Митохондриальные белки раскрывают механизм, с помощью которого физические упражнения улучшают память, обучение и двигательную активность при гипоксически-ишемической энцефалопатии. Модель крысы. Часть 3.
Apr 07, 2024
4. Материалы и методы.
4.1. Животные и экспериментальные группы
Для этого исследования использовали тридцать шесть крыс Sprague-Dawley. Животных содержали при температуре 22 ± 1°C с 12-часовым циклом света/темноты и имели свободный доступ к пище и воде. Экспериментальные процедуры проводились с одобрения Этического институционального комитета по уходу за животными и исследованиям Университета Чжэнчжоу.
Темный цикл относится к периоду, когда люди спят по ночам, и он тесно связан с памятью. Для большинства людей хороший ночной сон улучшает физическое здоровье и работу мозга. В то же время сон также связан с процессом памяти мозга.
Когда мы спим, наш организм переходит в разные стадии сна, включая сон с быстрым движением глаз (REM) и сон с медленным движением глаз (NREM). Эти этапы играют важную роль в регулировании интеграции информации в мозге и консолидации памяти.
Большинство людей испытывают положительное влияние сна на концентрацию и память. Исследования показывают, что сон может помочь нам консолидировать и укрепить наши воспоминания и даже улучшить нашу способность к обучению. Во время сна мозг объединяет новую информацию с существующими знаниями, тем самым улучшая способность хранить и использовать память.
И наоборот, недостаток достаточного сна может привести к потере памяти и трудностям в обучении. Длительная бессонница может вызвать различные проблемы в теле и мозге, влияющие на повседневную жизнь и работоспособность. Поэтому правильная стратегия сна и разумный образ жизни имеют решающее значение для сохранения хорошей памяти.
В целом существует связь между темными циклами и памятью. Достаточный сон может способствовать интеграции информации в мозге и консолидации памяти, в то время как долговременные нарушения сна могут повлиять на функцию мозга и память. Поэтому мы должны уделять внимание качеству сна в нашей повседневной жизни и вести здоровый образ жизни, чтобы эффективно поддерживать и улучшать нашу память и способности к обучению. Видно, что нам необходимо улучшить память, а Cistanche Deserticola может значительно улучшить память, поскольку Cistanche Deserticola также может регулировать баланс нейротрансмиттеров, например, повышая уровень ацетилхолина и факторов роста. Эти вещества очень важны для памяти и обучения. Кроме того, Cistanche Deserticola также может улучшить кровоток и способствовать доставке кислорода, что может гарантировать, что мозг получает достаточное количество питательных веществ и энергии, тем самым повышая жизнеспособность и выносливость мозга.
Нажмите «Узнай 10 способов улучшить память»
Было приложено все усилия, чтобы уменьшить количество животных и свести к минимуму страдания животных во время экспериментов. Животные были случайным образом разделены на четыре группы (рис. 8). (1) HIE, NT (группа гипоксически-ишемической энцефалопатии без тренировок) состояла из животных, у которых моделировали гипоксически-ишемическую энцефалопатию на 7-й день постнатального периода путем анестезии детенышей изофлюраном (индукция 5%, поддержание 1,5%).
Затем левую общую сонную артерию перевязывали навсегда, и детенышей помещали на теплую кушетку на 30 минут, а затем переводили в гипоксическую камеру с непрерывным потоком гипоксической газовой смеси 92% N2 и 8% O2 на 90 минут, а затем возвращались в клетки до 10-й недели, не подвергая их упражнениям по плаванию. (2) HIE, T (группа гипоксически-ишемической энцефалопатии с физическими упражнениями) состояла из животных, у которых была смоделирована гипоксически-ишемическая энцефалопатия, как в (1), и которые были возвращены в клетки до 6-й недели жизни, а затем подвергнуты 90-минутному воздействию упражнения по плаванию ежедневно в течение пяти дней с 2 днями отдыха в неделю в течение 4 недель, (3) SHAM, NT (контрольная группа) включала животных, которые не подвергались никакому лечению, но жили нормальной жизнью в клетках с 1-го дня постнатального периода до 10-й недели без тренировка физических упражнений и (4) Имитация, Т состояла из животных, не подвергавшихся никакому лечению, но живших нормальной жизнью в клетках с 1-го дня после рождения до 6 недель, после чего их подвергали упражнениям по плаванию в течение 4 недель.
Затем мозг животных из разных групп собирали и готовили к вестерн-блоттингу (гиппокамп и кора головного мозга) и иммунофлуоресценции (моторная кора).
4.2. Парадигма упражнений
Животных содержали в свободном доступе с пищей и водой и поддерживали 12-цикл света/темноты. Их разделили на две группы: малоподвижные животные (HIE, NT и SHAM, NT) и тренирующиеся животные (HIE, T и SHAM, T). Тренируемых животных подвергали тренировкам по плаванию после 6-й недели постнатального периода в течение 4 недель; они занимались плаванием 5 дней в неделю с 2 днями отдыха. Каждое занятие плаванием длилось 90 минут. Бассейн заполняли на глубину 50 см, чтобы животные не касались дна резервуара.
Животным позволяли свободно плавать, без какой-либо дополнительной нагрузки, во время плавания их осторожно стимулировали. После тренировки крыс тщательно высушивали и возвращали в клетки.
4.3. Вертика! Тест полюсного двигателя
Животных в каждой группе по одному помещали лицом вверх на обтянутый тканевой лентой шест (диаметром 3,0 см и длиной 150 см), который удерживали в горизонтальном положении, а затем постепенно поднимали в горизонтальное положение. вертикальном положении, а время пребывания крысы на шесте регистрировали максимум 2 мин (120 с). В этом тесте животное с нарушением координации движений и равновесия падает с шеста.
4.4. Испытание в водном лабиринте Морриса (MWM)
Крыс (10-недельного возраста) подвергали MWM после прохождения 4-недельного протокола тренировок с физическими упражнениями (SHAM, 'T и HlE, T). Все данные водного лабиринта записывались с использованием системы видеослежения Panjab SMART (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Шанхай, Китай). MWM использовали, как описано в 132]. Вкратце, крысы использовали визуальные сигналы, расположенные на краях бассейна, чтобы добраться до скрытой платформы и выбраться из воды. Обучение оценивалось в течение 7 дней. Перед оценкой обучения крыс помещали в бассейн с чистой водой и видимой платформой. Во время обучения крысам давали пробные упражнения по плаванию, чтобы освоить задачу.
На этапе обучения крыс смазывали черным красителем для облегчения видеосъемки, а платформу погружали в воду. Каждую крысу подвергали четырем испытаниям с разных начальных точек (квадрантов). Задержка или время, необходимое для достижения платформы, ежедневно регистрировалось системой видеонаблюдения Panlab SMART. В последний день эксперимента платформу убирали и каждую крысу повторно вводили в воду. Регистрировали количество раз, когда животные пересекали место скрытой платформы в квадранте, ранее содержащем платформу (целевой квадрант).
4.5. Вестерн-блоттинг
Для эксперимента по определению уровня белка из каждой группы случайным образом были выбраны шесть крыс. Белки экстрагировали из гиппокампа и коры головного мозга, гомогенизировали в реагенте RIPA (CW2333S, CoWin Biosciences, Кембридж, Массачусетс, США) и разделяли на цитоплазматические и ядерные белки. Концентрации белка определяли с использованием анализа бицинхониновой кислоты (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Кембридж, Массачусетс, США), и всего 20 г белка разделяли электрофорезом на универсальных гелях SDS-PAGE (CFAS AnyKD PAGE) # PE008, Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Шэньси, Китай.
Затем белки переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Берлингтон, Массачусетс, США). Мембраны блокировали на 2 часа 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences). , Пекин, Китай) при комнатной температуре и инкубировали со следующими первичными антителами от Cell Signaling Technology (Данверс, Массачусетс, США): AIF (D39D2, 1:1000), цитохром C (136F3, 1:1000), расщепленная каспаза{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) и OPA1 (D7C1A, 1:1000).
GAPDH от Servicebio, Ухань, Китай (GB11002, 1:2000) и H3 от Proteintech (17168-1-AP, 1:1000) при 4 ◦C в течение ночи с последующим введением HRP-конъюгированных вторичных антител SA00001-2 от Proteintect (1:5000) инкубация в течение 2 ч при комнатной температуре. Белковые полосы визуализировали с помощью набора усиленной хемилюминесценции #KF005 от Affinity Biosciences и визуализировали с помощью системы анализа Bio-Image (Университет Чжэнчжоу, Чжэнчжоу, Китай). Отношения интенсивностей белковых полос к GAPDH (цитоплазматическим белкам) и H3 (ядерным белкам) в качестве внутренних эталонов определяли с использованием ImageJ.
4.6. Иммунофлуоресценция
Корональные срезы ткани головного мозга размером {{0}} мкм получали с использованием замораживающего микротома (Leica, Германия) для иммунофлуоресценции. Слайды блокировали на 2 часа PBS с 10% фетальной бычьей сывороткой (#A8020, Solarbio Life Sciences, Пекин, Китай) и 0,3% Triton ×-100, Amresco 0694, Biosharp, Эстония, при комнатной температуре, а затем инкубированные с первичными антителами компании Cell Signaling Technology (Данверс, Массачусетс, США): анти-AIF, D39D2 (разведение 1:400), анти-цитохром C, 136F3 (разведение 1:200), анти-расщепляемая каспаза-3 , Asp175 (разведение 1:400), анти-Smac/Diablo, D553R (разведение 1:200) и анти-OPA1, D7C1A (разведение 1:400) в течение ночи при 4 ◦C.
Затем предметные стекла промывали 3 раза по 10 минут в PBS, а затем инкубировали со вторичными антителами (ab150077 от Abcam, Кембриджский биомедицинский кампус, Кембридж, Великобритания) в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. DAPI,#C0065 от Solarbio Life. Sciences, Пекин, Китай (1:100PBS) добавляли на 5 минут и сливали, промывали в PBS 3 раза по 5 минут каждый, сушили, добавляли антигашающий агент (#P0126, Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай), стекло на предметных стеклах фиксировали образцы, а образцы хранили при -20 ◦C в течение 2 часов и брали для микроскопической визуализации. Изображения тканей получали с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа (Ni-U942877, Nikon, Токио, Япония), а изображения, представляющие затем количественно определяли белки в моторной коре с помощью FIJI-ImageJ, как описано в [33].
4.7. Статистический анализ
Для всех анализов использовалась GraphPad Prism версии 8.0.0 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Для измерения статистической значимости использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующими апостериорными тестами Даннетта соответственно. Результаты представлены как среднее ± SEM, и p < 0,05 считалось статистически значимым.
5. Выводы
Это исследование показывает, что занятия плаванием улучшают двигательную активность, память и обучаемость, связанные с HIE, путем подавления митохондриального апоптоза посредством сигнальных путей Cyto.C/расщепляемой каспазы-3 и AIF. Кроме того, было показано, что вмешательство в упражнения по плаванию стабилизирует митохондриальные кристы и мембранный потенциал, о чем свидетельствует реверсирование Smac/Diablo и OPA1 у крыс с HIE. В результате это является привлекательной и жизнеспособной основой для дополнительных исследований по расшифровке большего количества молекулярных путей, которыми можно было бы манипулировать для эффективного управления ГИЭ и возникающим в результате дефицитом. Хотя это исследование успешно продемонстрировало роль физических упражнений в устранении структурных и функциональных дефицитов в митохондриях, вызванных HIE не исчерпал всех возможных методов установления того, как стабилизируются кристы митохондрий; это имеет решающее значение для будущих исследований по этому вопросу.
Вклад автора: концептуализация, FG, FP, YW и CC; курирование данных, FG, FP, YW,HL и JF; формальный анализ, FG, HL и CC; приобретение финансирования, CC; расследование, FG, FP, YW, HL и JF; методология, FG, FP, YW и CC; администрация проекта, FG, YW и CC; ресурсы, CC; программное обеспечение, FG, FP, JF и CC; надзор, CC; валидация, FG, FP,YW, HL и CC; визуализация — FG, FP, YW, HL и JF; написание – оригинальный черновик, FG и YW; написание – рецензирование и редактирование FG и HL. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.
Финансирование: Исследование поддержано Проектом научных и технологических исследований Департамента науки и технологий провинции Хэнань (грант № 212102310217) и грантом Национального фонда естественных наук Китая (грант № 81401015).
Заявление Институционального наблюдательного совета: Исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за исследовательскими животными Университета Чжэнчжоу; ЗЗУИРБ2022-32.
Заявление об информированном согласии: Не применимо.
Заявление о доступности данных: Не применимо.
Конфликты интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Рекомендации
1. Ли, Б.; Консепсьон, К.; Мэн, X.; Чжан Л. Мозгово-иммунные взаимодействия при перинатальном гипоксически-ишемическом повреждении головного мозга. Прог. Нейробиол.2017, 159, 50–68. [Перекрестная ссылка]
2. Дуглас-Эскобар, М.; Вайс, доктор медицинских наук. Гипоксически-ишемическая энцефалопатия: обзор для клинициста. ЖАМА Педиатр. 2015, 169, 397–403. [CrossRef] [PubMed]
3. Черный, РЕ; Казенс, С.; Джонсон, Х.Л.; Лоун, Дж.; Рудан, И.; Бассани, Д.; Джа, П.; Кэмпбелл, Х.; Уокер, CF; Цибульскис Р.; и др. Глобальные, региональные и национальные причины детской смертности в 2008 году: систематический анализ. Ланцет 2010, 375, 1969–1987. [Перекрестная ссылка]
4. Юул, ЮВ; Ферриеро, доктор медицинских наук. Фармакологические нейропротекторные стратегии при неонатальной травме головного мозга. Клин. Перинатол. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]
5. Чжу, К.; Родригес, Дж.И.; Ли, Т.; Сюй, Ю.; Сан, Ю. Роль фактора, индуцирующего апоптоз, в перинатальном гипоксически-ишемическом повреждении головного мозга. НейронРеген. Рез. 2021, 16, 205–213. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
6. Сонг, С.-Х.; Джи, Ю.-С.; Ко, И.-Г.; Ли, Юго-запад; Сим, Ю.-Дж.; Ким, Д.-Ю.; Ли, С.-Дж.; Чо, Ю.С. Упражнения на беговой дорожке и на колесе улучшают двигательную функцию путем подавления апоптотической гибели нейронов у крыс с воспалением головного мозга. Дж. Упражнение. Реабилитация. 2018, 14, 911–919. [CrossRef]
7. Келли, М.; Дарра, Дж. Водные упражнения для детей с церебральным параличом. Дев. Мед. Ребенок. Нейрол. 2005, 47, 838–842. [Перекрестная ссылка]
8. Мюллер, П.; Дудерштадт, Ю.; Лессманн, В.; Мюллер, Н.Г. Лактат и BDNF: ключевые медиаторы нейропластичности, вызванной физическими упражнениями? Дж. Клин. Мед. 2020, 9, 1136. [CrossRef]
9. Интлекофер, К.А.; Котман, К.В. Упражнения противодействуют снижению функции гиппокампа при старении и болезни Альцгеймера. Нейробиол.Дис. 2013; в прессе. [Перекрестная ссылка]
10. Реал, К.; Феррейра, А.; Чавес-Кирстен, Г.; Торрао, А.; Пирес, Р.; Бритто, Л. Блокада рецептора BDNF препятствует положительному эффекту физических упражнений на крысиной модели болезни Паркинсона. Нейронаука 2013, 237, 118–129. [Перекрестная ссылка]
For more information:1950477648nn@gmail.com
