Многонаправленная активность бакучиола против клеточных механизмов старения лица - экспериментальные доказательства комплексного подхода к лечению Часть 1

Абстрактный

Цель: Старение кожи представляет собой многофакторный процесс, включающий образование активных форм кислорода, последующее воспаление со снижением жизнеспособности эпидермальных и дермальных клеток и, как следствие, повреждение внеклеточного матрикса. Эффективные дермокосметические методы лечения должны в идеале учитывать эти признаки при комплексном подходе. Здесь мы определили соответствующий профиль активности бакучиола, меротерпена растительного происхождения, в ряде исследований in vitro, ex vivo и in vivo и сравнили его с ретинолом, который в настоящее время считается золотым стандартом в местной омолаживающей косметике.

Гликозид цистанхе также может повышать активность СОД в тканях сердца и печени и значительно снижать содержание липофусцина и МДА в каждой ткани, эффективно удаляя различные активные кислородные радикалы (ОН-, Н₂О₂ и др.) и защищая от повреждения ДНК, вызванного ОН-радикалами. Цистанхефенилэтаноидные гликозиды обладают сильной акцепторной способностью свободных радикалов, более высокой восстановительной способностью, чем витамин С, улучшают активность СОД в суспензии сперматозоидов, снижают содержание МДА и оказывают определенное защитное действие на функцию мембран сперматозоидов. Полисахариды цистанхе могут усиливать активность СОД и GSH-Px в эритроцитах и ​​тканях легких экспериментально стареющих мышей, вызванную D-галактозой, а также снижать содержание МДА и коллагена в легких и плазме, повышать содержание эластина, хороший очищающий эффект на DPPH, продлевает время гипоксии у стареющих мышей, улучшает активность SOD в сыворотке и задерживает физиологическую дегенерацию легких у экспериментально стареющих мышей Эксперименты с клеточной морфологической дегенерацией показали, что Cistanche обладает хорошей антиоксидантной способностью и потенциально может стать лекарством для профилактики и лечения заболеваний кожи, вызывающих старение. В то же время эхинакозид в цистанхе обладает значительной способностью улавливать свободные радикалы DPPH и может улавливать активные формы кислорода, предотвращать вызванную свободными радикалами деградацию коллагена, а также оказывает хорошее восстанавливающее действие на повреждение анионов свободных радикалов тимина.

Нажмите на антиоксидант Cistanche Tubulosa

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Методы: Антиоксидантная способность и сила бакучиола и ретинола были проанализированы путем измерения восстановления 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH) с помощью затухания его поглощения и спектроскопии электронного спинового резонанса соответственно. Влияние на уровни простагландина E2 (PGE2), фактора торможения миграции макрофагов (MIF), фактора роста фибробластов 7 (FGF7), коллагена типа I и VII (COL1A1, COL7A1), фибронектина (FN), а также на метаболизм водорастворимого тетразолия 1 (WST-1) определяли в дермальных фибробластах человека. Регенерацию эпидермиса оценивали с использованием модели заживления ран in vitro. Уровни белка FN анализировали ex vivo после лечения препаратом, содержащим бакучиол, ретинол или носитель, с использованием жидкости для аспирации волдырей. Улучшение состояния кожи определяли in vivo в сравнительном исследовании с разделением лица после применения бакучиола или носителя.

Полученные результаты: В отличие от ретинола, бакучиол продемонстрировал высокую антиоксидантную эффективность. Уровни PGE2 и MIF значительно снижались как при приеме бакучиола, так и ретинола. Бакухиол, но не ретинол, значительно повышал уровень белка FGF7. Уровни метаболизма WST-1 были значительно увеличены бакучиолом и ретинолом. Применение бакучиола и ретинола привело к значительному увеличению уровней белков COL1A1, COL7A1 и FN. Раны, обработанные бакучиолом, но не ретинолом, показали значительное увеличение регенерации эпидермиса. Клинически области, обработанные составом, содержащим бакучиол, показали статистически значимое увеличение значений белка FN после 4-недельного применения по сравнению с необработанными областями и областями, обработанными носителем.

Заключение: Эти данные свидетельствуют о разнонаправленной эффективности бакучиола против клеточных признаков старения кожи. Его профиль активности имеет некоторые общие черты с ретинолом, но демонстрирует несколько ранее неизвестных положительных эффектов в наших исследованиях, а именно стимуляцию критического компонента внеклеточного матрикса FN и ускоренную регенерацию эпидермиса и заживление ран.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

омоложение, бакучиол, обоснование заявки in vivo/ex vivo/in vitro, ретинол, физиология/структура кожи

ВВЕДЕНИЕ

Для возрастной кожи характерны морщины, неравномерная пигментация, шероховатость и дряблость кожи. Эти клинические признаки являются результатом структурных и метаболических изменений, вызванных процессами внутреннего и внешнего старения. Внутреннее старение связывают с такими факторами, как укорочение теломер, хроническое воспаление, одиночные мутации митохондриальной ДНК и свободные радикалы [1]. Возрастная кожа также включает снижение ее антиоксидантных систем[2]. Кроме того, скорость пролиферации клеток снижается из-за процесса биологического старения, приводящего к потере структуры и функции кожи. Внешнее старение в первую очередь вызывается УФ-облучением и воздействием окружающей среды. Эти повреждения приводят к повреждению кожи, что усиливает хронологический спад и ускоряет старение кожи. Кожа человека в дальнейшем теряет способность справляться с воспалительными состояниями в процессе старения, что приводит к хроническому провоспалительному состоянию.

Местное применение ретиноидов, таких как ретиноевая кислота, ретиналь или ретинол, считается клиническим золотым стандартом эффективного омолаживающего лечения [3, 4]. Молекулярные механизмы действия ретиноидов подробно описаны [5–10]. Ретиноиды для местного применения эффективно уменьшают видимые признаки старения, такие как морщины, дряблость или шероховатость [4, 11], и уменьшают депигментацию фотоповрежденной кожи, включая ретикулярное ливедо и актинические лентиго [12]. Однако местное лечение ретиноидами может привести к сухости и раздражению кожи, зависящим от концентрации [13]. Поскольку применение ретинола вызывает незначительные побочные реакции по сравнению с другими ретиноидами, такими как ретиноевая кислота [6, 14], он широко используется в косметических средствах для лечения старения лица.

В отличие от ретинола, который применяется в продуктах по уходу за кожей с 1984 года [15], бакучиол только недавно привлек внимание в качестве местного антивозрастного соединения. Бакучиол представляет собой меротерпен (рис. 1), полученный из семян Psoralea corylifolia. Он веками использовался в традиционной индийской и китайской медицине [16, 17] и хорошо переносится [18]. Было высказано предположение, что бакучиол проявляет ретинол-подобные функции, поскольку в модели заменителя кожи оба вещества демонстрируют сходные паттерны экспрессии генов in vitro [19] и улучшают фотоповреждение кожи in vivo [20]. Следовательно, его также называют функциональным аналогом ретиноидов растительного происхождения [21]. Дальнейшие исследования продемонстрировали антиоксидантное [19, 22–24], противовоспалительное [19, 25–27], антибактериальное [28], а также антипролиферативное и противоопухолевое действие [29, 30] бакучиола.

Для эффективного улучшения и замедления многофакторных процессов старения кожи необходимо применять комплексный подход к различным клеточным механизмам. Бакучиол одновременно модулирует различные мишени, что делает его многообещающим соединением в этом отношении. Поскольку окислительный и воспалительный стрессы тесно связаны со старением кожи, их профилактика с помощью бакучиола может способствовать общему состоянию кожи. Однако недавно качество современных научных данных было подвергнуто критическому анализу [31]. В этом контексте мы определили (i) антиоксидантную и (ii) противовоспалительную способность бакучиола и ретинола и исследовали их способность улучшать клеточный метаболизм и синтез фактора роста 7, обобщенные как (iii) клеточная активность. Далее мы проанализировали, влияют ли бакучиол и ретинол на экспрессию определенных (iv) компонентов ECM и улучшают (v) регенерацию и реэпителизацию эпидермиса. Наконец, было проведено исследование in vivo для проверки клинической омолаживающей способности бакучиола в коже человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Тестовые материалы

Бакучиол был получен от Sytheon Ltd (Бунтон, Нью-Джерси, США). Ретинол был приобретен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Для экспериментов с клеточными культурами оба испытуемых вещества были свежеразведены в ДМСО (Merck, Дармштадт, Германия). Для исходных растворов ДМСО применяемая концентрация испытуемых веществ была 1000-кратно выше самой высокой концентрации, применяемой в клеточной культуре, с выходом 0,1 процента ДМСО в среде или буфере. Дальнейшие разведения выполняли с использованием среды или буфера с 0,1% ДМСО. Следовательно, все эксперименты с клеточными культурами проводились в присутствии 0,1% ДМСО. Для исследований in vivo местный ретинол был приготовлен в том же носителе, что и бакучиол.

Исследования in vitro

Определение антиоксидантной способности

Бакухиол, ретинол (оба применялись в конечной концентрации 100 мкМ) или тролокс высокого стандарта (Merck, конечная концентрация 25 мкМ) разводили в ДМСО. Вкратце, 30 мкл этих соединений (концентрация 10-в раз выше, чем конечная концентрация анализа) добавляли в 96-луночный планшет с плоским дном. Затем в каждую лунку быстро добавляли 270 мкл 39 мкг/мл DPPH (Merck, разведенный в смеси вода/этанол 1:1), получая конечную концентрацию 10% ДМСО. В качестве контроля раствор DPPH инкубировали с ДМСО без исследуемых веществ. Кроме того, проводили холостой контроль путем инкубации бакучиола или ретинола с водой/этанолом (1:1) или только со смесью вода/этанол (1:1), содержащей 10% ДМСО, в отсутствие DPPH. Через 10, 30 и 60 минут измеряли оптическую плотность при 524 нм с помощью многорежимного ридера микропланшетов Spark (Tecan, Маннедорф, Швейцария). Сигналы пустых контролей вычитали.

Определение антиоксидантной способности

HDF высевали в {{0}}луночные планшеты с 150 000 клетками на лунку в 2 мл среды, содержащей 10% телячьей сыворотки, и инкубировали в течение 24 часов. Затем старую среду удаляли, а клетки обрабатывали средой, содержащей 2% телячьей сыворотки и бакучиол или ретинол в конечной концентрации 10 мкМ. В контрольные HDF добавляли 0,1% ДМСО без бакучиола или ретинола. Пустые контроли выполняли путем инкубации среды без клеток. Через 24 часа кондиционированную среду переносили на спин-колонки концентратора белка Vivaspin (5000 MWCO; Sartorius, Геттинген, Германия) и концентрировали приблизительно в 10- раз. Объемы всех супернатантов среды выравнивали повторным добавлением протока. Уровни белка FGF7 в концентрированной кондиционированной среде анализировали с использованием имеющегося в продаже набора ELISA в соответствии с инструкциями производителя (Bio-Techne GmbH). Измерения проводились с использованием многорежимного ридера микропланшетов Spark (Tecan). Сигналы, полученные от пустых контролей, вычитали и уровни белка FGF7 нормализовали к общему количеству клеток, которое определяли с использованием счетчика клеток (Scepter, Merck).

Определение метаболизма WST-1

HDF высевали в {{0}}луночные планшеты по 3000 клеток на лунку в 100 мкл среды, содержащей 10% телячьей сыворотки, и инкубировали в течение 24 часов. Истощенную среду удаляли, а клетки обрабатывали 100 мкл среды, содержащей ретинол или бакучиол в конечной концентрации 1 мкМ или 10 мкМ соответственно. В контрольные HDF добавляли 0,1% ДМСО без бакучиола или ретинола. В качестве дополнительного контроля клетки обрабатывали 10-процентным тритоном-X (Merck). Пустые контроли выполняли путем инкубации среды без клеток. Через 72 часа клетки окрашивали с использованием имеющегося в продаже реагента для пролиферации клеток WST-1 в соответствии с инструкциями производителя (Merck). Поглощение измеряли при 450 и 620 нм, используя микропланшет-ридер Tecan infinity M200 (Tecan). Разницу в этих измерениях использовали для анализа. Сигналы пустых контролей вычитали.

Определение уровней белка COL1A1 и COL7A1

HDF высевали в {{0}}луночные планшеты с 10  000 клетками на лунку в 100 мкл среды, содержащей 10% телячьей сыворотки, и инкубировали в течение 24 часов. Бакухиол или ретинол разводили в 100 мкл среды без телячьей сыворотки и добавляли к настоящей среде в конечной концентрации 1 мкМ или 10 мкМ соответственно. В контрольную группу добавляли 100 мкл бессывороточной среды с концентрацией 0,1% ДМСО, соответствующей обработке ретинолом и бакучиолом. В качестве высокого стандарта применялись 10 нг/мл трансформирующего фактора роста- (TGF-) и 11 мкг/мл аскорбата натрия (оба Merck). Пустые контроли выполняли путем инкубации среды без клеток. Через 4 ч уровни белков COL1A1 и COL7A1 в кондиционированной среде анализировали с использованием имеющихся в продаже наборов ELISA в соответствии с инструкциями производителя (Novus Biologicals, Littleton, Colorado, United States). Измерения проводились с использованием многорежимного ридера микропланшетов Spark (Tecan). Сигналы пустых контролей вычитали. Уровни белка COL1A1 и COL7A1 нормализовали к общему количеству белка клеточного лизата, которое определяли с использованием имеющегося в продаже набора для анализа бицинхониновой кислоты (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Обязательным условием использования результатов была положительная реакция клеток на высокий стандарт TGF- и аскорбат натрия.

Для анализа уровней белка COL7A1 после длительного инкубирования HDF высевали в 96-луночные планшеты по 3000 клеток на лунку в 100 мкл среды, содержащей 10% телячьей сыворотки. Все обработки, контроли и анализ выполняли, как описано выше, за исключением того, что бакучиол и ретинол использовали только в конечной концентрации 10 мкМ. Клетки собирали, когда достигалось субконфлюэнтность, в частности, через 72 или 96 часов.

Определение уровня белка FN

HDF высевали в {{0}}луночные планшеты с 10 000 клетками на лунку в 100 мкл среды, содержащей 10% телячьей сыворотки, и инкубировали в течение 24 часов. Старую среду заменяли средой, содержащей 2% телячьей сыворотки и бакучиол или ретинол в конечной концентрации 10 мкМ. Контроль был дополнен 0,1% ДМСО без бакучиола или ретинола. Пустые контроли выполняли путем инкубации среды без клеток. Через 24 ч уровни белка FN в кондиционированной среде анализировали с использованием имеющегося в продаже набора ELISA в соответствии с инструкциями производителя (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США). Измерения проводились с использованием многорежимного ридера микропланшетов Spark (Tecan). Сигналы пустых контролей вычитали. Уровни белка FN нормализовали к общему количеству белка клеточного лизата, которое определяли, как указано выше.

Определение регенерации эпидермиса в модели заживления ран in vitro

Эксперименты проводились, как описано ранее [34]. Для лечения моделей заживления ран бакучиол или ретинол разводили в DPBS и добавляли в конечной концентрации 100 мкМ в область раны (5 мкл на рану). В эталонные раны добавляли такое же количество DPBS, содержащее 0,1% ДМСО без бакучиола или ретинола. Дополнительные раны оставляли необработанными в качестве дополнительного контроля. Модели для заживления ран инкубировали в течение 43 часов при 95-процентной влажности, 5-процентном СО2 и 37°С. Затем образцы быстро замораживали в изопентане, предварительно охлажденном жидким азотом, и хранили при температуре -80°С. Реэпителизацию оценивали в окрашенных гематоксилином и эозином криостатных срезах путем измерения длины регенерированного эпидермиса с использованием микроскопа Leica DMLS (10×), камеры Leica MC 170 HD CCD и программного обеспечения Leica LAS V4.9 (Leica Microsystems, Вецлар, Германия). Количественную оценку проводили слепым методом.

Исследования in vivo I и II

Для обоих исследований in vivo рекомендации текущей версии Хельсинкской декларации и руководства Международной конференции по гармонизации надлежащей клинической практики были соблюдены как применимые к косметическому исследованию. Протокол исследования I был одобрен Независимым этическим комитетом Фрайбурга (код феки 08/2610). В обоих исследованиях все добровольцы предоставили письменное информированное согласие. Субъекты имели здоровую кожу, относились к типу кожи по Фитцпатрику от I до III, и критерием исключения было начало или изменение гормонального препарата.

В течение 10-дневного периода предварительной подготовки и в течение всего периода исследования испытуемые должны были воздерживаться от воздействия УФ-излучения в тестовых зонах. Действия, стимулирующие потоотделение, запрещались за 24 часа до запланированных оценок.

Исследователь продемонстрировал правильное применение составов, используя количество, которое соответствовало обычному режиму ухода за кожей испытуемых.

Исследование I: определение уровней белка FN ex vivo

Из 52 субъектов женского пола, которые были включены в это контролируемое транспортным средством исследование, 33 субъекта завершили исследование, и данные 31 субъекта (30–64 года, средний возраст: 50,9 года) были включены в анализ данных. Отсев произошел из-за пандемии SARS-CoV-2 и личных причин (13 субъектов), а также из-за реакций несовместимости (5 субъектов, вызванных лечением ретинолом). Реакции несовместимости, опосредованные ретинолом, а также проблемы с отбором проб вызвали разное количество субъектов, протестированных для каждого состояния (подробности см. В результатах).

За семь дней до запланированных оценок использование средств по уходу за кожей, моющих средств и мыла на предплечьях было запрещено. В первый день исследования на внутренней стороне предплечья были установлены четыре тестовые области. На двух тестовых участках были применены две композиции настоящего препарата, содержащие {{0}},5% бакучиола или 0,15% ретинола соответственно. В заключении, опубликованном Научным комитетом по безопасности потребителей в 2016 г., применяемая концентрация ретинола считалась косметической процедурой [35]. В двух других тестовых зонах использовали соответствующий носитель, или зону не обрабатывали. Позиционирование мест лечения было переставлено. Через 4 недели применения тестовых составов два раза в день добровольцы вернулись в испытательный институт. В каждой тестовой зоне формировались три аспирационных волдыря (диаметром 7 мм), как описано ранее [36, 37]. Вкратце, на тестируемые участки помещали изготовленные на заказ блистерные присоски и применяли вакуум 550–850 мбар. Приблизительно через 90–150 минут, когда сформировались аспирационные пузыри, вакуум отключили и жидкость отсосали из волдыря с помощью иглы 24-калибра. Жидкости были немедленно заморожены при температуре -80 градусов на сухом льду до проведения анализа. Уровни белка FN определяли количественно в образцах аспирационной пузырной жидкости с использованием имеющегося в продаже набора ELISA (R&D Systems). Измерения проводились с использованием многорежимного ридера микропланшетов Spark (Tecan). Уровни FN нормализовали к уровням общего белка в образцах аспирационной пузырной жидкости, которые определяли, как указано выше.

Исследование II: Определение улучшения состояния кожи in vivo

В общей сложности 43 женщины-добровольца были включены в это сравнительное исследование разделенных лиц, контролируемое транспортным средством. Согласно медицинским заключениям, у испытуемых были смешанные типы кожи (сухая, нормальная, жирная и комбинированная). 34 субъекта (39–66 лет, средний возраст: 56,2 года) завершили исследование и были включены в анализ. Отсев был вызван техническими проблемами и несоблюдением требований (восемь субъектов), а также реакциями несовместимости (один субъект, вызванными лечением носителем и бакучиолом).

За две недели до начала исследования и в течение всего периода исследования добровольцы должны были воздерживаться от использования средств для автозагара или интенсивных косметических процедур для лица (например, удаление поверхностных слоев кожи). В течение 10-дневного периода предварительной подготовки и на протяжении всего исследования испытуемых просили воздерживаться от выполнения перманентного макияжа, ухода за ресницами и бровями, использования масок для глаз и повязок. За три дня до первой оценки испытуемых просили воздержаться от использования средств по уходу за лицом. Накануне запланированной аттестации испытуемые должны были прекратить нанесение декоративной косметики.

В первые 7 дней 10-дневной фазы предварительного кондиционирования испытуемые получали банку с кремом, содержащим исследуемый крем-носитель (без какой-либо информации о содержании), и наносили его два раза в день на все лицо. На исходном уровне добровольцы проводили самооценку. В частности, они визуально оценивали общий вид кожи лица, отмечая ее свежесть и сияние, а также любые признаки старения кожи. При этом применялась визуальная аналоговая шкала от 1 (очень утомленная, постаревшая) до 10 (очень свежая, без признаков старения кожи). Затем испытуемые получали две закрытые баночки с кремом, содержащие verum (носитель, содержащий 0,5% бакучиола) или носитель, соответственно, без каких-либо указаний на содержимое. В течение 12-недельного периода исследования одну лицевую сторону обрабатывали два раза в день verum, а другую лицевую сторону два раза в день обрабатывали носителем. Распределение обработок по испытательным участкам было изменено. Через 12 недель регулярного использования добровольцы снова провели самооценку, как указано выше.

статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием Microsoft Excel для Office 365 (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон, США), программного пакета SAS для Windows V9.4 (SAS Institute GmbH, Гейдельберг, Германия) и GraphPad Prism V8 (GraphPad Software, Сан-Диего). , Калифорния, США).

Нормальное распределение данных оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка. Если нормальное распределение подтверждалось, выполнялся дисперсионный анализ с повторными измерениями (RM-ANOVA) с постфактум попарным сравнением. Если гипотеза нормальности была отвергнута, преобразованные по Блому ранги исходных данных оценивались с использованием RM-ANOVA с апостериорным попарным сравнением, или исходные данные оценивались с использованием критерия знакового ранга Уилкоксона. Все статистические тесты были двусторонними при уровне значимости альфа=0,05.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследования in vitro

Определение антиоксидантного действия

Чтобы проанализировать (i) антиоксидантное действие бакучиола и ретинола, мы провели два разных анализа с использованием DPPH в качестве молекулы-детектора.

Антиоксидантная способность

Антиоксидантную способность определяли путем измерения восстановления DPPH по снижению его абсорбции. Тролокс высокого стандарта показал значительно повышенную антиоксидантную способность по сравнению с контролем (p=0.0000 для всех указанных моментов времени), подтверждая правильность измерения (рис. 2а). Что касается контроля, поглощение в образцах, обработанных бакучиолом, также было значительно снижено во все исследованные моменты времени (10 мин: p=0.0003, 30 и 60 мин: p=0.0000 ), демонстрируя повышенную антиоксидантную способность. Напротив, ретинол не проявлял значительной антиоксидантной способности по сравнению с контролем.

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】