевых сайтов высокоэффективных нейтрализующих антител, нацеленных на NTD субъединицы S1,16,19,43 что позволяет предположить возможность распознавания эпитопа ненейтрализующими антителами к этим двум идентифицированным пептидам. В дополнение к деталям, упомянутым выше, иммунизация мышей выбранными пептидами дополнительно показала низкую эффективность этих линейных пептидов нерецепторсвязывающего домена в индукции устойчивых ответов нейтрализующих антител (рис. 4, G). В совокупности эти данные позволяют предположить, что доминантные линейные эпитопы, опосредующие долгосрочные гуморальные иммунные ответы на инфекцию SARS-CoV-2, вероятно, индуцируют антитела с нулевой или ограниченной нейтрализующей активностью. Более полное понимание эпитопного ландшафта антител к SARS-CoV-2, особенно эпитопов, направленных на S-белок, дает новое понимание функционального разделения антител, что еще больше облегчает разработку инновационных и рациональных вакцин. Нейтрализующие антитела обеспечивают защиту от вирусных инфекций, тогда как ненейтрализующие антитела могут играть полезную, нейтральную или даже вредную роль в процессе удаления вируса. Ненейтрализующие антитела обеспечивают дополнительную защиту in vivo посредством ряда Fc-опосредованных эффекторных функций в контексте антителозависимого фагоцитоза и антителозависимой цитотоксичности. Напротив, некоторые исследования предположили возможность патогенной роли ненейтрализующих антител при коронавирусной инфекции. В предыдущих исследованиях с использованием нескольких типов вакцин-кандидатов против SARS-CoV и MERS-CoV наблюдалось усиление иммунопатологии у вакцинированных мелких животных и приматов, не являющихся человеком, после заражения вирусом. антитела, нацеленные на NTD белка S SARS-CoV-2, были способны усиливать вирусную инфекцию in vitro посредством механизмов, независимых от рецептора Fcg,23,25 хотя было показано, что пассивно вводимые антитела, усиливающие инфекцию, на животных моделях защищают от SARS -CoV-2 инфекция in vivo. Учитывая противоречивую роль антител при коронавирусной инфекции, необходимы дальнейшие исследования для подтверждения потенциальной роли антител в распознавании этих доминантных и персистентных эпитопов в борьбе с вирусной инфекцией in vivo. Следующий этап разработки рациональной вакцины против SARS-CoV-2 может быть задуман путем выявления высокоэффективных нейтрализующих антител и защитных ненейтрализующих антител, а также уменьшения количества эпитопов, усиливающих инфекцию, или иммунодоминантных эпитопов, которые не имеют благотворное воздействие. Хотя ряд предыдущих исследований был сосредоточен только на белке S SARS-CoV-2 с целью определить функции антител в отношении нейтрализации, мы выполнили комплексное картирование эпитопов всего протеома и идентифицировали панель эпитопов в полипротеине ORF1ab, которые с течением времени последовательно распознавался в большом количестве образцов сыворотки пациентов. Хотя эти ORF1ab-направленные пептиды, распределенные по множеству неструктурных белков, могут не вызывать функциональные антитела, нацеленные на вирион SARS-CoV-2, они могут быть применимы в качестве диагностического инструмента, помогающего отличить естественную инфекцию от вакцинации. С ростом числа реципиентов вакцины во всем мире современные серологические тесты на основе белка S и белка N сталкиваются с проблемами как эффективный подход, помогающий молекулярным тестам для обнаружения инфекции SARS-CoV-2, а также для выявления инфекции SARS-CoV-2. определение иммунного статуса после вирусной инфекции. Используя преимущества наиболее распространенных и устойчиво реактивных пептидов в ORF1ab среди людей, инфицированных COVID, серологическая диагностика естественной инфекции будет проводиться без учета статуса вакцинации с использованием рецептор-связывающего домена, белка S- Подходы к созданию вакцин на основе инактивированных вирусов. Необходимы будущие исследования для оценки реактивности, чувствительности и специфичности идентифицированных пептидов ORF1ab в более крупных когортах, включающих как людей, инфицированных SARSCoV-2, так и реципиентов вакцины. Кроме того, потребуется дальнейшая оценка эффективности обнаружения с помощью стратегий комбинирования нескольких пептидов, чтобы преодолеть более низкую чувствительность пептидов по сравнению с полноразмерным белком и возможную перекрестную реактивность среди распространенных коронавирусов человека. Основными ограничениями нашего исследования являются относительно небольшое количество образцов, полученных от небольшой группы пациентов, и у большинства участников наблюдались нетяжелые заболевания COVID-19. Это может ограничить некоторые наши выводы относительно частоты положительных ответов и величины иммунных ответов, которые могут варьироваться в зависимости от тяжести заболевания. Тем не менее, данные, представленные в этом исследовании, дают ценную информацию о кинетике иммунных ответов с течением времени после заражения SARS-CoV-2 и особенностях доминантных эпитопов, способных опосредовать устойчивый гуморальный иммунитет у людей с COVID-19. В совокупности эти результаты предлагают более глубокое понимание долговечности естественного иммунитета, вызванного вирусной инфекцией, и имеют широкое значение для инновационных стратегий вакцинации и улучшения диагностических подходов.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Лу Р, Чжао X, Ли Дж, Ню П, Ян Б, Ву Х и др. Геномная характеристика и эпидемиология нового коронавируса 2019 года: значение для происхождения вируса и связывания с рецепторами. Ланцет 2020;395:565-74.

2. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ). Информационная панель ВОЗ по коронавирусу (COVID-19), 2021 г. Доступно по адресу: https://COVID19.who.int/. По состоянию на 30 ноября 2021 г.

3. Ву З, Макгуган Дж.М. Характеристики и важные уроки вспышки коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) в Китае: сводка отчета Китайского центра по контролю и профилактике заболеваний о 72314 случаях. JAMA 2020;323:1239-42.

4. Рыдызнский Модербахер С., Рамирес С.И., Дэн Дж.М., Грифони А., Хасти К.М., Вайскопф Д. и др. Антигенспецифический адаптивный иммунитет к SARS-CoV-2 при остром COVID-19 и его связь с возрастом и тяжестью заболевания. Ячейка 2020;183:996-1012.e19.

5. Ву Дж, Лян Б, Чен С, Ван Х, Фан Ю, Шен С и др. Инфекция SARS-CoV-2 вызывает устойчивые гуморальные иммунные реакции у выздоравливающих пациентов после симптоматического COVID-19. Nat Commun 2021;12:1813.

6. Лонг QX, Лю БЗ, Дэн Х.Дж., Ву Г.К., Дэн К., Чен Ю.К. и др. Реакция антител на SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19. Nat Med 2020;26:845-8.

7. Стерлин Д., Матиан А., Мияра М., Мор А., Анна Ф., Клаер Л. и др. IgA доминирует в ранней реакции нейтрализующих антител на SARS-CoV-2. Sci Transl Med 2021;13: eabd2223.

8. Чжан Дж, Ву Ц, Лю Цз, Ван Ц, Ву Дж, Ху Ю и др. Спайк-специфические циркулирующие Т-фолликулярные хелперные клетки и реакция перекрестно-нейтрализующих антител у людей, выздоравливающих от COVID-19. Nat Microbiol 2021;6:51-8.

9. Ван П., Лю Л., Наир М.С., Инь М.Т., Ло Й., Ван К. и др. Реакция нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 более устойчива у пациентов с тяжелым заболеванием. Emerg Microbes Infect 2020;9:2091-3.

10. Ваншилла К., Ди Кристанциано В., Клейпасс Ф., Девальд Ф., Шоммерс П., Гизельманн Л. и др. Кинетика и корреляты реакции нейтрализующих антител на инфекцию SARSCoV-2 у людей. Клетка-хозяин Microbe 2021;29:917-29.e4.

11. Сян Т., Лян Б., Фан Ю., Лу С., Ли С., Ван Х. и др. Снижение уровня нейтрализующих антител против SARS-CoV-2 у выздоравливающих пациентов с COVID-19 через год после появления симптомов. Фронт Иммунол 2021;12:708523.

12. Ван З., Мюкш Ф., Шефер-Бабаев Д., Финкин С., Виант С., Геблер С. и др. Естественно усиленная широта нейтрализации против SARS-CoV-2 через год после заражения. Природа 2021;595:426-31.

13. Дэн Дж.М., Матеус Дж., Като Ю., Хасти К.М., Ю.Э.Д., Фалити С.Э. и др. Иммунологическая память к SARS-CoV-2 оценивается в течение 8 месяцев после заражения. Наука 2021;371:eabf4063.

14. Сокал А., Чапперт П., Барба-Спет Г., Розер А., Фурати С., Аззауи И. и др. Созревание и устойчивость ответа В-клеток памяти против SARS-CoV-2. Ячейка 2021; 184:1201-13.e14. 15. Цзюй Б, Чжан Ц, Ге Дж, Ван Р, Сунь Дж, Ге Х и др. Человеческие нейтрализующие антитела, вызванные инфекцией SARS-CoV-2. Природа 2020;584:115-9.

16. Лю Л., Ван П., Наир М.С., Ю Дж., Рапп М., Ван К. и др. Мощные нейтрализующие антитела против нескольких эпитопов на пике SARS-CoV-2. Природа 2020;584:450-6.

17. Зост С.Дж., Гильчук П., Кейс Дж.Б., Бинштейн Э., Чен Р.Э., Нколола Дж.П. и др. Мощно нейтрализующие и защитные человеческие антитела против SARS-CoV-2. Природа 2020; 584:443-9.

18. Сюй С., Ван Юй, Лю С., Чжан С., Хань В., Хун Икс и др. Конформационная динамика тримерного спайкового гликопротеина SARS-CoV-2 в комплексе с рецептором ACE2, выявленная методом криоЭМ. Sci Adv 2021;7:eabe5575.

19. МакКаллум М., Де Марко А., Лемпп Ф.А., Торторичи М.А., Пинто Д., Уоллс А.С. и др. Антигенное картирование N-концевого домена выявляет участок уязвимости для SARSCoV-2. Ячейка 2021;184:2332-47.e16.

20. Зауэр М.М., Торторичи М.А., Парк Ю.Дж., Уоллс А.С., Хомад Л., Актон О.Дж. и др. Структурная основа широкой нейтрализации коронавируса. Nat Struct Mol Biol 2021;28:478-86.

21. Торторичи М.А., Бельтрамелло М., Лемпп Ф.А., Пинто Д., Данг Х.В., Розен Л.Е. и др. Сверхмощные человеческие антитела защищают от заражения SARS-CoV-2 с помощью нескольких механизмов. Наука 2020;370:950-7.

22. Пинто Д., Парк Ю.Дж., Бельтрамелло М., Уоллс А.К., Торторичи М.А., Бьянки С. и др. Перекрестная нейтрализация SARS-CoV-2 человеческим моноклональным антителом к ​​SARS-CoV. Природа 2020;583:290-5.

23. Лю Ю, Со В.Т., Кисикава Дж.И., Хиросе М., Накаяма Э.Э., Ли С. и др. Сайт, повышающий инфекционность, на шиповом белке SARS-CoV-2, на который нацелены антитела. Ячейка 2021; 184:3452-66.e18.

24. Лю Л., Вэй Ц., Линь К., Фанг Дж., Ван Х., Квок Х. и др. Антиспайковые IgG вызывают тяжелое острое повреждение легких, искажая реакцию макрофагов во время острой инфекции SARS-CoV. JCI Insight 2019;4:e123158.

25. Ли Д., Эдвардс Р.Дж., Манн К., Мартинес Д.Р., Шафер А., Алам С.М. и др. Функции антител, усиливающих и нейтрализующих инфекцию SARS-CoV-2, in vitro и in vivo. Ячейка 2021;184:4203-19.e32. 26. Пох СМ, Кариссимо Дж., Ван Б., Амрун С.Н., Ли С.И., Чи Р.С. и др. Два линейных эпитопа белка-шипа SARS-CoV-2 вызывают нейтрализующие антитела у пациентов с COVID-19. Nat Commun 2020;11:2806.

27. Чжан Б.З., Ху Ю.Ф., Чен Л.Л., Яу Т., Тонг Ю.Г., Ху Дж.К. и др. Добыча эпитопов шиповидного белка SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19. Cell Res 2020;30:702-4.

28. Стоддард К.И., Галлоуэй Дж., Чу Х.И., Шипли М.М., Сунг К., Ителл Х.Л. и др. Профилирование эпитопов выявляет признаки связывания иммунного ответа SARS-CoV-2 при естественной инфекции и перекрестную реактивность с эндемичными человеческими CoV. Cell Rep 2021;35: 109164.

29. Шрок Э., Фуджимура Э., Кула Т., Тиммс Р.Т., Ли И.Х., Ленг Ю. и др. Профилирование вирусных эпитопов пациентов с COVID-19 выявляет перекрестную реактивность и коррелирует с тяжестью заболевания. Наука 2020;370:eabd4250.

30. Замечник Ч.Р., Раджан Й.В., Ямаути К.А., Манн С.А., Лаудермилк Р.П., Сова Г.М. и др. ReScan, мультиплексный диагностический конвейер, проверяет человеческую сыворотку на наличие антигенов SARS-CoV-2- 2. Cell Rep Med 2020;1:100123.

31. Хейнс В.А., Камат К., Бозековски Дж., Баум-Джонс Е., Кэмпбелл М., Казановас Массана А. и др. Картирование эпитопов высокого разрешения и характеристика антител к SARS-CoV-2 у больших групп пациентов с COVID-19. Коммун Биол 2021;4:1317.

32. Ли Ю, Лай ДЮ, Лэй Ц, Сюй ЗВ, Ван Ф, Хоу Х и др. Систематическая оценка ответов IgG на пептиды, полученные из шиповидного белка SARS-CoV-2, для мониторинга пациентов с COVID-19. Селл Мол Иммунол 2021;18:621-31.

33. Ли Ю, Ма МЛ, Лей Кью, Ван Ф, Хонг В, Лай ДЮ и др. Линейный ландшафт эпитопов шиповидного белка SARS-CoV-2, созданный на основе 1051 пациента с COVID-19. Cell Rep 2021;34:108915.

34. Ван Х, Ву X, Чжан X, Хоу X, Лян Т, Ван Д и др. Протеомный микрочип SARS-CoV-2 для картирования взаимодействий антител с COVID-19 при разрешении аминокислот. ACS Cent Sci 2020;6:2238-49.

35. И З, Лин Ю, Чжан Икс, Чэнь Дж, Ху К, Ван Ю и др. Функциональное картирование линейных эпитопов B-клеток SARS-CoV-2 в выздоравливающей популяции COVID-19. Emerg Microbes Infect 2020;9:1988-96.

36. Национальная комиссия здравоохранения и Национальное управление традиционной китайской медицины. Протокол диагностики и лечения новой коронавирусной пневмонии (пробная версия 7). Чин Мед Дж. (Англия) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/CM9.0000000000000819.

37. Ли Ю, Ли CQ, Го С.Дж., Го В., Цзян Х.В., Ли Х.К. и др. Продольное профилирование репертуара аутоантител в сыворотке крови идентифицирует биомаркеры, связанные с хирургическим вмешательством, при аденокарциноме легких. EBioMedicine 2020;53:102674.

38. Чжао Дж, Юань Ц, Ван Х, Лю В, Ляо X, Су Ю и др. Реакция антител на SARSCoV-2 у пациентов с новым коронавирусным заболеванием 2019. Clin Infect Dis 2020;71: 2027-34.

39. Лукас С., Вонг П., Кляйн Дж., Кастро ТБР, Сильва Дж., Сундарам М. и др. Продольный анализ выявил иммунологические сбои при тяжелом течении COVID-19. Природа 2020;584: 463-9.

40. Мур Дж. Б., Джун Ч. Синдром выброса цитокинов при тяжелом течении COVID-19. Наука 2020;368:473-4.

41. Чен Дж., Мэлоун Б., Ллевелин Э., Грассо М., Шелтон ПММ, Олинарес ПДБ и др. Структурная основа геликазо-полимеразного сцепления в репликационно-транскрипционном комплексе SARS-CoV-2. Ячейка 2020;182:1560-73.e13.

42. Вайнберг А., Аманат Ф., Фирпо А., Альтман Д.Р., Бейли М.Дж., Мансур М. и др. Устойчивые нейтрализующие антитела к инфекции SARS-CoV-2 сохраняются в течение нескольких месяцев. Наука 2020; 370:1227-30.

43. Чи X, Ян Р, Чжан Дж, Чжан Г, Чжан Ю, Хао М и др. Нейтрализующее человеческое антитело связывается с N-концевым доменом шиповидного белка SARS-CoV-2. Наука 2020;369:650-5.

44. Ценг К.Т., Сбрана Э., Ивата-Ёсикава Н., Ньюман ПК, Гаррон Т., Атмар Р.Л. и др. Иммунизация вакцинами против коронавируса SARS приводит к легочной иммунопатологии при заражении вирусом SARS. PLoS One 2012;7:e35421.

45. Боллес М., Деминг Д., Лонг К., Агнихотрам С., Уитмор А., Феррис М. и др. Двойная инактивированная коронавирусная вакцина против тяжелого острого респираторного синдрома обеспечивает неполную защиту у мышей и индуцирует усиление эозинофильной провоспалительной легочной реакции при заражении. Дж. Вирол 2011;85:12201-15.

46. ​​Вейнгартль Х., Чуб М., Чуб С., Нойфельд Дж., Марсал П., Грен Дж. и др. Иммунизация модифицированной рекомбинантной вакциной против тяжелого острого респираторного синдрома, полученной в Анкаре, связана с усилением гепатита у хорьков. Дж. Вирол 2004;78:12672-6.

47. Ясуи Ф., Кай С., Китабатаке М., Иноуэ С., Йонеда М., Ёкочи С. и др. Предварительная иммунизация нуклеокапсидным белком коронавируса (SARS-CoV), ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом (SARS), вызывает тяжелую пневмонию у мышей, инфицированных SARS-CoV. J Immunol 2008;181:6337-48.

48. Деминг Д., Шихан Т., Хейз М., Йонт Б., Дэвис Н., Симс А. и др. Эффективность вакцины на стареющих мышах, зараженных рекомбинантным SARS-CoV, несущим эпидемические и зоонозные варианты. PLoS Med 2006;3:e525.

49. Ван Ц, Чжан Л, Кувахара К, Ли Л, Лю З, Ли Т и др. Иммунодоминантные эпитопы коронавируса SARS у людей оказывали как усиливающее, так и нейтрализующее действие на инфекцию у приматов, кроме человека. ACS Infect Dis 2016;2: 361-76.

50. Агравал А.С., Тао X, Алгайси А., Гаррон Т., Нараянан К., Пэн Б.Х. и др. Иммунизация инактивированной вакциной против коронавируса ближневосточного респираторного синдрома приводит к иммунопатологии легких при заражении живым вирусом. Hum Vaccin Immunother 2016;12:2351-6.