Мета-анализ идентифицирует метилирование ДНК, связанное с функцией и повреждением почек

edmund.chen@wecistanche.com

ХроническийБолезнь почекявляется серьезным бременем для общественного здравоохранения. Повышенное отношение альбумина к креатинину в моче является меройповреждение почек,и используется для диагностики и стадии хроническогоБолезнь почек. Расширить знания о регуляторных механизмах, связанных сфункция почеки болезни, мы провели эпигеномное ассоциативное исследование на основе крови для оценки скорости клубочковой фильтрации (n=33, 605) и отношения альбумина к креатинину в моче (n=15, 068) и обнаружили 69 и семь сайтов CpG, где метилирование ДНК было связано с соответствующим признаком. Большинство этих результатов показали направленно последовательные ассоциации с соответствующими клиническими исходами хроническогоБолезнь почеки умеренно повышенная альбуминурия. Ассоциации метилирования ДНК сфункция почек, такие как CpG в JAZF1, PELI1 и CHD2, были подтверждены впочечная ткань. Метилирование в PHRF1, LDB2, CSRNP1 и IRF5 указывает на причинно-следственные эффекты нафункция почек. Анализ обогащения выявил пути, связанные с гемостазом и миграцией клеток крови для расчетной скорости клубочковой фильтрации, а также активацию иммунных клеток и реакцию на CpG, связанные с соотношением альбумина и креатинина в моче.

Ключевые слова:Болезнь почек; поражение почек; функция почек; ткань почки; структура почек

хроническийБолезнь почек(ХБП) является серьезным бременем для общественного здравоохранения. Им страдают более 10 процентов взрослых во всем мире и более 40 процентов лиц в возрасте 70 лет и старше1,2. ХБП является ведущей причиной смерти во всем мире3 и вносит основной вклад в сердечно-сосудистую заболеваемость и смертность2,4,5. ХБП определяется как устойчивое наличие аномалийпочкаструктуру или функцию.функция почекнаиболее часто используемыми показателями являются скорость клубочковой фильтрации, обычно оцениваемая по концентрации креатинина в сыворотке (eGFR), и отношение альбумина к креатинину в моче (UACR)6. Повышенный UACR является меройповреждение почек, используется для диагностики и определения стадии ХБП7 и ассоциируется с диабетической и гипертонической болезнью.Болезнь почек8. Даже умеренно повышенный UACR является фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний независимо от другихфункция почек markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 генетических локусов, связанных сфункция почек10,12,13. Варианты индекса в известных локусах, связанных с рСКФ, объясняют примерно 8,9% дисперсии рСКФ12.Недавний мета-анализ GWAS eGFR интегрировал открытые области хроматина с небольшими наборами однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)10. Результаты этого исследования подтверждают важность измененной регуляции транскрипции как механизма, способствующего ХБП. Чтобы исследовать метилирование ДНК, в отношениифункция почекбыли проведены эпигеномные ассоциативные исследования (EWAS) рСКФ и ХБП. В качестве ключевого регулятора транскрипции, который можно оценить экономически эффективным и высокопроизводительным способом, метилирование ДНК было изучено в CpG-сайтах (CpG) с разрешением по одному основанию. Ранее мы провели EWAS, включив 4859 взрослых из двух популяционных исследований, и выявили 18 подтвержденных участков дифференциального метилирования в цельной крови, связанных с рСКФ14. Хотя это исследование выявило понимание механизмов регуляции геновпочкафункции, связанные CpG объясняли только 1,2 процента дисперсии рСКФ. Другие предыдущие исследования были сосредоточены на пациентах с ХБП и/или на пациентах с диабетом или на пациентах с инфекцией, вызванной вирусом иммунодефицита человека, или были ограничены небольшим размером выборки, отсутствием репликации, отсутствующей поправкой на потенциальные искажающие факторы или их комбинацией14–19. Другие исследования были сосредоточены на моделях метилирования ДНК диабетиков.Болезнь почек(DKD) пациентов 20–22.

CISTANCHE УЛУЧШИТ ЗАБОЛЕВАНИЕ ПОЧЕК / ПОЧЕК

Здесь мы провели EWASфункция почекпризнаков для выявления дополнительных CpG, связанных с механизмами регуляции генов, потенциально важными для ХБП. Мы расширили прежний EWAS для рСКФ и ХБП, существенно увеличив размер выборки до 33 605 человек. Кроме того, в качестве дополнительных признаков мы включили UACR и умеренно повышенную альбуминурию (микроальбуминурию). EWAS проводились в основном в популяционных исследованиях с поправкой на пол, возраст, диабет, гипертонию, индекс массы тела (ИМТ), статус курения и наиболее распространенные пропорции лейкоцитов. Мы воспроизвели результаты EWAS в отдельных образцах, связали сайты CpG с уровнями экспрессии генов в разных тканях, применили результаты к клиническим исходам и оценили причинно-следственную связь между метилированием ДНК ифункция почек(Дополнительный рис. 1).

Полученные результаты

Характеристики образца исследования. В этом исследовании 36 исследований с общим числом участников 33 605 внесли свой вклад в EWAS рСКФ и 15 068 исследований в EWAS UACR. Их объединенные характеристики показаны в таблице 1, а описания отдельных исследований представлены в дополнительных данных 1 и 2.

EWAS рСКФ и UACR.Мы исследовали ассоциациюпочкапризнаки с метилированием ДНК в крови до 441 870 CpG, перекрытие CpG, охватываемое Illumina MethylationnEPIC BeadChip и массивом Illumina HumanMethylation450 BeadChip, которые использовались для измерения во всех исследованиях, кроме одного (дополнительные данные 3). Во всех исследованиях выполнялась очистка данных массива и применялись централизованно разработанные скрипты для подготовкипочказначения признаков, которые впоследствии были связаны с метилированием ДНК с использованием моделей линейной регрессии с поправкой на ковариацию со значениями метилирования в качестве зависимой переменной в соответствии с заранее определенными протоколами исследования (см. Методы). Мы наблюдали отсутствие или небольшую инфляцию в EWAS для конкретного исследования (средняя инфляция eGFR=1.00, средняя инфляция UACR=1.00, дополнительные данные 1 и 2). В трансэтническом EWAS с поправкой на несколько переменных 69 CpG были в значительной степени связаны с рСКФ и реплицировались (рис. 1А, дополнительные данные 4, см. Методы), включая ранее сообщенные14. Реплицированные сайты показали четкую картину более низкого метилирования (60 CpG, Pbinom=2.2E-10; рис. 1A).

Рис. 1 Результаты EWAS рСКФ и UACR. Чикагские графики результатов эпигеномного ассоциативного исследования (EWAS) для расчетной скорости клубочковой фильтрации (eGFR) (A) и отношения альбумина к креатинину в моче (UACR) (B) с использованием комбинированного образца обнаружения и повторения. Сайты упорядочены по их хромосомному положению на оси абсцисс, а их P-значение –log10 ассоциативного теста Вальда указано на оси ординат. В верхней части нанесены CpG, положительно коррелирующие с признаком, в нижней — сайты с отрицательной корреляцией. Пунктирные горизонтальные линии представляют уровень значимости (P-значение <1,1e-7). новые="" сайты="" репликации="" окрашены="" в="" оранжевый="" цвет,="" известные="" сайты="" репликации="" окрашены="" в="" бирюзовый="" цвет,="" а="" сайты,="" которые="" были="" дополнительно="" связаны="" с="" соответствующим="" бинарным="" признаком="">Болезнь почек[ХБП]/микроальбуминурия [МА]) отмечены крестиком.

В метаанализе самые низкие значения P наблюдались для известных ассоциаций рСКФ, включая cg17944885 (ZNF788,=-1,75E-04, значение P=8.7E-41), cg23597162 (JAZF1 ,=-1,48E-04, значение P=3.2E-24) и cg06158227 (ZSCAN29,=-1,08E-04, значение P=8 .7E-20)14, за которым следует новый поиск по адресу cg20777437 (CDCP2,=-8,28E-05, значение P=1.1E-17). Одни только 69 повторных CpG, связанных с рСКФ, объясняли 15,7% вариаций рСКФ в отдельной выборке исследования из 1888 участников (см. Методы). При добавлении всех ковариант (пол, возраст, диабет, гипертония, ИМТ, курение и доля лейкоцитов) в ассоциативную модель общая доля объясняемой дисперсии рСКФ увеличилась до 36,3%, при этом вариация на 2,4% связана с 69 CpG. независимо от других ковариат.

В трансэтническом анализе UACR семь CpG были значительно связаны и реплицированы (рис. 1B, дополнительные данные 5, см. Методы). Из результатов cg18181703 (SOCS3,=-2,58E-03, значение P=2.6E-13) и cg02711608 (SLC1A5,=-1,63 E-03, P-значение=9.9E-13) имел наименьшие P-значения ассоциации метаанализа. В шести из семи CpG более низкое метилирование было связано с более высоким UACR. Из-за количества повторяющихся сайтов мощность биномиального теста была ограничена (6 CpG, pbinom=0.13; рис. 1B). Воспроизведенные CpG объяснили 3,9 процента, а полная модель — 14,6 процента вариации уровней UACR, при этом 0,07 процента относились к CpG независимо от других ковариат.

Было небольшое перекрытие между реплицированными локусами EWAS и ранее зарегистрированными локусами GWAS как для eGFR (перекрытие=10 из 69; дополнительные данные 4), так и для UACR (перекрытие=1 из 7; дополнительные данные 5). Не было перекрытия реплицированных CpG между eGFR и UACR, что указывает на характерные для признаков профили метилирования ДНК в крови. Даже среди 967 и 270 предполагаемых ассоциаций (P-значение <1e-05) комбинированного="" метаанализа="" образцов="" обнаружения="" и="" репликации="" для="" egfr="" и="" uacr,="" соответственно,="" только="" 10="" сайтов="" перекрываются="" между="" обоими="" признаками.="" подробные="" результаты="" этих="" метаанализов="" для="" всех="" предполагаемых="" ассоциаций="" представлены="" в="" дополнительных="" данных="" 6="" (рскф)="" и="" 7="">Неоднородность происхождения и надежность результатов. Чтобы оценить, могут ли результаты ассоциации по рСКФ и UACR быть обусловлены конкретным происхождением, мы провели стратифицированный по происхождению метаанализ EWAS образцов европейского происхождения (EA) и афроамериканского происхождения (AA) с результатами нескольких исследований, способствующих этим двум этносы. Сравнение результатов ассоциации реплицированных CpG в образцах EA (Negar=23, 671; nUACR=9806) с образцами AA (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) в или в пределах 50 п.н. 69 реплицированных CpG оценивали, чтобы оценить, может ли присутствие SNP влиять на связывание зонда. Четыре зонда располагались рядом с общим SNP (дополнительные данные 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg06930757-rs112223111). не были связаны ни с одним признаком GWAS согласно ресурсу PhenoScanner V2 (по состоянию на 12.02.2021, pGWAS < 5e−8,="" включая="" прокси-snp="" с="" eur="" r²=""> 0,8)23. Это указывает на то, что результаты EWAS вряд ли будут искажены общей чертой, которая, как известно, связана сфункция почекблизлежащей изменчивостью последовательности ДНК. Внутренние SNP зонда, которые были более чем на пять оснований от 3'-конца зонда, как правило, имели незначительные последствия 24 .

Связь с ХБП и микроальбуминурией.Из 69 CpG, связанных с рСКФ, 53 также были связаны с распространенной ХБП в метаанализе 25,609 человек, включая 2376 случаев с постоянным направлением эффекта (значение P <0). 05/69;="" дополнительные="" данные="" 4,="" дополнительный="" рис.="" 3a).="" корреляция="" между="" рскф="" и="" эффектами="" хбп="" была="" высокой="" (r="-0,93;" рис.="" 3а).="" в="" независимой="" когорте="" из="" 551="" пациента="" с="" хбп="" 65="" cpg="" были="" направленно="" совместимы="" с="" мета-анализом="" рскф="" и="" пять="" реплицировались="" (значение="" p=""><0,05 9,="" r="0,77;" дополнительная="" рис.="" 4,="" дополнительные="" данные="" 4,="" см.="" методы).="" в="" той="" же="" когорте="" связанные="" с="" рскф="" cpg="" cg18194850="" (значение="" p="1.6E-5)" и="" cg07242931="" (значение="" p="2.3E-5)" также="" были="" связаны="" со="" временем="">почечная недостаточностьили острыйповреждение почек(Дополнительные данные 8, см. Методы). Все семь CpG, связанные с UACR, также были значительно связаны с микроальбуминурией в выборке из 7279 человек, включая 1186 случаев с тем же направлением действия, что и для UACR (значение P < 0,05/7,="" r="" {{7}="" },98;="" рис.="" 3b,="" дополнительные="" данные="" 5,="" дополнительный="" рис.="">

Корреляция с экспрессией генов. Чтобы получить представление о возможных функциональных механизмах CpG, связанных с eGFR и UACR, мы проверили корреляцию уровней метилирования их ДНК с уровнями мРНК генов, кодируемых в цис-положении, в цельной крови, а также в моноцитах крови (см. Методы, дополнительные данные 9). ). Известный eGFR-ассоциированный cg17944885 на хромосоме 19 рядом с ZNF788 был связан с транскриптом, кодируемым белком цинкового пальца 439 на расстоянии 240 т.п.н. (ZNF439, таблица 2). Кроме того, метилирование cg04864179 в регуляторном факторе интерферона 5 (IRF5) было связано как с транскриптами мРНК, кодируемыми IRF5, так и с соседним транспортином 3 (TNPO3) (дополнительная рис. 5A). Из ассоциаций UACR два реплицированных CpG cg02711608 и cg22304262 у члена 5 семейства переносчиков растворенных веществ 1 (SLC1A5) выявили значительные ассоциации с уровнями мРНК SLC1A5, а cg23570810 у интерферон-индуцированного трансмембранного белка 1 (IFITM1) с его транскриптами в цис-положении (табл. 2). Все результаты анализа экспрессии генов представлены в дополнительных данных 9.

Воздействие на ткани почек.Чтобы оценить, переводятся ли наблюдаемые эффекты метилирования в крови наткань почки,мы применили регрессионную модель для проверки ассоциаций реплицированных CpG на достоверность (коэффициент ложных открытий (FDR) < 0,05) и согласованную по направлению ассоциацию с рСКФ ипочкафиброз соответственно в 506 микрорассеченныхпочечная тканьобразцы. В этих образцахпочкаТканевое метилирование ДНК реплицированных eGFR-ассоциированных CpG cg23597162 в JAZF1, cg26099045 вблизи PELI1 и cg12644285 в CHD2 было в значительной степени связано с eGFR с тем же направлением действия, что и в крови (дополнительная рис. 6A, таблица 2, дополнительные данные 10) . Кроме того, тот же CpG в PELI1 и шесть дополнительных

сайты (cg20146909 в LRRC8D, cg25767870 рядом с FAM46C, cg16618493 в ZBTB7B, cg10632966 рядом с RPEL1, cg01068906 в NOD2 и cg03297731 в GDPD3) были связаны с фиброзом впочкаобразцы тканей с последовательными (то есть обратными) направлениями воздействия (дополнительная рис. 6B, таблица 2). Из реплицированных сайтов UACR уровни метилирования ДНК впочкаткани cg00008629 в PTBP3 и cg24859433 вблизи IER3 были связаны с фиброзом и показали одинаковое направление эффекта (дополнительная рис. 6D, таблица 2). В соответствии с выводами EWAS, не было обнаружено значительной связи CpG, связанных с UACR, с рСКФ у доноров образцов почек (дополнительная рис. 6C, дополнительные данные 10).

Причинно-следственные связи между метилированием ДНК ифункция почекчерты. Чтобы оценить, является лифункция почекпризнаки причинно влияют на метилирование ДНК или наоборот, мы провели двунаправленный двухвыборочный менделевский рандомизационный (MR) анализ значимо связанных CpG. МР-анализ в прямом направлении показал, что CpG cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) и cg04864179 (IRF5) причинно влияют на уровни рСКФ (таблица 3). Оценки наследуемости этих четырех CpG различались среди трех наборов данных из популяций европейского происхождения, но были постоянно выше, чем средняя наследуемость по всем CpG, оцененным в каждом из трех исследований: 0,34 (каузальные CpG рСКФ) против 0,16 (матрица HM450K). на основе Hannon et al.25, 0,55 против 0,19 для Dongen et al.26 и 0,51 против 0,19 для McRae et al.27. Никаких существенных причинно-следственных ассоциаций не было выявлено ни для каких CpG, связанных с UACR. Для обратного MR единственным значительным эффектом было влияние рСКФ на cg23597162 (JAZF1) при использовании метода первичной обратной дисперсии. Тем не менее, никаких значительных эффектов не было выявлено/наблюдалось при множественных анализах чувствительности обратной МРТ. Анализ исключения не показал каких-либо указаний на то, что результаты МРТ могут быть обусловлены одним SNP. Кроме того, за исключением SNP, которые были связаны с сахарным диабетом 2 типа, являющимся основным фактором риска дляБолезнь почекне привели к разным выводам. Результаты для всех первичных и чувствительных МР-анализов показаны в дополнительных данных 11 и 12 и на дополнительном рисунке 7. Анализы чувствительности подтверждают первичные результаты значимых прямых результатов МР (FDR < 0,05,="" см.="" методы)="" с="" согласованные="" в="" направлении="" оценки="" эффекта,="" указывающие="" на="" потенциальную="" причинно-следственную="" связь="" от="" метилирования="" днк="" до="" рскф,="" но="" не="">

Связывание факторов транскрипции, гистоновые метки и анализ обогащения путей. Мы выполнили анализ сайта связывания фактора транскрипции, гистоновой метки и обогащения пути на основе 967 CpG, которые показали предполагаемую связь с рСКФ (значение P <1e-05; дополнительные="" данные="" 6),="" и="" 270="" cpg,="" которые="" показали="" предполагаемую="" связь="" с="" uacr="" (значение="" p="">< 1e-5;="" дополнительные="" данные="" 7)="" в="" мета-анализе,="" чтобы="" максимизировать="" статистическую="" мощность="" анализа="" обогащения="" (см.="" методы)="" 14="" во-первых,="" мы="" оценили,="" предпочтительно="" ли="" связанные="" с="" egfr="" cpg="" картированы="" с="" сайтами="" связывания="" 169="" факторов="" транскрипции="" (tf)="" на="" основе="" хроматина.="" данные="" иммунопреципитационного="" секвенирования="" днк="" (chip-seq)="" из="" проекта="" encode,="" которые="" были="" агрегированы="" путем="" консенсуса="" по="" 91="" типу="" клеток="" человека="" (161="" дорожка="" tf)="" и="" дополнены="">почкатреки на основе тканей (см. Методы). После многократной корректировки тестирования для 169 TF восемь TF показали значительное обогащение для eGFR-ассоциированных CpG (FDR <0.05; рис.="" 4a,="" дополнительные="" данные="" 13),="" включая="" cebpb="" (значение="" p="1)." 75e-06,="" поперечная="" дорожка)="" и="" ep300="" (значение="" p="7.49E-09," поперечная="" дорожка).="" это="" согласуется="" с="" выводами="" чу="" и="" др.="" 14="" в="" меньшей="" подгруппе="" из="" 4859="" участников="" из="" 33="" 605="" проанализированных="" здесь="" участников.="" cpg,="" связанные="" с="" uacr,="" были="" обогащены="" сайтами="" связывания="" 56="" tf="" (рис.="" 4b,="" дополнительные="" данные="" 14)="" с="" наиболее="" сильной="" ассоциацией="" с="" polr2a="" (значение="" p="6,93E-19)," fos="" (значение="" p="" {{32="" }}.28e-12)="" и="" ep300="" (значение="" p="">

ПочкаCpG, связанные с функцией, были в целом обогащены несколькими гистоновыми метками, при этом 82 из 195 комбинаций типов клеток гистоновых меток были значимыми (FDR q <0.05) для="" рскф="" (рис.="" 4c,="" дополнительные="" данные="" 15)="" и="" 79="" из="" 195.="" для="" uacr="" (рис.="" 4d,="" дополнительные="" данные="" 16).="" модификация="" гистонов="" h3k4me1,="" метка,="" сконцентрированная="" на="" активных="" и="" праймированных="" энхансерах,="" была="" обогащена="" для="" всех="" типов="" клеток="" для="" uacr-ассоциированных="" cpg="" и="" почти="" для="" всех="" типов="" клеток="" для="" egfr-ассоциированных="" cpg.="" в="" то="" время="" как="" uacr-ассоциированные="" cpg="" показали="" обогащение="" промоторной="" меткой="" h3k4me3="" в="" 34="" типах="" клеток,="" только="" четыре="">

типы показали обогащение сайтов, связанных с eGFR. Напротив, связанная с телом гена метка H3K36me3 показала гораздо более широкое обогащение CpG, ассоциированных с eGFR (30 типов клеток), чем CpG, ассоциированных с UACR (пять типов клеток). В отличие от H3K3me1/3 и H3K36me3, которые все были связаны с активными генами (энхансеры, активные промоторы, активная транскрипция), H3K9me3 и H3K27me3, которые обычно связаны с конститутивным и факультативным гетерохроматином28–31, не были значительно обогащены UACR- связанные CpG в любом протестированном типе клеток (рис. 4D, дополнительные данные 16). Обогащение генов, связанных сфункция почек-ассоциированные CpG оценивались в базе данных Gene Ontology (GO), Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) и Reactome (см. Методы) 32–35. Значительное обогащение наблюдалось для 27 терминов (25 GO, один KEGG, один Reactome; дополнительные данные 17, рис. 5A) для eGFR и 91 термина (87 GO, четыре Reactome; дополнительные данные 18, рис. 5B) для UACR (рис. 5В). Пути, связанные с типоспецифической миграцией лейкоцитов, трансляцией мРНК, гемостазом и коагуляцией, а также ответом на инсулин, показали значительное обогащение для eGFR-ассоциированных CpG (FDR < 0,05;="" рис.="" 5a).="" в="" путях="" с="" наименьшими="" значениями="" p="" обогащения="" для="" uacr-ассоциированных="" сайтов="" доминировали="" активация="" и="" ответ="" иммунных="" клеток,="" а="" также="" пути,="" связанные="" с="" интерфероном="" (рис.="" 5b).="" дополнительные="" пути,="" которые="" были="" обогащены,="" включали="" миграцию="" лейкоцитов,="" что="" касается="" результатов="" рскф="" (дополнительные="" данные="">

Связь с известными ассоциациями EWAS с другими признаками. Учитывая наблюдаемое обогащение путей, связанных с иммунным ответом, результаты метилирования ДНК, включая CpG вблизи генов пути интерферона, и тот факт, что статус метилирования ДНК преимущественно оценивался в лейкоцитах, мы оценили, могут ли наши результаты быть обусловлены искажающими эффектами состояние иммунного ответа или воспаления. Таким образом, мы выполнили поиск реплицированных CpG в большом EWAS по высокочувствительным уровням C-реактивного белка (CRP) в сыворотке36. Только два CpG, которые также были связаны с метилированием ДНК и рСКФ вткань почки,cg09610644 в BDH1 и cg12644285 в CHD2 были среди сайтов, связанных с CRP. Таким образом, общее смешение наших результатов из-за воспалительного статуса, оцениваемого по СРБ, кажется маловероятным.

Некоторые изфункция почек-ассоциированные CpG, идентифицированные в этом исследовании, связаны с несколькими другими признаками на основе опубликованных EWAS. Двадцать один сайт рСКФ был связан с артериальным давлением, употреблением алкоголя, ИМТ, полом, рецептором растворимого фактора некроза опухоли 2 и/или статусом курения, а пять сайтов UACR ранее были связаны с потреблением алкоголя, статусом курения, ИМТ, уровнем образования, -глутамилтрансфераза, растворимый рецептор фактора некроза опухоли 2, сахарный диабет 2 типа и/или несколько метаболитов сыворотки (таблица 2, дополнительные данные 19). Три из этих CpG (все сайты UACR) были связаны более чем с двумя признаками, а именно cg02711608 в SLC1A5 (с -глутамилтрансферазой, -глутамилтреонином, ИМТ, потреблением алкоголя), cg18181703 в SOCS3 (с сахарным диабетом 2 типа, статусом курения, ИМТ). , растворимый рецептор фактора некроза опухоли 2) и cg24859433 рядом с IER3 (со статусом курения, уровнем образования, 4-винилфенол_сульфатом). На дополнительной рис. 5B показан пример CpG, cg26099045, который коррелировал с рСКФ и фиброзом впочечная тканьв нашем анализе и дополнительно связанные с сексом и курением в предыдущих EWAS. Наконец, cg17944885 в ZNF788 также был связан с рСКФ в выборке пациентов с ДБП22.

Обсуждение

В этом EWASфункция почек, мы идентифицировали и воспроизвели уровни метилирования ДНК крови 69 CpG, связанные с рСКФ. Из них о 60 сайтах ранее не сообщалось, как и обо всех семи CpG, идентифицированных в связи с UACR. Большинство CpG, связанных с рСКФ и UACR, также были в значительной степени связаны с их клиническими исходами, т. е. с ХБП и микроальбуминурией, и, следовательно, могут иметь потенциал для стратификации лиц с риском. Дисперсия рСКФ, связанная с этими 69 CpG, составила 2,4%, что вдвое больше, чем у более раннего EWAS14, и сравнима с дисперсией, объясняемой 29 SNP, обнаруженными GWAS, которые включали в себя в три раза больший размер выборки для обнаружения локуса37,38. Это говорит о том, что дифференциальное метилирование ДНК в отдельных CpG, определенных количественно из крови, объясняет большую дисперсию рСКФ, чем отдельные общие SNP при заданном размере выборки. Для UACR кажется, что требуются большие размеры выборки по сравнению с рСКФ, чтобы выявить аналогичное количество связанных с признаками CpG. Учитывая, что альбумин и креатинин для расчета UACR измеряются в моче, в отличие от количественного определения креатинина из сыворотки для оценки СКФ, эта разница не является неожиданной и согласуется с наблюдениями GWAS за этими признаками10,13. Кроме того, генетическая изменчивость, по-видимому, влияет нафункция почекпризнаки через другие пути, чем изменения в метилировании ДНК. Это подтверждается низким перекрытием между реплицированными сайтами EWAS и GWAS как для eGFR, так и для UACR.

Этот метаанализ EWAS включал образцы различных групп населения и этнических групп. Мы наблюдали высокую корреляцию оценок эффектов, полученных на большой подвыборке лиц EA, с эффектами, оцененными у лиц AA (рис. 2). Несмотря на включение данных от значительного числа лиц не-EA происхождения, общие результаты трансэтнического EWAS могут быть обусловлены данными от лиц EA-происхождения, которые составляют 70 процентов (рСКФ) / 65 процентов (UACR). нашего исследования (дополнительные данные 3 и 4). Чтобы устранить это ограничение, необходимы будущие анализы с увеличенной долей образцов, не относящихся к EA, для надежной и подробной оценки гетерогенности между предками. Потенциал переноса информации из EWAS о количественных признаках в основном в популяционных исследованиях на людей с заболеванием иллюстрируется тем фактом, что оценки эффекта в 65 из 69 связанных с рСКФ CpG наблюдались в том же направлении в когорте из 551 пациента с ХБП. указывая на механизмы, применимые в широком диапазоне уровней рСКФ (рис. 3). Более того,

cg07242931 в MAN1C1 и cg18194850 в SUCLG2 не только ассоциировался с рСКФ, но и предсказывал время допочечная недостаточностьили острыйповреждение почек(Дополнительные данные 8). Дальнейшие доказательства участия SUCLG2, который кодирует -субъединицу сукцинил-КоА-синтетазы, в заболеваниях почек были предложены GWAS на диабетическихБолезнь почеку американских индейцев (SNP=rs4453858, P-значение=2E-6)39. Генетическая изменчивость этого гена также была связана с уровнями сукцинил-карнитина в моче (C4DC, SNP=rs115560420, P-значение=7E-15)40. C4DC является метаболическим продуктом цикла трикарбоновых кислот, который катализируется с участием сукцинил-КоА-синтетазы, а более высокие уровни C4DC в крови связаны с более низкой рСКФ41. Однако поиск результатов GoDMC по локусам количественных признаков метилирования (meQTL) (http://www.godmc.org.uk)42 не выявил значительной связи этих двух SNP с cg18194850, что предполагает отсутствие прямой связи между этими SNP. и сайт CpG.

Поскольку метилирование ДНК является основным регулятором экспрессии генов, мы оценили корреляцию сайтов метилирования ДНК, связанных с признаками, с уровнями мРНК генов в цис-положении. Гены, уровни мРНК которых значимо коррелировали сфункция почексвязанные сайты метилирования ДНК были связаны с путями интерферона (как для рСКФ, так и для UACR). Хотя эти результаты согласуются с результатами обогащения путей для UACR (рис. 5B, дополнительные данные 18), количество значимых корреляций между UACR-ассоциированными CpG и уровнями транскриптов довольно низкое. Это неудивительно, учитывая относительно небольшой размер выборки из 1915 человек, доступных для этого анализа, и ограниченный охват ресурсов транскриптомики. Интересно, что среди значимых результатов для UACR два CpG у члена 5 семейства переносчиков растворенных веществ 1 (SLC1A5) были связаны с дифференциальной экспрессией генов, а также с артериальным давлением. Метилирование ДНК в SLC1A5, который кодирует натрий-зависимый переносчик нейтральных аминокислот, может, таким образом, быть дополнительным элементом, способствующим известной корреляции между UACR и артериальным давлением.

Значительные дифференциально экспрессируемые транскрипты не всегда кодировались ближайшим геном (cg17944885 рядом с ZNF788), или сайт CpG коррелировал с несколькими генами в цис-положении (cg04864179 в IRF5). В частности, примечательна корреляция метилирования ДНК в cg04864179 с уровнями транскриптов IRF5. Учитывая значительный результат MR этой CpG с eGFR, метилирование ДНК в IRF5 может причинно влиять на eGFR, опосредованное экспрессией его гена. Принимая во внимание трансформацию признаков лежащих в основе генетических ассоциаций (см. «Методы»), мы заметили, что увеличение метилирования ДНК на десять стандартных отклонений привело к повышению рСКФ на 3,2 процента. Хотя этот предполагаемый эффект очень мал, причинно-следственное влияние паттернов метилирования в клетках крови на ХБП также было подтверждено сводным MR с другим набором данных meQTL в недавнем исследовании, где причинно-следственный эффект согласовывался с нашими результатами22. Применяя колокализацию по нескольким признакам, они также показали, что генетические эффекты этого локуса на eGFR опосредованы метилированием IRF5 и экспрессией генов в крови. Кроме того, колокализация экспрессии гена IRF5 с eGFR была показана как в канальцевом, так и в клубочковом компартментах.почкаткань43. Однако при интерпретации причинно-следственного эффекта, наблюдаемого в нашем исследовании, следует иметь в виду, что анализ МР для CpG cg04864179 показал значительную неоднородность (p <0,05) среди="" инструментов="" (дополнительные="" данные="" 11="" и="" дополнительная="" рис.="" 7).="">

IRF5 кодирует член семейства регуляторных факторов интерферона (IRF). Группа членов семейства IRF содержит факторы транскрипции с различными ролями, такими как модуляция активности иммунной системы, рост и дифференцировка, а также контроль экспрессии генов интерферонового ответа на вирусные инфекции. IRF5 может влиять на реакцию иммунных клеток. Многочисленные исследования подтверждают, что изменения в метилировании IRF5 могут влиять нафункция почекчерез иммунные пути: SNP в IRF5 связаны с СКВ через изменения экспрессии IRF5 в моноцитах крови44–46. СКВ представляет собой аутоиммунное заболевание, характеризующееся активацией пути IFN, которое может повлиять напочкикак волчаночный нефрит 47. Ингибирование гиперактивации IRF5 в мышиной модели СКВ защищает от возникновения и тяжести волчаночного нефрита и улучшаетфункция почеки патологии48,49. Хотя наш EWAS не был сосредоточен на изучении пациентов с СКВ, небольшое влияние метилирования IRF5 на исходы, связанные с почками, по крайней мере частично опосредованное его экспрессией и последующими путями IFN, может быть обнаружено как влияние на рСКФ в общей популяции.

CISTANCHE УЛУЧШИТ БОЛИ В ПОЧЕКАХ

Несколько связанных с рСКФ CpG, метилирование ДНК которых было количественно определено в клетках крови, также были связаны с рСКФ ипочкафиброз при количественном определении метилирования ДНК изпочкаткани, хотя размер выборки был значительно меньше по сравнению с набором данных EWAS. Это говорит о том, что, по крайней мере, некоторые из результатов, полученных из крови, могут быть переведены на дополнительную специфичную для признака ткань-мишень. Здесь кровь ипочкаявляются двумя основными тканями-мишенями, специфичными для признака, посколькуфункцияпринадлежащийпочкаэто фильтрация крови для удаления отходов. Анализ обогащенияфункция почекассоциированные CpGs указывают на центральную роль в регуляции транскрипции. Мы обнаружили широкое обогащение H3K4me1/3 и H3K36me3. H3K4me1/3 связан с праймированными и активными энхансерами, а также с активными промоторами, а H3K36me3 тесно связан с транскрибируемыми областями генома50. Роль регуляции транскрипции дополнительно подтверждается самым сильным сигналом обогащения фактора транскрипции UACR-ассоциированных CpG, который представляет собой POLR2A, самую большую субъединицу основного фермента, синтезирующего мРНК у эукариот.

Потенциальные ограничения, связанные с анализом MR, заключаются в том, что действительные инструменты не были доступны для всех CpG для прямого MR. Учитывая, что все инструменты CpG были выбраны из цис-областей, т. е. из одного и того же генетического региона, вполне вероятно, что все инструменты CpG либо действительны, либо недействительны, что ограничивает количество различных методов MR, которые можно применять для проверки надежность результатов51. Обратный MR был ограничен по мощности из-за небольшого размера выборки, доступной для оценки ассоциаций метилирования SNP-ДНК. Более крупные исследования meQTL, такие как GoDMC, не могли хранить результаты ассоциации для всех SNP (т. е. выше определенного порога P-значения ассоциации) по техническим причинам, и поэтому их нельзя было использовать для обратного MR с двумя выборками. Таким образом, незначительные результаты следует интерпретировать с осторожностью. Кроме того, интерпретация размера причинного эффекта затруднена, поскольку основные генетические ассоциации рассчитываются по шкале стандартных отклонений уровней метилирования ДНК. Другое потенциальное ограничение исследования заключается в том, что рСКФ, ХБП и UACR являются фенотипами, оцениваемыми по разным основным параметрам и оказывающим многофакторное влияние. Таким образом, мы провели несколько анализов, чтобы гарантировать, что наши результаты EWAS не были обусловлены известными искажающими факторами, включая диабет 2 типа, потенциальный искажающий взаимосвязь между DNAm ифункция почек. Во-первых, ассоциации EWAS в каждой когорте были скорректированы с учетом вмешивающихся факторов, чтобы устранить их влияние в пределах когорты. Во-вторых, EWAS выполняли в каждой когорте отдельно, а затем подвергали метаанализу, который соответствует корректировке, например, для распространенности диабета в когортах. Наконец, мы проверили ассоциации наших реплицированных CpG в опубликованных исследованиях диабета EWAS. Из всех наших воспроизведенных ассоциаций CpG только UACR-ассоциированный CpG cg18181703 в SOCS3 показал связь с диабетом 2 типа. Этот CpG также был связан со статусом курения, ИМТ и уровнями растворимого рецептора фактора некроза опухоли 2 в крови. наименее частично независимы от диабета 2 типа, ИМТ и состояния курения. Хотя мы контролировали некоторые из этих известных факторов, другие факторы, такие как неизмеренные ковариаты, не могли быть явно скорректированы в ходе анализа и могут повлиять на результаты.

Дальнейшие исследования EWAS с увеличенными размерами выборки и количественным определением метилирования ДНК в дополнительных тканях, а также функциональные анализы необходимы для расширения наших знаний о регуляторных механизмахфункция почек, и в конечном итоге улучшить прогнозирование и лечениепочкаболезнь. Это относится именно к UACR, учитывая меньшее количество наблюдаемых значимых ассоциаций CpG. Таким образом, этот крупномасштабный метаанализ EWAS существенно расширил количество CpG, воспроизводимо связанных с рСКФ и ХБП, и выявил семь ассоциаций для UACR и микроальбуминурии. Метилирование ДНК в этих участках объясняло большую часть вариабельности рСКФ, а дифференциальное метилирование четырех CpG свидетельствовало о потенциальной причинно-следственной связи с рСКФ. Всесторонняя характеристика реплицированных CpG у пациентов с ХБП, вткань почки,для дифференциальной экспрессии генов, а также для обогащенных путей и эпигенетических меток дают представление офункция почек-ассоциированная регуляция транскрипции.

Методы

Обзор.Мы организовали совместный метаанализ, основанный на распределенной модели данных и процедурах контроля качества. Для максимальной стандартизации фенотипов в исследованиях были созданы и предоставлены всем участвующим исследованиям план анализа и сценарий командной строки (https://github.com/generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno). преимущественно популяционные исследования; дополнительные данные 1 и 2). Автоматически созданные сводные файлы проверялись централизованно. После утверждения фенотипа исследования запускали свой EWAS и загружали результаты и сводную информацию о метилировании ДНК на центральный сервер. Контроль качества EWAS выполнялся с помощью пользовательских сценариев для оценки инфляции, положительных контролей, распределения зондов CpG и сравнения в исследованиях общего распределения размеров эффекта, стандартных ошибок и P-значений. Все протоколы исследования были одобрены соответствующими локальными комитетами по этике. Все участники всех исследований дали письменное информированное согласие.

CISTANCHE УЛУЧШИТ ПОЧЕЧНЫЙ ДИАЛИЗ

Определение фенотипа.Значения креатинина, полученные с помощью анализа Яффе до 2009, были откалиброваны путем умножения на 0,9552. В исследованиях оценивалась СКФ при хроническомБолезнь почекУравнение сотрудничества по эпидемиологии (CKD-EPI)53. рСКФ была оценена как 15 и 200 мл/мин на 1,73 м2. ХБП определяли как рСКФ ниже 60 мл/мин на 1,73 м2. Значения UACR, измеренные в мг/г, были преобразованы в натуральный логарифм до проведения всех анализов. Микроальбуминурия определялась как 1 при UACR > 30 мг/г и как 0 при значениях UACR < 10="">

Количественная оценка метилирования ДНК и контроль качества.Для количественного определения метилирования ДНК геномную ДНК экстрагировали из периферической крови. Уровни метилирования ДНК количественно определяли с использованием массива BeadChip Infinium MethylationEPIC (EPIC), массива BeadChip Illumina Infinium HumanMethylation450K (HM450K) или массива BeadChip Illumina Infinium HumanMethylation27 (HM27K). Предварительная обработка данных о метилировании ДНК проводилась в соответствии с отдельными протоколами исследования, включая коррекцию фона, квантильную нормализацию, фильтрацию зондов, фильтрацию образцов, сопоставление SNP с местоположениями контрольных зондов SNP, фильтрацию выбросов и коррекцию типа анализа (дополнительные данные 3). Уровень метилирования в каждом сайте был представлен и проанализирован как -значение. Зонды CpG, перекрывающиеся с SNP, были аннотированы. В каждом исследовании вычислялось среднее значение и стандартное отклонение для каждого сайта CpG, и эти сводные статистические данные сравнивались между исследованиями на предмет систематических различий между CpG и отслеживались аналитиками отдельных исследований.

Ковариативная оценка.Метилирование ДНК и ковариаты измеряли в одно и то же посещение/момент времени. Распространенный диабет определялся как уровень глюкозы в плазме натощак выше или равен 126 мг/дл, уровень глюкозы в плазме крови не натощак выше или равен 200 мг/дл, лечение диабета или самоотчет о диагнозе диабета. Распространенная гипертензия определялась как систолическое артериальное давление выше или равное 140 мм рт. ст., диастолическое артериальное давление выше или равное 90 мм рт. ст. или лечение гипертонии. Если измеренное артериальное давление было недоступно, гипертензию определяли по самоотчетам. Текущий статус курения определялся с использованием информации, полученной от самих себя. ИМТ (кг/м2) рассчитывали с использованием измерений веса и роста, которые оценивались в каждом исследовании. Возраст был включен как непрерывная величина в ассоциативные модели. Структура популяции в несемейных исследованиях корректировалась по главным генетическим компонентам (ГК). Пропорции типов лейкоцитов оценивались на основе метилирования ДНК54. Дополнительные технические ковариаты включали контрольный зонд PC55, исследовательский центр, пакет обработки, идентификатор сенсора массива и положение сенсора.

Статистические методы и метаанализ. Чтобы обеспечить сопоставимую мощность среди проанализированных сайтов, в анализы были включены только аутосомные CpG, измеренные как EPIC, так и HM450K. В каждом исследовании проводился линейный регрессионный анализ, разделенный по группам предков. Для оценки надежности результатов EWAS анализ был ограничен исследованиями и подвыборками лиц европейского происхождения. Значения метилирования ДНК были смоделированы как зависимые переменные, при этом признак представлял собой либо непрерывные значения рСКФ или UACR, либо бинарные переменные ХБП или микроальбуминурии: метилирование ДНК ~ признак плюс пол плюс возраст плюс генетические ПК плюс пропорции лейкоцитов плюс технические ковариаты плюс диабет плюс гипертония плюс ИМТ плюс текущее курение Участникам требовалась полная информация по всем переменным и сводная статистика исследования, и они включались только в том случае, если было доступно минимум 50 участников для рСКФ/UACR и 50 случаев/контролей для ХБП/микроальбуминурии, соответственно. Каждый EWAS, специфичный для исследования, был скорректирован с учетом инфляции до метаанализа с помощью подхода BACON, если оценка инфляции была больше или равна единице (дополнительная рис. 8)56. Исследования были разделены на открытие и повторение в хронологическом порядке вклада в метаанализ Консорциума CKDGen (дополнительные данные 1 и 2). Взвешенный метаанализ обратной дисперсии с фиксированным эффектом, реализованный в пакете R «metafor» (версия 2. 1-0), был выполнен для исследований открытия, исследований повторения и для итоговых оценок эффекта открытия и повторения. CpG исключались, если в ходе открытия или репликации было доступно менее половины соответствующего размера выборки или если оценка гетерогенности I2 превышала 95 процентов. Успешная репликация ассоциированного CpG определялась как последовательное направление оценок эффекта между обнаружением (диск neGFR=22, 347, диск nUACR=11, 458) и репликацией (реплик neGFR=11, 258 , nUACR repl=3610) метаанализ, скорректированная Бонферрони значимость открытия P-value (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Анализ экспрессии генов.Последствияфункция почекCpG, ассоциированные с признаками, тестировали на ассоциации с экспрессией генов в крови с использованием двух наборов данных: (1) уровней мРНК моноцитов от 1202 участников исследования MESA и (2) мРНК цельной крови 713 человек из КОРА F4 исследование 57,58. В качестве начального шага был выполнен поиск уровней метилирования CpG с уровнями мРНК, доступными в результатах ассоциации из исследования MESA. Для этого поиска были доступны результаты ассоциации с P-значением < 1e{{10}}.="" анализ="" подробно="" описан="" в="" kennedy="" et="" al.59.="" вкратце,="" экспрессию="" генов="" оценивали="" с="" использованием="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" и="" v4.0="" expression="" beadchips,="" а="" метилирование="" днк="" -="" с="" помощью="" массива="" illumina="" hm450k.="" значения="" экспрессии="" нормализовали="" с="" помощью="" преобразования,="" стабилизирующего="" дисперсию.="" 13="" 933="" транскрипта="" из="" массивов="" v3.0="" и="" v4.0,="" которые="" были="" значительно="" выше="" фоновых="" уровней="" (значение="" p="" обнаружения=""><0,01) по="" крайней="" мере="" у="" 5="" процентов="" субъектов.="" ассоциативный="" анализ="" в="" mesa="" был="" выполнен="" в="" виде="" линейной="" смешанной="" модели="" с="" использованием="" логарифмически="" преобразованных="" значений="" экспрессии="" генов="" в="" качестве="" зависимой="" переменной,="" значений="" бета-метилирования="" днк="" в="" качестве="" независимой="" переменной="" с="" возрастом,="" полом,="" этнической="" принадлежностью="" и="" исследовательским="" центром,="" добавленным="" в="" качестве="" ковариатов="" в="" модель.="" второй="" ассоциативный="" тест="" был="" проведен="" в="" наборе="" данных="" kora="" f4.="" связь="" уровня="" метилирования="" в="" реплицированных="" cpg="" с="" уровнями="" экспрессии="" генов="" в="" пределах="" ±="" 500="" т.п.н.="" была="" рассчитана="" с="" использованием="" логарифмических2-трансформированных="" уровней="" мрнк,="" полученных="" из="" массива="" экспрессии="" генов="" illumina="" human="" ht-12v3.="" значения="" экспрессии="" генов="" регрессировали="" по="" значениям="" бета-метилирования="" днк="" с="" поправкой="" на="" пол="" и="" возраст.="" перед="" анализом="" технические="" факторы,="" а="" также="" пропорции="" типов="" клеток="" крови="" были="" регрессированы="" из="" уровней="" метилирования="" мрнк="" и="" днк,="" а="" их="" остатки="" были="" включены="" в="" окончательную="" модель="" ассоциации.="" аннотации="" и="" проверки="" контроля="" качества="" зондов="" экспрессии="" генов="" основывались="" на="" таблице,="" представленной="" schurmann="" et="" al.60.="" ассоциации="" экспрессии="" cpg-гена="" в="" крови,="" которые="" были="" доступны="" в="" результатах="" mesa="" и="" имели="" p-значение=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

Метилирование ДНК в ткани почек.Анализы с использованием метилирования ДНК впочечная тканьс рСКФ и фиброзом были выполнены с использованием данных 506 микрорассеченныхпочечная тканьобразцы с использованием Illumina EPIC BeadChip. Образцы ткани почек были собраны отдельно и отличаются от образцов крови, которые были проанализированы в мета-анализе EWAS. Эти образцы были собраны из неповрежденных частей нефрэктомии опухоли и подготовлены, как описано ранее 61. Вкратце, программное обеспечение SeSAMe62 использовалось для выполнения предварительной обработки и контроля качества, включая обнаружение на основе низкой интенсивности, коррекцию просачивания при вычитании фона, нелинейную коррекцию смещения красителя, контроль конверсии бисульфита, расчет значений бета и определение фракции лейкоцитов. Бета-значения CpG, связанные с рСКФ и UACR, и клиническая информация были извлечены для анализа ассоциации. Модель регрессии была применена для проверки ассоциаций бета-метилирования ДНК конечных CpG в качестве зависимых переменных с уровнями рСКФ и фиброза, соответственно, в качестве независимых переменных с поправкой на пол, возраст, генетические ПК (1–5), статус диабета, статус гипертонии. , ИМТ, идентификатор массива сентрикса, положение сентрикса, контроль конверсии бисульфита и предполагаемая фракция лейкоцитов.

Целевые исследования зондов рСКФ у пациентов с ХБП. Ассоциация 69 связанных с рСКФ и подтвержденных CpG в общей популяции с рСКФ в German ChronicБолезнь почек (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 мг/г). Последующее наблюдение за пациентами для клинических конечных точек все еще продолжается. Конечные точки исследования постоянно регистрируются стандартизированным образом на основе писем о выписке из больницы и свидетельств о смерти и включают события, связанные с почками, а также смерть. Дизайн исследования и включенная в исследование популяция более подробно описаны в предыдущих публикациях63,64. Исследование GCKD было одобрено локальными комитетами по этике и зарегистрировано в национальном реестре клинических исследований (DRKS 00003971). Подгруппа из 559 пациентов с ХБП, обусловленной системной красной волчанкой, мембранозной нефропатией, фокально-сегментарным гломерулосклерозом или аутосомно-доминантным поликистозом.Болезнь почекбыл выбран для количественной оценки метилирования ДНК и измерен с использованием массива Infinium MethylationEPIC BeadChip (EPIC). Ассоциация с рСКФ оценивалась аналогично основному анализу (см. Статистические методы и метаанализ), за исключением поправки на курение, которая была закодирована как 0/1/2 для никогда не куривших/бывших/в настоящее время курильщиков. Чтобы оценить связь метилирования ДНК со временемпочечная недостаточностьот начала исследования регрессионные модели Кокса были подобраны для каждой CpG и аналогично для комбинированной конечной точкипочечная недостаточностьи острыйпоражение почек.Помимо предиктора метилирования ДНК, модели были скорректированы по возрасту, полу и подтипу ХБП. Регрессионная модель Кокса обеспечивает оценку отношения рисков (HR) для конкретных причин при наличии конкурирующих событий, т. е. любой другой смерти, кроме смерти, связанной с почками. Дополнительно были проведены анализы опасностей подраспределения для оценки потенциальных косвенных эффектов через конкурирующее событие. Допущение о пропорциональных опасностях оценивалось на основе масштабированных невязок Шенфельда. Графическая оценка двух связанных CpG не выявила серьезных нарушений (дополнительная рис. 9).

Сюжеты региональной ассоциации и аннотация. Графики для дополнительного рисунка 5 были созданы с использованием пакетов «Gviz» 65 и «rtracklayer» 66 R. На график было включено не более 40 сайтов в пределах 50 000 п.н. выше или ниже интересующего сайта CpG. Если интервал содержал более 40 сайтов, область графика уменьшалась до расстояния до самого дальнего сайта плюс 10,000 п.н. Раздел RefSeq Genes основан на дорожке UCSC NCBI RefSeq с символами генов из R-пакета org.Hs.eg.db, раздел CpG Islands основан на дорожке UCSC CpG Islands, раздел Roadmap chromHMM основан на В дорожных картах 15- указана модель chromHMM плодапочкаepigenome (ID эпигенома дорожной карты: E086)67, а раздел Common SNPs основан на треке Common SNPs(151) UCSC68. Наконец, график корреляции CpG в нижней части рисунка основан на данных образцов метилирования ДНК исследования KORA F4 с использованием массива BeadChip Illumina HumanMethylation450, при этом отсутствующие участки окрашены в светло-серый цвет.

Дисперсия объясняется метилированием ДНК.Процент фенотипической изменчивости, объясняемый 69 реплицированными CpG, связанными с рСКФ, был оценен с использованием данных 1888 участников исследования KORA FF4, семилетнего наблюдения за исследованием KORA F457,58. KORA FF4 не был частью метаанализа EWAS. Однако 988 человек, включенных в анализ объясненной дисперсии, перекрываются с участниками KORA F4 EWAS. В этом наборе данных дисперсия, объясняемая всеми CpG независимо от ковариат, оценивалась как разница в R2 базовой модели, включающей CpG, и модели без них. Базовая модель была определена какпочкапризнак ~ пол плюс возраст плюс доля лейкоцитов плюс диабет плюс гипертония плюс ИМТ плюс текущее курение спочкапризнак, представляющий eGFR и UACR. Для двух CpG, связанных с eGFR (cg06008406, cg20004659), данные в наборе данных KORA FF4 отсутствовали.

Двунаправленный менделевский рандомизационный анализ.В прямом MR с использованием пакета R «TwoSampleMR»69 мы исследовали потенциальные причинно-следственные эффекты метилирования ДНК в реплицированных CpG на eGFR и UACR. MR использует генетические инструменты, чтобы свести к минимуму систематическую ошибку из-за смешения и обратной причинно-следственной связи70. Генетические инструменты для метилирования ДНК (meQTL) были доступны для 47 и пяти CpG для eGFR и UACR, соответственно, как ранее было идентифицировано GoDMC у 27,75 0 человек42. Сводные данные европейского происхождения GWAS по eGFR10 и UACR13 использовались в качестве соответствующих исходных данных. Фильтры были применены для включения meQTL (pSNP <1e-5 с="" метилированием="" днк="" в="" цис-области="" ±="" 500kb,="" неравновесие="" по="" сцеплению="" r2=""><0,2 в="" области="" 1mb,="" фильтрация="" steiger,="" maf=""> 0,05). Мы выполнили взвешенную МР с обратной дисперсией, а также анализ чувствительности МР (простой режим, взвешенный режим, взвешенная медиана и МР Эггера) или триангуляцию путем оценки отношения Вальда в случае, если был доступен только один инструмент на сайт CpG71–73. Оценки эффекта, полученные на основе MR, зависят от единиц базового набора данных и в данном случае соответствуют изменению на единицу одного стандартного отклонения уровней метилирования в естественной логарифмически преобразованной рСКФ и стандартному отклонению естественного логарифмического преобразования UACR, соответственно. В обратном МР мы изучили потенциальные причинно-следственные эффектыфункция почекпризнаков метилирования ДНК с использованием значимых для всего генома SNP из трансэтнических GWAS на eGFR10 и UACR13 в качестве генетических инструментов для eGFR и UACR соответственно. Чтобы максимизировать мощность данных о результатах, мы провели метаанализ z-показателей ассоциаций SNP-CpG из исследований KORA F4 (n=1662) ​​и FHS (n=3868). Оценки комбинированного эффекта и их стандартные ошибки meQTL, включенного в MR, были оценены на основе размера выборки, частоты аллелей и z-показателя74. Фильтры были применены для включения SNP (P-значение < 5e-8="">почкапризнак, одностороннее значение P < 0.05="" с="" азотом="" мочевины="" крови="" для="" инструментов="" рскф,="" неоднородность="" предков="" p-значение="" больше="" или="" равно="" 0.0="" 1,="" фильтрация="" штейгера,="" maf=""> 0.05). Мы выполнили взвешенный MR с обратной дисперсией с мультипликативными случайными эффектами (поскольку для каждого признака было доступно достаточно большое количество инструментов из разных локусов)51 и анализ чувствительности MR (простой режим, взвешенный режим, взвешенная медиана и MR Egger)71–73. В качестве дополнительного анализа чувствительности, касающегося плейотропных вариантов, мы исключили в общей сложности 35 инструментов, которые были связаны с сахарным диабетом 2 типа в недавнем GWAS75, включая 898 130 человек: одиннадцать SNP, которые имели ассоциацию P-значение < 5e-8="" с="" диабетом,="" и="" 24="" дополнительных="" инструменты,="" которые="" находились="" в="" неравновесном="" сцеплении="" (r2=""> 0,2 в пределах 1 Мб, эталонная панель 1000 G EUR) с таким SNP, связанным с диабетом. Неравновесие по сцеплению оценивали с помощью LDlink76. Для обратного MR оценки эффекта обеспечивают изменение естественной логарифмической СКФ на единицу и стандартное отклонение естественной логарифмической трансформации UACR, соответственно, при стандартном отклонении уровней метилирования ДНК. Корректировка множественного тестирования P-значения в соответствии с FDR Бенджамини-Хохберга <0,05 применялась="" для="" каждого="" признака="" почки,="" а="" также="" для="" прямого="" и="" обратного="" mr="" отдельно77.="" p-значения="" неоднородности="" были="" получены="" из="">

Анализ обогащения.Чтобы сообщить о потенциальных функциональных эффектах ассоциированных CpG, мы оценили обогащение этих CpG сайтами модификации ДНКазы I или гистонов (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), наборами генов на основе терминов и путей GO в базах данных KEGG и Reactome32. –35. Анализ обогащения TFBS проводили, как подробно описано ранее14. Вкратце, тестирование обогащения оценивали с использованием eForge78 с использованием перестановки с сопоставлением локализации области гена и островка CpG при отборе проб. Данные были получены из проектов ENCODE (125 образцов) или Roadmap Epigenomics (299 образцов), созданных с помощью метода Hotspot67,79,80. CpG, которые были связаны с рСКФ и UACR, соответственно, при значении P < 1e-05="" в="" метаанализе,="" использовались="" в="" качестве="" входных="" данных="" (дополнительные="" данные="" 6="" и="" 7),="" а="" 10,000="" прогоны="" повторной="" выборки,="" активный="" фильтр="" приближения="" и="" значение="" fdr=""><0,05 считается="" значимым="" (дополнительные="" данные="" 13="" и="" 14).="" анализы="" обогащения="" гистоновых="" меток="" проводились="" аналогично="" (дополнительные="" данные="" 15="" и="" 16).="" обогащение="" наборов="" генов="" или="" путей="" оценивали="" с="" использованием="" пакета="" methylgsa="" и="" версии="" r="" 3.6.181.="" методом="" тестирования="" обогащения="" был="" метилглм,="" реализующий="" логистическую="" регрессию="" с="" поправкой="" на="" количество="" зондов="" на="" ген="" и="" аутосомный="" фон,="" который="" перекрывает="" массивы="" 450k="" и="" epic.="" были="" протестированы="" наборы="" генов="" или="" пути="" с="" 100–500="" генами="" (настройка="" по="" умолчанию).="" мы="" считали,="" что="" набор="" генов="" или="" путь="" значительно="" обогащен="" при="" fdr=""><0,05 с="" поправкой="" на="" множественное="" тестирование="" в="" каждой="" базе="" данных="" с="" использованием="" метода="" бенджамини="" и="" хохберга="" (дополнительные="" данные="" 17="" и="">