Нейропротекторное воздействие упражнений и MitoQ на функцию памяти, динамику митохондрий, окислительный стресс и нейровоспаление у стареющих крыс, индуцированных D-галактозой. Часть 2

2.6. Подготовка тканей

После завершения 8-недельного теста на TE и поведение памяти всех крыс подвергали эвтаназии путем вдыхания CO2, а ткани мозга собирали у 7 животных в каждой экспериментальной группе.

Тест поведения памяти – эффективный инструмент оценки памяти. С ростом социального и рабочего давления память людей становится все более важной. Таким образом, прохождение теста на поведение памяти может помочь нам понять уровень нашей памяти и принять эффективные меры для улучшения и поддержания нашей памяти в соответствии с результатами теста.

В частности, тесты на поведение памяти могут оценить способность людей получать, обрабатывать, хранить и извлекать информацию. Путем тестирования различных типов информации, таких как язык, цифры, изображения и т. д., можно полностью проверить память людей. Результаты теста дадут различные оценки, которые помогут нам понять наши слабые и сильные стороны, а также то, как укрепить нашу память.

На практике многие тесты на поведение памяти также содержат профессиональные советы и рекомендации. Например, хороший сон, сбалансированное питание, правильные физические упражнения и регулярные упражнения для мозга — все это благотворно влияет на улучшение памяти. С помощью этих методов мы можем улучшить время сохранения памяти, способность воспроизведения памяти и другие аспекты, чтобы лучше адаптироваться к повседневной жизни или рабочим потребностям.

Короче говоря, тест на поведение памяти очень полезен для понимания, оценки и улучшения своей памяти. Нам также следует принять соответствующие методы для укрепления нашей памяти в соответствии с нашей реальной ситуацией, чтобы заложить прочный фундамент для более полноценной и богатой жизни. Видно, что нам нужно улучшить память, а цистанхе может значительно улучшить память, потому что цистанхе — это традиционное китайское лекарственное средство, обладающее множеством уникальных эффектов, одним из которых является улучшение памяти. Эффект Cistanche обусловлен различными содержащимися в нем активными ингредиентами, в том числе дубильной кислотой, полисахаридами, флавоноидными гликозидами и т. д. Эти ингредиенты могут способствовать здоровью мозга различными способами.

Нажмите «Знай кратковременную память», как ее улучшить.

После отделения коры головного мозга и гиппокампа ткань головного мозга быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ◦C до проведения анализа. Оставшихся 5 животных использовали для иммуногистохимического (ИГХ) анализа.

После вскрытия грудной полости через левый желудочек пропускали 50 мМ фосфатно-солевого буфера (PBS) в течение 10 мин, а затем животному перфузировали 4% параформальдегида (PFA) в 100 мМ PBS.

После перфузионной фиксации мозг собирали, помещали в 4% PFA и фиксировали в течение 4 часов при 4 ◦C. Фиксированную ткань мозга погружали в 30% раствор сахарозы на 2 дня, а затем разрезали на срезы толщиной 40 мкм с помощью криостата ( Leica Microsystems, Нуслох, Германия).

2.7. Выделение митохондрий

Для выделения митохондрий мы использовали набор для экстракции митохондрий (IMGENEX Corporation, Сан-Диего, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. На каждые 100 мг ткани гиппокампа добавляли 1 мл гомогенизирующего буфера.

После гомогенизации ткань центрифугировали при 900×g в течение 10 мин при 4 ◦С, супернатант собирали и снова центрифугировали при 15,000×g в течение 30 мин при 4 ◦С.

Отбирая центрифугированную цитозольную фракцию, цитозоль отделяли, а оставшийся осадок тщательно перемешивали в 1 мл суспензионного буфера, а затем центрифугировали при 15,000× g в течение 10 мин при 4 ◦C.

Супернатант удаляли и добавляли еще 1 мл суспензионного буфера, затем тщательно перемешивали и снова центрифугировали при 15,000×g в течение 10 минут при 4 ◦C.

Супернатант удаляли, а оставшийся осадок растворяли в 1 мл полного буфера для лизиса митохондрий в течение 30 минут при 4 ◦C. Затем митохондриальный экстракт центрифугировали при 15,000×g в течение 5 мин при 4°С и собирали супернатант (митохондриальную фракцию).

2.8. Вестерн-блоттинг
Общий белок, полученный путем выделения митохондрий, определяли количественно с использованием метода Брэдфорда. Равное количество митохондриальных белков (30 мкг на дорожку) загружали в электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8% или 12%).

После электрофореза белки переносили на мембрану из поливинилиденфторида (ПВДФ) (Millipore, Бостон, Массачусетс, США).

Блокирование осуществляли в течение 1 часа при комнатной температуре с использованием 1×трис-солевого буфера, содержащего раствор Твин-20 (TBS-T) с 5% БСА, а затем мембрану подвергали взаимодействию с первичными антителами в течение ночи при 4 ◦C.

Использовали следующие первичные антитела: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, каталаза и -актин (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, разведение: 1). :1000); и TNF- (Abcam, Кембридж, Великобритания, разведение: 1:1000).

Затем мембраны промывали промывочным буфером (PBS с 0,1% Tween 20), после чего их инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) козьими антикроличьими вторичными антителами к p22 phox, gp91 phox и TNF. - (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США, разведение: 1:5000).

HRP-конъюгированные козьи антимышиные вторичные антитела использовали для Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, каталазы и -актина (Santa Cruz Biotechnology, разведение: 1:5000).

Уровни экспрессии белка определяли с использованием системы обнаружения вестерн-блоттинга ECL (Santa Cruz Biotechnology). Плотность разработанных белковых полос анализировали с использованием системы визуализации геля ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США).

2.9. Иммуногистохимия (ИГХ)
Для ИГХ-анализа для выбранной ткани в каждой группе лечения использовали метод свободного плавания. После промывания ткани 3 раза по 10 мин в 0,01 М PBS ткань инкубировали при 80 ◦C в течение 60 мин в стакане, содержащем 0,01 М цитрата натрия, с последующим блокированием в 10% растворе. нормальная ослиная сыворотка (Millipore Sigma, Берлингтон, Массачусетс, США).

Затем образец ткани подвергали взаимодействию с первичными антителами против p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, разведение: 1:500) и анти-глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) (Abcam, разведение: 1:500) в течение 12 ч при 4 ◦С. На следующий день ткань промывали 3 раза по 5 минут в 0,01 М PBS, а затем вводили в реакцию с HRP-конъюгированными козьими антимышиными вторичными антителами (Santa Cruz Biotechnology, разведение: 1:5000) при комнатной температуре в течение 2 часов.

Наконец, ткань инкубировали при комнатной температуре с использованием раствора набора Vectastain-Elite ABC (Vector Laboratories, Берлингейм, Калифорния, США), и результаты визуализировали с использованием набора субстратов DABPerоксидазы (Vector Laboratories).

Каждый срез ткани помещали на предметное стекло с использованием монтажной среды (Vector Laboratories) и исследовали с помощью светового микроскопа (Leica Microsystems).

2.10. Статистический анализ

Данные анализировались с использованием SPSS для Windows версии 18.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Все значения выражены как среднее ± SEM. Статистическую значимость определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Для множественных сравнений использовались апостериорные тесты Бонферрони. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

3. Результаты

3.1. Влияние упражнений на беговой дорожке и MitoQ на экспрессию белков, связанных с митохондриальной динамикой, в гиппокампе стареющих крыс, индуцированных D-Gal

Мы подтвердили, что TE и MitoQ влияют на факторы, связанные со слиянием митохондрий (Mfn1, Mfn2, Opa1) и факторы, связанные с делением (Drp1, Fis1) в гиппокампе стареющих крыс (рис. 1).

Уровни экспрессии факторов, связанных со слиянием митохондрий, значительно различались между группами лечения (Mfn1, F4, 34=134.750, p < 0.001; Mfn2, F4, 34=80. 816, р <0,001; Opa1, F4, 34=51.456, р=0.001).

Уровни экспрессии факторов, связанных с делением митохондрий, также значительно различались между группами лечения (Drp1, F4,34=53.448, p < 0.001; Fis1,F4,34=116 0,313, р <0,001). Результаты апостериорных испытаний показаны на рисунке 1.

По сравнению с группой Y-CON, экспрессия факторов, связанных со слиянием митохондрий, снизилась в группе D-CON и показала тенденцию к увеличению в группах D-TE, D-MI и D-COMBI.

С другой стороны, экспрессия фактора Drp1, связанного с делением митохондрий, увеличилась в группе D-CON по сравнению с группой Y-CON. Хотя сигналы деления митохондрий уменьшались при комбинированном лечении с TE, лечение только MitoQ не вызывало значительных изменений.

Другой фактор, связанный с делением митохондрий, Fis1, демонстрировал те же тенденции к снижению, что и Drp1, но его уровень также снижался только при лечении MitoQ.

Рисунок 1. Влияние упражнений на беговой дорожке и митохинона (MitoQ) на экспрессию белков, связанных с митохондриальной динамикой, в гиппокампе стареющих крыс, индуцированных D-галактозой (D-gal). (A) Репрезентативные вестерн-блоты белков слияния и деления митохондрий. (B – F) Денситометрический анализ полос вестерн-блота, нормализованных по -актину. Данные, показанные в вестерн-блоттинге, представляют собой средние значения из мозга семи крыс.

-Актин был исследован в качестве внутреннего контроля. После ANOVA использовался апостериорный тест Бонферрони. Значения представляют собой средние значения ± SEM.

a Обозначает статистическое отличие от группы молодой контрольной группы (Y-CON). b Обозначает статистическое отличие от группы D-галактозы (D-CON). c Обозначает статистическую разницу с группой, получавшей D-галактозу плюс упражнения на беговой дорожке (D-TE).

d Обозначает статистическое отличие от группы D-галактоза плюс MitoQ (D-MI) (p < 0,05). Д-КОМБИ; D-галактоза плюс группа TE и MitoQ.

3.2. Влияние упражнений на беговой дорожке и MitoQ на экспрессию субъединиц НАДФН-оксидазы в коре головного мозга и гиппокампе стареющих крыс, индуцированных D-Gal

Мы наблюдали значительные различия между группами лечения по иммунореактивности p22 phox в коре головного мозга и гиппокампе стареющих крыс (рис. 2) (CA3,F4,24=18.786, p < 0.{{11) }}01; кора, F4, 24=12.662, p < 0,001).

В коре головного мозга группы D-CON показали повышенную иммунореактивность p22 phox по сравнению с группой Y-CON, которая значительно снизилась в группах D-TE, D-MI и D-COMBI.

В CA3 повышенная иммунореактивность p22 phox была снижена в группах D-TE и D-COMBI по сравнению с D-CON. Уровни экспрессии белков субъединиц NOX p22 phox, gp91 phox и p47phox значительно различались между группами (p22 phox, F4, {{10}}.513, p < 0.{{24} }01; gp91 phox,F4,34=57.282, p<0,001; p47 phox, F4,34=69.249, p<0,001).

Результаты пост-хоктеста показали значительное увеличение уровней субъединиц NOX в D-CON по сравнению с Y-CON. Однако уровни субъединиц NOX были ниже во всех группах вмешательства по сравнению с группой D-CON.

В частности, экспрессия p22 phox и gq91 phox была значительно снижена в группе D-TE по сравнению с группой D-MI. Эти результаты подразумевают, что физические упражнения и MitoQ по отдельности предотвращают вызванный старением окислительный стресс в мозге, но их комбинация не приводит к каким-либо дополнительным эффектам.

Рисунок 2. Влияние упражнений на беговой дорожке и MitoQ на экспрессию субъединиц НАДФН-оксидазы в коре головного мозга и гиппокампе стареющих крыс, индуцированных D-гал. (A1) Микрофотографии, показывающие иммунореактивность NAPDH p22 phox в коре головного мозга и гиппокампе стареющих крыс, индуцированных D-галом, в каждой группе. Черные прямоугольники в A1 обозначают часть изображений, показанных в f–i и p–t. (A2, A3) Количественная оценка оптической плотности окрашивания NADPH p22 phox в коре головного мозга и гиппокампе.

Апостериорный тест Бонферрони после ANOVA. Значения представлены как средние ± SEM.(n=5 животных). (a–e и k–o) Масштабная линейка=100 мкм, (f–j и p–t) Масштабная линейка=50 мкм. (B) Репрезентативные изображения вестерн-блоттинга субъединиц НАДФН-оксидазы в гиппокампе.

(C – E) Количественное определение субъединиц НАДФН-оксидазы в гиппокампе. Данные, представленные в вестерн-блоттинге, были получены из мозга семи крыс. -Актин был исследован в качестве внутреннего контроля. После ANOVA использовался апостериорный тест Бонферрони. Значения представляют собой средние значения ± SEM.

a Обозначает статистическое отличие от группы Y-CON. b Обозначает статистическое отличие от группы D-CON. c Обозначает статистическое отличие от группы D-TE. (p < 0,05).

3.3. Влияние упражнений на беговой дорожке и MitoQ на экспрессию GFAP в коре головного мозга и зубчатой ​​извилине гиппокампа у стареющих крыс, индуцированных D-Gal

Мы наблюдали значительные различия между группами лечения по иммунореактивности GFAP в коре головного мозга и зубчатой ​​извилине гиппокампа (DG) стареющих крыс (рис. 3) (Cortex, F4, 24=13.524, p < 0.001). ; ДГ, F4, 24=30.364).

Результаты апостериорного теста показали, что обработка D-гал значительно повышала иммунореактивность GFAP как в коре головного мозга, так и в DG.

По сравнению с группой D-CON уровни GFAP в коре были снижены во всех группах вмешательства, а уровни GFAP в DG были снижены в группах D-TE и D-COMBI, тогда как в группе D-MI наблюдались различия только в иммунореактивности GFAP. в области коры.

Таким образом, хотя лечение TE или MitoQ уменьшало вызванное D-галом нейровоспаление в коре головного мозга, только вмешательство TE вызывало положительные эффекты при DG.

For more information:1950477648nn@gmail.com