Модуляция сигнального пути рецептора арильных углеводородов влияет на репликацию вируса Хунин, часть 2

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Путь AHR чрезмерно представлен во время инфекции JUNV

Печень является одной из основных мишеней при инфекции JUNV [22]. Чтобы выяснить молекулярные механизмы, вовлеченные в инфекцию гепатоцитов, мы провели скрининг микрочипов Affymetrix для определения дифференциально экспрессируемых генов в клетках печени человека HepG2, инфицированных JUNV IV4454 в течение 24 или 48 часов.

Мы использовали программное обеспечение Transcriptome Analysis Console от ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США, чтобы оценить дифференциально экспрессированные гены в клетках, инфицированных JUNV, по сравнению с контролем (рис. 1a, b). В общей сложности 266 и 313 дифференциально экспрессируемых генов были обнаружены через 24 и 48 ч pi соответственно (рис. 1а, б).

Анализ микрочипов Affymetrix (n=3 независимых экспериментов на условие). Гены-хозяева, демонстрирующие по меньшей мере 1,6-кратное изменение экспрессии и 95-процентную вероятность дифференциальной экспрессии (p=0,05), рассматривались для дальнейшего анализа. Гены, показанные красным, были активизированы, гены, показанные зеленым, были подавлены, а гены, показанные серым цветом, не показали изменений в экспрессии по сравнению с неинфицированными клетками HepG2. (b) Дифференциально экспрессируемые гены между ложно-инфицированными и JUNV-инфицированными клетками HepG2 через 48 ч после заражения. ( c ) Анализ онтологии генов дифференциально экспрессируемых генов в клетках HepG2, инфицированных JUNV, через 48 ч после заражения. ( d ) Анализ чрезмерного представления путей JUNV-инфицированных клеток HepG2 по сравнению с ложно инфицированными клетками, демонстрирующий основные сигнальные пути, затронутые во время инфекции. Красная полоса выделяет путь AHR. Пунктирная синяя линия указывает p=0.05. значения p были определены с помощью программного обеспечения WebGestalt (http://www.webgestalt.org, по состоянию на 3 июля 2020 г.).

Существует тесная связь между генами хозяина и иммунитетом. Гены-хозяева во многом определяют развитие и функционирование иммунной системы человека и могут влиять на устойчивость человека к различным патогенам.

Несколько исследований показали, что определенные генные мутации могут привести к дисбалансу в иммунной системе. Например, некоторые люди могут страдать от заболеваний, при которых иммунная система чрезмерно реагирует, заставляя иммунную систему атаковать ткани своего тела, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка и другие заболевания. Кроме того, устойчивость к патогенам, таким как бактерии, вирусы и паразиты, также связана с генетическими различиями. Некоторые люди рождаются с более эффективной иммунной системой, которая уничтожает патогены быстрее и полнее.

Исследования взаимосвязи между генами хозяина и иммунитетом дали нам более глубокое понимание защитных механизмов организма, а также помогли лучше понять реакцию организма на различные заболевания. Это имеет большое значение для профилактики и лечения заболеваний.

Поэтому мы должны обратить внимание на важность генетического тестирования, а также изучить и понять различия в генах человека, чтобы лучше защитить нашу иммунную систему, укрепить свое телосложение и построить сильное тело. С этой точки зрения нам необходимо повышать свой иммунитет. Цистанхе может значительно улучшить иммунитет, потому что Цистанхе богат различными антиоксидантными веществами, такими как витамин С, витамин С, каротиноиды и т. д. Эти ингредиенты могут удалять свободные радикалы и уменьшать окислительный стресс. Стимулировать и повысить сопротивляемость иммунной системы.

Преимущества цистанхе тубулозы Click

Для дальнейшего изучения влияния JUNV на сотовый ландшафт мы использовали программное обеспечение WebGestalt (http://www.webgestalt.org, по состоянию на 3 июля 2020 г.), которое использует базу данных Wikipathways в качестве репозитория для выполнения анализа онтологии генов ( Рисунок 1c) и определить, какие сигнальные пути были дифференциально изменены по сравнению с контролем (Рисунок 1d).

Что касается анализа онтологии генов из дифференциально экспрессируемых генов, был сделан вывод, что инфекция JUNV влияет на экспрессию генов, связанных с метаболизмом РНК, киназами хозяина и метаболизмом липидов (рис. 1c). Стоит отметить, что эти биологические процессы и молекулярные функции, как сообщается, являются мишенями JUNV во время его цикла репликации [23].

Кроме того, анализ чрезмерной репрезентативности путей показал, что инфекция JUNV обогащает сигнальный путь AHR через 48 ч pi (рис. 1d) среди многих других путей (p < 0,05). В частности, мы обнаружили повышенную экспрессию целевого гена AHR CYP1B1, что свидетельствует о повышенной активности пути AHR.

За последние несколько лет несколько исследований показали важность AHR как терапевтической цели при различных патологических сценариях; таким образом, было разработано множество небольших соединений для модуляции его активности. Мы решили дополнительно изучить влияние модуляции AHR во время инфекции JUNV in vitro.

3.2. Фармакологическая модуляция AHR влияет на репликацию вируса

Чтобы выяснить роль, которую AHR играет в инфекциях JUNV, мы решили проверить эффекты известных лигандов AHR CH223191 (антагонист) и кинуренина (агонист) на инфекции in vitro с двумя различными аттенуированными штаммами JUNV: IV4454 и Candid # 1. Лечение и инфицирование проводили с использованием клеток Huh-7 и Vero. Поскольку эта последняя клеточная линия не может экспрессировать и секретировать интерферон типа I (IFN-I), ее использование позволяет определить важность экспрессии IFN-I в потенциальном AHR-опосредованном взаимодействии вирус-хозяин.

Во-первых, цитотоксичность различных концентраций как CH223291, так и кинуренина оценивали с помощью анализа МТТ (рис. 2а, б) и наблюдений оптической микроскопии (рис. 2в, г).

Что касается CH223191, снижение жизнеспособности клеток и морфологические изменения, связанные с цитотоксическими эффектами, были обнаружены только при концентрациях 80 мкМ (рис. 2а, в). С другой стороны, кинуренин не индуцировал цитотоксических эффектов ни при каких протестированных концентрациях (рис. 2b, d).

Чтобы исследовать эффект фармакологической модуляции AHR во время инфекции JUNV, клеточные культуры обрабатывали носителем (ДМСО), CH223191 или кинуренином, а затем инфицировали JUNV в течение 48 часов для определения выхода вируса. Вкратце, клетки Vero и Huh-7 обрабатывали носителем или обрабатывали различными концентрациями малой молекулы CH223191 (2,5, 5 мкМ, 10 мкМ и 20 мкМ) или кинуренина (5 мкМ, 10 мкМ). мкМ, 20 мкМ и 40 мкМ) до и после инфекции JUNV с помощью IV4454 и Candid # 1 при МВД 0,5. Через 48 ч супернатанты собирали и использовали для заражения клеток Vero для анализа БОЕ (рис. 3).

Блокада AHR значительно снижала продукцию вирусных частиц в зависимости от дозы, даже при самой низкой протестированной концентрации CH223191. Важно отметить, что этот результат наблюдался не только при использовании обоих аттенуированных штаммов JUNV, но и при использовании обеих инфицированных клеточных линий (Vero и Huh7). Обработка CH223191 JUNV-инфицированных клеток Vero и Huh-7 уменьшила количество вирусных бляшек на 93% и 97% соответственно (рис. 3a,b). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что сигнальный путь AHR является важным клеточным фактором во время инфекции JUNV (рис. 3а, б). С другой стороны, введение кинуренина до и после инокуляции JUNV существенно не изменило полученный титр вируса по сравнению с вирусным контролем (рис. 3c, d).

В целом, результаты впервые показали, что AHR является важным клеточным фактором во время инфекции JUNV in vitro, подразумевая провирусную роль, облегчая цикл репликации вируса.

3.3. Модуляция AHR влияет на экспрессию белка JUNV

Для дальнейшего изучения влияния модуляции AHR на инфекцию JUNV мы провели анализ непрямой иммунофлуоресценции. Белок JUNV NP является наиболее распространенным структурным и функциональным белком в семействе Arenaviridae. Таким образом, NP был выбран в качестве интересной мишени для окрашивания, учитывая, что только в нескольких исследованиях сообщалось о характере экспрессии NP различных аттенуированных штаммов JUNV. Нашим первым шагом было определить распределение NP обоих штаммов JUNV в наших клеточных моделях, чтобы сравнить допустимость различных клеточных линий и распространение вируса обоих аттенуированных штаммов в этих клеточных культурах (рис. 4).

Локализация NP была исключительно цитоплазматической и демонстрировала однородную картину накопления больших точек, сходную для обоих штаммов в клеточных линиях Vero и Huh-7 (рис. 4).

Затем мы оценили с помощью иммунофлуоресценции влияние фармакологической модуляции AHR на экспрессию NP в клеточных культурах, инфицированных JUNV.

Вкратце, клетки высевали на покровные стекла, предварительно обрабатывали либо носителем (DMSOCH223191 (10 мкМ), либо кинуренином (40 мкМ), а затем фиктивно инфицировали или инфицировали JUNV в течение 48 ч. После этого клетки фиксировали и обрабатывали с помощью иммунофлуоресценции. анализ (рис. 5).

Введение CH223191 заметно уменьшило количество NP-позитивных клеток в обеих клеточных культурах и для обоих штаммов JUNV (рис. 5). Эти наблюдения коррелируют с предыдущими результатами, показанными на рисунке 3a,b. Блокада AHR снижала не только процент инфицированных JUNV клеток, но и размер вирусных очагов. Культуры клеток Vero, предварительно обработанные CH223191 и инфицированные либо IV4454, либо Candid#1, показали уменьшение размера очагов на 57,14% (SD ± 7,98) и 41,17% (SD ± 9,05) соответственно. Кроме того, культуры клеток Huh-7, предварительно обработанные антагонистом и инфицированные либо IV4454, либо Candid#1, показали уменьшение размера очагов на 28,57% (SD ± 8,70) и 12,50% (SD ± 9,30) соответственно. С другой стороны, было замечено, что обработка кинуренином не изменяет процент NP-положительных клеток (фиг. 5) или размер очагов (не показано) по сравнению с необработанными инфицированными клетками.

Кроме того, более детальное микроскопическое исследование показало, что вирусные очаги были больше в инфицированных культурах клеток Vero по сравнению с культурами клеток, инфицированными Huh-7-. Мы наблюдали, что среднее число клеток Vero, инфицированных JUNV, в очаге состояло из 35 клеток, в то время как среднее число клеток Huh-7, инфицированных JUNV, в очаге состояло из 6 клеток. Это ожидаемое наблюдение согласуется с ограниченной вирусной средой, которую IFN-компетентные клетки навязывают размножению JUNV [24].

3.4. Подавление AHR снижает уровень вируса JUNV

Наконец, чтобы оценить, влияет ли блокада AHR на уровни РНК JUNV, клетки Vero и Huh-7 обрабатывали либо носителем, CH223191 (10 мкМ), либо кинуренином (40 мкМ), а затем ложно или JUNV-инфицировали для 48 ч. После этого монослои клеток собирали и обрабатывали для RT-qPCR для мониторинга уровней РНК ahr, cyp1a1 и np (рис. 6).

Было замечено, что обработанные CH223191- и инфицированные JUNV клетки демонстрируют тенденцию к более низким уровням мРНК ahr по сравнению с образцами, обработанными носителем и инфицированными JUNV (рис. 6a,b). Напротив, введение кинуренина показало тенденцию к повышению уровней мРНК ahr в клетках, инфицированных JUNV, по сравнению с образцами, инфицированными JUNV, обработанными носителем (рис. 6a, b). В соответствии с этими результатами обработка CH223191 показала тенденцию к снижению уровней мРНК cyp1a1 в клетках Huh-7, в то время как обработка кинуренином показала противоположные эффекты (рис. 6c). Что касается уровня РНК JUNV, было замечено, что обработка антагонистом AHR CH223191 снижала уровни вирусной РНК в инфицированных клетках по сравнению с образцами, обработанными носителем и инфицированными JUNV, в то время как обработанные кинуренином и инфицированные JUNV клетки имели тенденцию к повышению уровня вирусной РНК. Уровни РНК (рис. 6d, e).

В этой работе мы впервые показали, что инфекция JUNV in vitro индуцирует активацию сигнального пути AHR в культурах клеток печени. Данные микрочипового анализа показали, что сигнальный путь AHR сверхэкспрессируется в клеточных культурах, инфицированных JUNV, через 48 ч после заражения.

В нескольких исследованиях сообщалось, что активация AHR может оказывать различное влияние на физиологию клеток, влияя на пролиферацию и врожденные иммунные реакции [6,25]. Фактически, в последнее десятилетие активация AHR была описана как имеющая модуляторную активность IFN, оказывающую влияние на секрецию цитокинов [26,27]. Важно отметить, что сигнальная регуляция AHR может снижать противовирусные иммунные ответы IFN-I [28]. В связи с этим мы оценили влияние модуляции сигнального пути AHR на некомпетентные и компетентные клеточные культуры IFN, такие как клеточные модели Vero и Huh-7, с использованием небольших коммерческих молекул антагониста и агониста AHR во время инфекции JUNV in vitro с помощью два разных ослабленных штамма.

С помощью различных подходов было подтверждено, что отрицательная модуляция AHR посредством фармакологического ингибирования с помощью CH223191 обладает противовирусной активностью против JUNV. После блокады AHR было обнаружено подавление инфекции JUNV in vitro. Значительное снижение экспрессии вирусного белка наблюдалось в клеточных культурах, инфицированных JUNV, при обработке антагонистом AHR. Кроме того, блокада AHR уменьшала продукцию внеклеточных инфекционных вирусных частиц как аттенуированными штаммами IV4454, так и штаммами Candid # 1 JUNV, изученными в этой работе. Более того, наблюдалась тенденция к снижению уровней вирусной РНК в клетках, обработанных CH223191-. Интересно, что эти результаты наблюдались как в клеточных линиях Huh-7, так и в клеточных линиях Vero и показали эквивалентную величину, что позволяет предположить, что провирусная роль AHR во время инфекции JUNV может быть независимой от сигнального пути IFN-I. Эти результаты согласуются с нашими предыдущими наблюдениями на других вирусных моделях [13]. Потребуются дополнительные исследования, чтобы выяснить, на какой этап цикла репликации JUNV влияет блокада AHR.

Исследования, показывающие активацию AHR антропогенными лигандами, вызвали особый интерес в связи с растущим вниманием к неправильной эксплуатации окружающей среды и ее взаимосвязи с тяжестью вирусной инфекции [2]. Отметим, что ареал обитания грызунов-переносчиков ЮНВ охватывает большую территорию; однако в настоящее время ОГЛ поражает только ограниченный и ограниченный регион, где в основном ведется деятельность в сельской местности [29]. Кроме того, сельскохозяйственные рабочие составляют основную группу риска по развитию тяжелых проявлений при ОСН. Наша настоящая работа предполагает, что воздействие агонистов AHR на грызунов/человека может повлиять на исход инфекции JUNV.

Хотя в последние десятилетия были предприняты интенсивные исследования противовирусных препаратов против аренавирусов [30], в настоящее время не существует специфической противовирусной химиотерапии для лечения ОСН и заболеваний человека, вызванных другими патогенными представителями аренавирусов. В частности, вирус Ласса (ЛАСВ) является возбудителем лихорадки Ласса (ЛЛ), которая представляет серьезную угрозу для человека в регионах Западной Африки с очень высоким уровнем смертности [31]. В настоящее время единственным альтернативным методом лечения ЛФ является использование не по прямому назначению аналога гуанозина рибавирина, который продемонстрировал частичную эффективность у пациентов с ЛФ только в том случае, если его введение было начато в течение 6 дней после появления симптомов [32,33]. Кроме того, рибавирин может вызывать неблагоприятные побочные эффекты, что ограничивает рекомендацию по его назначению только пациентам с высоким риском. Тогда возникает реальная потребность в новых эффективных противовирусных препаратах для терапии аренавирусных геморрагических лихорадок. AHR представляет новую цель хоста для рассмотрения. Действительно, в настоящее время проводится несколько клинических испытаний с участием ингибиторов AHR (BAY2416964, IK-175 и HP163) при лечении различных видов рака. Тем не менее, эти испытания находятся на ранних стадиях, и ни одно из них не фокусируется на противовирусном потенциале фармакологического нацеливания на AHR. Примечательно, что препараты, направленные на клеточные факторы, необходимые в цикле размножения вируса, вернули интерес к противовирусной разработке, учитывая возможность получения ингибитора широкого спектра действия, воздействующего на мишень-хозяин, общую для нескольких патогенов человека [34,35], особенность, связанная с AHR.

В заключение, объединенные результаты настоящего исследования подчеркивают актуальность модуляции сигнального пути AHR в качестве потенциальной терапевтической мишени против JUNV. Будущие исследования потребуются для внедрения терапии, нацеленной на AHR, для преодоления важных проблем, таких как доставка лигандов AHR в нужные ткани и клетки, чтобы минимизировать возможные эффекты модуляции AHR вне цели.

Вклад автора:

Концептуализация, CCG; методология, MAP, AEADL и ABM; программное обеспечение, ФГ; валидация, MAP и FG; формальный анализ, MAP и MFT; расследование, MAP и MFT; ресурсы, EBD и CCG; курирование данных, FG; написание - подготовка первоначального проекта, MAP и MFT; написание — обзор и редактирование, EBD и CCG; надзор, КГС; администрирование проекта, CCG; приобретение финансирования, EBD и CCG Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование:

Эта работа финансировалась Университетом Буэнос-Айреса (UBA) (номер гранта 20020170100363BA) и Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) (номер гранта PIP11220170100171CO). EBD и CCG являются участниками программы Research Career от CONICET; MFT, AEADL и ABM — сотрудники CONICET. MAP — парень из UBA.

Заявление Институционального контрольного совета:

Непригодный.

Заявление об информированном согласии:

Непригодный.

Заявление о доступности данных:

Данные, подтверждающие результаты этого исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Благодарности:

Мы благодарим всех сотрудников лабораторий за полезные советы и обсуждения.

Конфликт интересов:

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов. Спонсоры не участвовали в разработке исследования; при сборе, анализе или интерпретации данных; при написании рукописи; или в решении опубликовать результаты.

Рекомендации

1. Голова, Дж. Л.; Лоуренс, Б.Р. Арилуглеводородный рецептор является модулятором противовирусного иммунитета. Биохим. Фармакол. 2009, 77, 642–653. [В паблике]

2. Торти, М.Ф.; Джованнони, Ф.; Кинтана, Ф.Дж.; García, CC Рецептор арильных углеводородов как модулятор противовирусного иммунитета. Передний. Иммунол. 2021, 12, 624293. [PubMed]

3. Шинде Р.; McGaha, TL Рецептор арильных углеводородов: подключение иммунитета к микроокружению. Тренды Иммунол. 2018, 39, 1005–1020. [Пубмед]

4. Стокингер, Б.; Хирота, К.; Дуарте, Дж.; Veldhoen, M. Внешнее влияние на иммунную систему посредством активации рецептора арилуглеводородов. Семин. Иммунол. 2011, 23, 99–105.

5. Ротхаммер, В.; Боруцкий, ДМ; Тьон, ЕС; Такенака, MC; Чао, CC; Ардура-Фабрегат, А.; де Лима, К.А.; Гутьеррес-Васкес, К.; Хьюсон, П.; Сташевский, О .; и другие. Микроглиальный контроль астроцитов в ответ на микробные метаболиты. Природа 2018, 557, 724–728. [Перекрестная ссылка]

6. Кинтана, Ф.Дж.; Бассо, А.С.; Иглесиас, А.Х.; Корн, Т .; Фарез, МФ; Беттелли, Э.; Каккамо, М .; Оукка, М .; Weiner, HL Контроль дифференцировки клеток Treg и TH17 с помощью рецептора арильных углеводородов. Природа 2008, 453, 65–71. [Перекрестная ссылка]

7. Маршалл, Н.Б.; Керквлиет, Н.И. Диоксин и иммунная регуляция: новая роль рецептора арильных углеводородов в образовании регуляторных Т-клеток. Анна. Академик Нью-Йорка науч. 2010, 1183, 25–37.

8. Фогель, CFA; Хан, Э.М.; Люнг, PSC; Гершвин, Мэн; Чанг, WLW; Ву, Д.; Хаарманн-Стемманн, Т .; Хоффманн, А .; Денисон, М.С. Перекрестная связь между рецептором арильных углеводородов и воспалительной реакцией: роль ядерного фактора-KB. Дж. Биол. хим. 2014, 289, 1866–1875. [Перекрестная ссылка]

9. Банкоти, Дж.; Расе, Б.; Симонес, Т .; Шеперд, Д.М. Функциональные и фенотипические эффекты активации AhR в воспалительных дендритных клетках. Токсикол. заявл. Фармакол. 2010, 246, 18–28. [Перекрестная ссылка]

10. Фогель, CFA; Гот, SR; Донг, Б.; Песах, Индиана; Мацумура, Ф. Сигнальный рецептор арила опосредует экспрессию индоламин-2,3-диоксигеназы. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. 2008, 375, 331–335. [Перекрестная ссылка]

11. Джин, Великобритания; Мур, Эй Джей; Голова, Дж. Л.; Ноймиллер, Дж. Дж.; Lawrence, BP Активация рецепторов арильных углеводородов снижает функцию дендритных клеток во время заражения вирусом гриппа. Токсикол. науч. 2010, 116, 514–522. [Перекрестная ссылка]

12. Джованнони Ф.; Бош, И.; Полонио, см; Торти, МФ; Уиллер, Массачусетс; Ли, З .; Роморини, Л.; Родригес Варела, MS; Ротхаммер, В.; Баррозу, А .; и другие. AHR является фактором-хозяином вируса Зика и потенциальной мишенью для противовирусной терапии. Нац. Неврологи. 2020, 23, 939–951. [Перекрестная ссылка]

13. Джованнони Ф.; Ли, З .; Ремес-Леников, Ф.; Давола, Мэн; Элизальде, М .; Палетта, А .; Ашкар, АА; Моссман, КЛ; Дугур, А.В.; Фигероа, Дж. М.; и другие. Сигнализация AHR индуцируется заражением коронавирусами. Нац. коммун. 2021, 12, 5148. [Перекрестная ссылка]

14. Бухмайер М.Дж.; де ла Торре, JC; Питерс, CJ Arenaviridae: вирусы и их репликация. В вирусологии Филдса, 4-е изд.; Липпинкотт Уильямс и Уилкинс: Филадельфия, Пенсильвания, США, 2013 г.; стр. 1283–1303.

15. Энриа, Д.А.; Бригилер, AM; Санчес З. Лечение аргентинской геморрагической лихорадки. Антивир. Рез. 2008, 78, 132–139. [Перекрестная ссылка]

For more information:1950477648nn@gmail.com