МикроРНК в развитии и заболеваниях почек Ⅱ

Развитие почек

почка млекопитающего(или метанефрос) — жизненно важный орган, играющий решающую роль ввыведение метаболических отходов,регуляция объема внеклеточной жидкости, иподдержание электролитаикислотно-щелочной гомеостаз. Кроме того, почки вырабатывают важные гормоны, такие какэритропоэтин, кальцитриол,ренин, ипростагландины(48). Функциональная способность почек коррелирует с количеством функционирующих нефронов, которые формируются в процессе развития почек до рождения, что также называется запасом нефронов. Каждая почка человека содержит в среднем 1,000,000 нефронов, хотя это число значительно варьируется: от 200,000 до 2,000,{{8 }} нефроны (49, 50). Сстарение,потеря функционального резерва нефроновпроисходит с течением времени (51, 52); следовательно, низкий уровень нефронов при рождении связан с повышенным риском развития гипертонии и хронической болезни почек (ХБП) в более позднем возрасте (53–55). Более того, CAKUT, который приводит к снижению запасов нефронов и функции нефронов, является основной причиной почечной недостаточности у детей, что приводит к значительной заболеваемости и смертности, связанным с трансплантацией и диализом (56, 57). Таким образом, лучшее понимание клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе установления количества нефронов и нормального образования нефронов, дает представление о новых способах прогнозирования, предотвращения и лечения заболеваний почек у детей.

КАК ВРЕМЯ ДЕЙСТВУЕТ ЦИСТАНШЕ НА ПАЦИЕНТОВ С ЗАБОЛЕВАНИЕМ ПОЧЕК?

Развитие метанефрической почкиначинается примерно на 10,5-й день эмбрионального развития (E10.5) у мышей и примерно на пятой неделе беременности у человека (58). В ответ на индуктивные сигналы метанефрической мезенхимы зачаток мочеточника выходит из каудального конца вольфова протока и инвазируется в соседнюю мезенхиму (рис. 2). Одновременно морфогены, исходящие из зачатка мочеточника, вызывают конденсацию метанефрической мезенхимы с образованием колпачковой мезенхимы (также называемой предшественниками нефрона) вокруг кончиков зачатка мочеточника. По мере прогрессирования нефрогенеза зачаток мочеточника претерпевает последовательные циклы ветвления, удлинения и дифференцировки, образуя собирательные трубочки почки. Субпопуляция предшественников нефронов подвергается мезенхимально-эпителиальному переходу с образованием почечных пузырьков, которые после поляризации и удлинения становятся запятыми и S-образными структурами тела. Наконец, дистальная часть S-образного тела сливается с собирательной трубочкой, образуя функциональный нефрон (59–61). S-образное тело подвергается дальнейшей дифференцировке с образованием зрелых типов клеток нефрона, за исключением собирательных трубочек. Стромальные клетки-предшественники Foxd1+ примыкают к предшественникам нефронов во внешней кортикальной или нефрогенной зоне развивающейся почки (Figure 2) (62). Считается, что сигналы от кортикальной стромы ингибируют расширение клеток-предшественников нефронов и стимулируют их дифференцировку, поскольку абляция почечной стромы приводит к нарушению дифференцировки предшественников нефронов (63). Клетки-предшественники Foxd1+ дают начало всем стромальным клеткам метанефрической почки, включая почечные кортикальные и медуллярные интерстициальные клетки, перициты, периваскулярные фибробласты, мезангиальные клетки и гладкомышечные клетки сосудов (64, 65). Нарушения на любом этапе этого процесса могут привести к CAKUT, основной причине ХБП у детей (66, 67).

Зрелый нефрон состоит из клубочка, который действует как фильтрационная единица, и трубчатого заднего сорбционного отсека, который подразделяется на проксимальный извитой канальец, петлю Генле, дистальный извитой канальец и собирательную трубочку (рис. 2). Фильтрационный барьер клубочка (который состоит из фенестрированного эндотелия, базальной мембраны клубочка, ножных отростков и щелевых диафрагм подоцитов) позволяет фильтровать плазму и небольшие растворенные вещества, избирательно удерживая в крови такие белки, как альбумин и иммуноглобулины (68, 69). Между тем, отдел канальцевой реабсорбции отвечает за поддержание водного гомеостаза, реабсорбцию растворенных веществ (включая натрий, калий, кальций, фосфор, магний, глюкозу и многие другие), а также выведение кислоты и других отходов.

МикроРНК в развивающейся почке

В исследованиях на условно трансгенных мышах miRNAs оказались критическими регуляторами морфогенеза почек во многих клеточных линиях. Первоначальные исследования, оценивающие функциональную роль miRNAs в развитии почек, использовали условную делецию Dicer (70) в различных почечных клонах. Однако известно, что Dicer также играет независимую от miRNA роль (71), что усложняет интерпретацию этих моделей. Условная делеция Dicer в ранней метанефрической мезенхиме или предшественниках нефронов приводит к усилению апоптоза предшественников нефронов, повышенным уровням проапоптотического белка Bim и преждевременному прекращению нефрогенеза (72–75) (Table 1). Интересно, что потеря экспрессии Bim в Dicer-дефицитных предшественниках нефронов снижает апоптоз и частично восстанавливает образование нефронов. Две микроРНК, экспрессируемые в предшественниках нефронов, miR-17 и miR-106, были идентифицированы как супрессоры экспрессии BIM (76). В совокупности эти находки указывают на то, что miRNAs контролируют баланс между выживанием и апоптозом в предшественниках нефронов, обеспечивая образование правильного количества нефронов на протяжении нефрогенеза.

Рисунок 2. Схематическая иллюстрация стадий развития метанефрической почки. Сигналы от зачатка мочеточника запускают конденсацию метанефрической мезенхимы с образованием колпачка предшественников нефрона (мезенхимы колпачка) вокруг кончиков зачатка мочеточника. Мезенхима колпачка претерпевает мезенхимально-эпителиальный переход с образованием почечных пузырьков, которые последовательно развиваются в запятые и S-образные тельца. Эти структуры соединяются со ножкой зачатка мочеточника, от которой начинается собирательная трубочка. Клетки проксимального домена S-образного тела дифференцируются в специализированные эпителиальные клетки зрелых почечных телец (т. е. подоциты и клетки капсулы Боумена), тогда как клетки средней и дистальной частей дифференцируются в канальцевые сегменты нефрона (проксимальные канальцы). петля Генле и дистальные канальцы). Создано с помощью BioRender.com.

Условная делеция Dicer в линии зачатков мочеточника приводит к спектру аномалий, которые сильно напоминают CAKUT, включая почечную дисплазию и развитие кист собирательных трубочек (73, 77, 78). Преждевременное прекращение морфогенеза ветвления (в ответ на снижение экспрессии Wnt11 и c-Ret из зачатка мочеточника), вероятно, является основным фактором, способствующим дисплазии почек (73). Начало образования кист происходит примерно на ст. E15.5 и связано с дефектами длины первичных ресничек, повышенной апоптотической гибелью клеток и чрезмерной пролиферацией клеток (73). Поскольку Dicer играет важную независимую от miRNA роль в клетке, условная делеция Dgcr8 была использована для подтверждения того, что фенотипы, наблюдаемые в условных моделях с нокаутом Dicer, действительно являются результатом потери miRNAs. У животных с делецией Dgcr8 в дистальном отделе нефрона и производных собирательных трубочек развивается гидронефроз и кисты собирательных трубочек (79), CAKUT-подобный фенотип, который напоминает потерю активности Dicer в линии зачатков мочеточников.

Исследования двух независимых групп показали, что абляция Dicer из линии почечной стромы Foxd1+ и ее производных приводит к целому ряду почечных аномалий, с последовательными результатами в отношении гипоплазии почек, уменьшения числа клубочков, аномального созревания клубочков и дефектов сосудов. узор (80, 81). Хотя обе группы описали в значительной степени согласованные фенотипы, используя схожие мышиные модели, были отмечены два явных различия. Накагава и др. наблюдали отсутствие внутреннего мозгового слоя и сосочка, а также уменьшение нефрогенной зоны (80). Напротив, Фуа и др. показали увеличение популяции предшественников нефронов и сохранение почечного сосочка (81). Накагава и др. предположили, что эти дефекты связаны с нарушением передачи сигналов пути Wnt, что приводит к изменениям в миграции и пролиферации стромальных клеток из-за подавления микроРНК стромальных клеток, miR-214, miR-199a{{7 }}p и miR-199a-3p (80). Исследование Phua et al. предположили, что изменения в программах апоптоза (включая повышенную экспрессию эффекторных генов Bim и p53) способствуют фенотипическим дефектам (81). Вполне возможно, что различия в генетическом фоне и/или эффективность Cre-опосредованной рекомбинации могут быть ответственны за различия, которые описывают эти исследования. Тем не менее, описанные фенотипы согласуются с известной многогранной ролью почечной стромы в развитии почек, а механизмы, лежащие в основе этих фенотипов, вероятно, сложны, учитывая природу делеции Dicer. Необходимы дальнейшие исследования, изучающие специфические микроРНК в различных субпопуляциях стромы, чтобы лучше определить действующие регуляторные механизмы.

Более поздние работы обратились к вопросу о функции специфических miRNAs как в развивающихся почках, так и в предшественниках нефронов. Используя модель эмбриональных стволовых клеток человека, Bantounas et al. показали, что ингибирование кластера miR-199a~214 приводит к дисморфии клубочков, аберрантным проксимальным канальцам, снижению экспрессии WT1 и увеличению интерстициальных капилляров в почечноподобных органоидах (82). Интересно, что глобальное удаление реагирующей на гипоксию миР-210 приводит к мужскому специфическому дефициту нефронов (83). Например, условная делеция кластера miR-17~92 в предшественниках нефронов и их производных у мышей нарушает пролиферацию клеток-предшественников и уменьшает количество развивающихся нефронов. В результате у мутантных мышей развивается протеинурия, фиброз почек и нарушение функции почек (84). Нарушенные уровни гена-мишени miR-17~92, CFTR, вовлечены в дефектную пролиферацию клеток-предшественников и снижение обеспеченности нефронов в этой мышиной модели (85).

Секвенирование малых РНК (smRNA-Seq) все чаще используется для определения паттернов экспрессии микроРНК и для открытия новых видов микроРНК. С помощью smRNA-Seq нефрогенных мезенхимальных клеток E15.5 идентифицировано 162 аннотированных микроРНК, которые дифференциально экспрессируются в этой популяции клеток по сравнению с целыми почками, и 49 новых видов микроРНК (86). Интересно, что уровни микроРНК семейства miR-200 были значительно снижены в предшественниках нефронов. Учитывая, что члены семейства miR-200 являются ключевыми регуляторами мезенхимально-эпителиального перехода в собирательных трубочках (87), мы предполагаем, что их экспрессия может жестко регулироваться, чтобы гарантировать нормальную эпителиальную дифференцировку предшественников нефронов во время развития почек.

Функция микроРНК в зрелом нефроне

В дополнение к их потребности во время развития почек, miRNAs регулируют многочисленные биологические процессы в основных клеточных линиях, которые формируют зрелый нефрон (69, 88-91). В соответствии с этим была описана сегмент-специфичная экспрессия микроРНК вдоль нефрона, в том числе миР-143 и миР-195а в клубочках, миР-107 и миР{{7} }a в проксимальном канальце, miR-193 и miR-378a в толстом восходящем колене, miR-874 и miR-155 в дистальном извитом канальце и miR{{ 12}}c в собирательной трубочке (87). Более того, функциональные исследования в компартментах зрелого нефрона подтверждают различную роль miRNAs.

У мышей, лишенных Dicer или Drosha в подоцитах, наблюдается выраженная протеинурия, гломерулосклероз и быстрое прогрессирование почечной недостаточности, вторичное по отношению к нарушению барьера клубочковой фильтрации (90–93). Анализы in silico показали, что различные транскрипты с повышенным уровнем экспрессии в мутантных клубочках содержат целевые последовательности для членов семейства miR-30. Как и все четыре члена семейства miR-30 (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d и miR-30c{ {9}}) обычно высоко экспрессируются в подоцитах, эти микроРНК могут быть ответственны за аномалии подоцитов и нарушение барьера клубочковой фильтрации у мутантных мышей (91).

Несколько удивительно, что делеция Dicer из проксимальных канальцев постнатальных млекопитающих не влияет на развитие почек, гистологию или функцию, но защищает от почечной ишемии/реперфузионного повреждения. Мутантные мыши демонстрируют лучшую функцию почек, меньшее повреждение почек, меньший тубулярный апоптоз и лучшую выживаемость по сравнению с их однопометниками дикого типа (94). Это, вероятно, отражает «сумму» эффекта делеции нескольких микроРНК в проксимальных канальцах, поскольку с тех пор другие работы показали, что экспрессия специфических микроРНК является защитной при почечной ишемии/реперфузионном повреждении (например, miR-16 и миР-21, ссылки 95, 96); тогда как другие вредны (например, miR-182; ссылка 97).

Хотя miRNAs, по-видимому, необязательны для функционирования проксимальных канальцев, они необходимы для гомеостаза дистальных нефронов и собирательных трубочек (79, 88, 98). Коллективная инактивация Dicer и других важных генов, связанных с биогенезом микроРНК (включая Dgcr8, Ago1, 2, 3 и 4), вызывает почечную недостаточность у взрослых мышей из-за прогрессирующего тубулоинтерстициального фиброза и интерстициального воспаления (88). Этому предшествует частичный эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ) клеток собирательных трубочек и подавление членов семейства miR-200, которые ингибируют ЕМТ (88). Сходным образом, абляция Dicer или Dgcr8 из дистальных производных нефрона и зачатка мочеточника, соответственно, приводит к почечным аномалиям и почечной недостаточности (78, 98), которые в конечном итоге связаны с подавлением активности членов семейства miR-200 (98). Повышенная экспрессия гена-мишени miR-200 Pkd1 у этих мутантных мышей нарушает тубулогенез и образует кистоподобные структуры (98). Эти различия в потребности в функциональных miRNAs в проксимальных канальцах и дистальных отделах нефрона/собирательных трубочках могут быть объяснены сегментарным распределением miRNAs по длине нефрона и собирательных трубочек в почках дикого типа (88).

Удаление Dicer в ренин-секретирующих клетках юкстагломерулярного аппарата приводит к дефициту юкстагломерулярных клеток, снижению уровня циркулирующего ренина с последующим снижением артериального давления, снижению функции почек, полосатому типу интерстициального фиброза и сосудистым аномалиям (89). Уменьшение количества юкстагломерулярных клеток предполагает потребность в зрелых микроРНК для поддержания их фенотипа. Позже miR-330 и miR-125b-5p были идентифицированы как потенциальные кандидаты, которые либо ингибируют, либо стимулируют, соответственно, гладкомышечный фенотип юкстагломерулярных клеток (99).

Другие активные области исследований микроРНК при остром повреждении почек (8–10), поликистозе почек (11) и трансплантации почек (10) были всесторонне рассмотрены в других недавних обзорах.

МикроРНК при заболеваниях почек у детей. В этом разделе мы даем обзор роли микроРНК в развитии заболеваний почек, включая опухоли CAKUT и опухоли Вильмса. CAKUT являются одной из наиболее частых форм пороков развития при рождении, поражая примерно 3–7 из 1000 живорождений (100). Нарушение развития почек и нижних мочевыводящих путей приводит к широкому спектру клинических проявлений, наблюдаемых при CAKUT, включая аномалии почек (т. е. агенезию почек, почечную гипоплазию и дисплазию, мультикистозную дисплазию почек), лоханочно-мочеточниковые аномалии (т. е. обструкцию лоханочно-мочеточникового соединения), дуплексная собирательная система и аномалии мочевого пузыря и уретры (101–103). Эта фенотипическая гетерогенность, вероятно, обусловлена ​​сложным взаимодействием между генетическими, эпигенетическими и/или пренатальными факторами окружающей среды, которые влияют на развитие почек и нижних мочевыводящих путей, что приводит к CAKUT (101). Большая часть наших текущих знаний о патогенезе CAKUT возникла на мышиных моделях и синдромальных формах CAKUT. Эти исследования привели к идентификации нескольких генов CAKUT, многие из которых участвуют в раннем развитии почек, включая PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 и другие (101, 104, 105). Однако единичные мутации или варианты числа копий в генах, кодирующих белок, не объясняют большинство случаев CAKUT (~80%) (101, 106).

Как упоминалось выше, истощение зрелых микроРНК из разных клеточных линий развивающейся почки на моделях мышей приводит к почечным аномалиям, которые имитируют CAKUT человека (73, 74, 78, 79). Кроме того, делеции зародышевой линии MIR17HG, который кодирует кластер miR-17~92, вызывают синдром Фейнгольда 2 типа у людей (107). Хотя почечный фенотип у пациентов с синдромом Фейнгольда 2 типа и мутациями MIR17HG остается неопределенным, в 18% случаев CAKUT зарегистрировано в случаях синдрома Фейнгольда, связанного с мутациями MYCN (108, 109). В совокупности эти наблюдения позволяют предположить, что мутации в микроРНК, экспрессируемые во время развития почек, могут вызывать CAKUT у людей, особенно потому, что многие микроРНК высококонсервативны у мышей и людей.

Чтобы проверить эту гипотезу, в одном исследовании исследовали 1248 пациентов с несиндромальной CAKUT из 980 семей и искали мутации в 96 участках «стебель-петля» 73 генов микроРНК развития почек (106). В этой когорте был идентифицирован 31 человек с 17 различными однонуклеотидными вариантами, влияющими на 16 различных генов микроРНК. Среди них было обнаружено, что два новых варианта микроРНК потенциально патогенны. MIR19B1 (член кластера miR-17~92) был связан с наличием агенезии правой почки, а MIR99A был связан с тяжелым пузырно-мочеточниковым рефлюксом и птозом почки. Такое удивительно низкое количество патогенных вариантов-кандидатов отчасти связано с ограничениями этого исследования, поскольку анализ учитывал только мутации в генах микроРНК, которые были включены в подход к генам-кандидатам, и не выявил вариаций числа копий и крупных перестроек ДНК (106). .

В альтернативном подходе сегменты мочеточника пациентов с различными CAKUT были проанализированы на предмет дифференциальной экспрессии транскриптов с помощью микроматрицы, на наличие биоинформатически предсказанных мишеней миРНК и зрелых миРНК с помощью кПЦР (110). Используя этот многоаспектный подход, были идентифицированы семь микроРНК с потенциальной ролью в CAKUT, и среди них количество has-miR-144 было значительно увеличено у пациентов с CAKUT. Анализ онтологии генов показал, что предсказанные гены-мишени has-miR-144 способствуют биологическим процессам, участвующим в развитии CAKUT, включая развитие трубок (22 гена-мишени), развитие мочеполовой системы (18 генов-мишеней), развитие почек (14 генов-мишеней). и развитие эмбриональных органов (18 генов-мишеней) (110).

Необходимы дальнейшие исследования для определения молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенной роли miRNAs в CAKUT. Результаты таких исследований будут иметь решающее значение для улучшения ухода за пациентами с CAKUT и предотвращения их прогрессирования до ХБП, обеспечения надлежащего генетического консультирования пациентов и их семей и разработки новых терапевтических стратегий.