Норвоенин ослабляет индуцированный гипоксией окислительный стресс и апоптоз в клетках PC12

Для получения дополнительной информации:ali.ma@wecistanche.com

Абстрактный

Справочная информация: Норогонин представляет собой природный флавон с тремя фенольными гидроксильными группами в скелетной структуре и обладает превосходнымиантиоксидантная активность. Однако нейропротекторный эффект норогонина остается неясным. Здесь мы исследовали защитную способность норогонина против окислительного повреждения, вызванного гипоксией в клетках PC12. Методы. Жизнеспособность клеток и апоптоз исследовали с помощью анализа МТТ и окрашивания аннексином V-FITC/PI соответственно. Содержание активных форм кислорода (АФК) измеряли с помощью анализа DCFH-DA. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ), малоновый диальдегид (МДА) иантиоксидантный ферментуровни определяли с использованием коммерческих наборов. Экспрессию родственных генов и белков измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга соответственно. Результаты. Мы обнаружили, что норогонин облегчал индуцированное гипоксией повреждение клеток PC12 за счет повышения жизнеспособности клеток, снижения высвобождения ЛДГ и улучшения изменений в морфологии клеток. Норогонин также выступал в качествеантиоксидантнетза счет удаления АФК, снижения продукции МДА, поддержания активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ) и глутатионпероксидазы (ГП), а также снижения уровня экспрессии HIF-1 и VEGF. Кроме того, вогонин предотвращал апоптоз клеток путем ингибирования уровней экспрессии каспазы-3, цитохрома с и Bax при одновременном увеличении уровней экспрессии Bcl-2 и отношения Bcl-2/Bax. Выводы: Норогонин ослабляет индуцированное гипоксией повреждение клеток PC12, подавляя АФК, поддерживая активность антиоксидантных ферментов и ингибируя путь митохондриального апоптоза.

Ключевые слова: Норогонин,Антиоксидантная активность, Гипоксия, Окислительный стресс,апоптоз

Фон

Аэробные организмы нуждаются в кислороде (O2) для производства энергии. Гипоксия определяется как недостаточное снабжение кислородом для поддержания клеточной функции в тканях и часто возникает в некоторых физиологических ситуациях, таких как большая высота [1], и во многих патологических ситуациях, таких как инсульт [2]. Мозг особенно чувствителен к травмам, вызванным гипоксией, из-за высокого потребления кислорода, богатого ненасыщенными жирными кислотами и низким содержанием кислорода.антиоксидантная способность[3]. Появляется все больше данных, указывающих на то, что гипоксия может оказывать неблагоприятное воздействие на мозг [4–6].

Линьлинь Цзин, Жунмин Гао, Цзе Чжан, Дунмэй Чжан, Цзинь Шао, Чжэнпин Цзя и Хуйпин Ма

Департамент фармации, 940-й госпиталь объединенных сил материально-технического обеспечения НОАК, Ланьчжоу 730050, Ганьсу, Китай

Окислительный стресс и апоптоз считаются двумя факторами, способствующими гипоксическому повреждению [7, 8]. Сообщалось, что воздействие гипоксии увеличивает выработку внутриклеточных активных форм кислорода (АФК), что способствует окислительному стрессу. Избыток АФК, таких как супероксидный анион (O2-˙), перекись водорода (H2O2) и гидроксильный радикал (HO•), приводит к структурным и функциональным клеточным изменениям, атакуя липиды, мембраны, белки и ДНК, и впоследствии вызывает повреждение клеток. 9].

Нажмите на cistanche NZ для антиоксиданта

В то же время избыточная продукция АФК также способствует открытию переходной поры митохондриальной проницаемости (mPTP) [10] и переносу проапоптозных белков на внешнюю митохондриальную мембрану, что вызывает деполяризацию митохондриальных мембран и высвобождение цитохрома с [11]. Эти изменения в конечном итоге вызывают митохондриально-зависимый апоптоз [12]. Таким образом, считается, что антиоксиданты, обладающие способностью ингибировать или устранять избыток АФК, могут оказывать защитное действие за счет ослабления окислительного стресса и апоптоза, вызванных гипоксией. Многие исследования доказали, что антиоксидантные добавки, такие как витамин С [13], изофлавон [8] и нитроксидные радикалы [14], могут ограничивать повреждения, вызванные гипоксией, in vitro и in vivo. Флавоноиды представляют собой большой и разнообразный класс вездесущих вторичных метаболитов растений. Они всегда считались отличным природным антиоксидантом, способным поглощать свободные радикалы и ингибировать перекисное окисление липидов.

В настоящее время этому классу соединений уделяется все больше внимания в связи с их благотворным влиянием на здоровье человека. Было показано, что флавоноиды обладают широким спектром фармакологических действий, таких как противовоспалительное, антиноцицептивное, нейропротекторное действие и т. д., все из которых могут быть связаны с их антиоксидантной активностью [15]. Многие исследования показали, что флавоноиды обладают превосходным защитным действием при недостаточности, вызванной гипоксией. Например, рутин обладает выраженным нейропротекторным действием против гибели ганглиозных клеток сетчатки, вызванной гипоксией [16]. Недавнее исследование также продемонстрировало, что рутин может облегчать вызванное хлоридом кобальта повреждение гипоксии путем ингибирования окислительного стресса и апоптоза в клетках H9c2 [17]. Более того, Лю и соавт. предполагают, что нобилетин (3',4',5,6,7,8-гексаметоксифлавон) ослабляет повреждение I/R миокарда посредством активации пути Akt/GSK-3 в клетке H9c2. [18]. Кроме того, акацетин может защищать кардиомиоциты крыс и кардиомиобласты H9C2 от повреждения, вызванного гипоксией/реоксигенацией, посредством AMPK-опосредованной активации сигнального пути Nrf2 [19].

Норогонин (5,7,8-тригидроксифлавон, рис. 1) представляет собой фармакологически активный флавон, выделенный из корня Scutellaria baicalensis Georgi («Хуан Цинь» на китайском языке), традиционного китайского растения, используемого для лечения гриппа и рака. [20, 21]. Однако сообщалось об ограниченных исследованиях биологической активности норогонина из-за его низкого уровня в природных растениях. Для решения этой проблемы сообщается о нескольких методах синтеза норогонина [22, 23].

Наше предыдущее исследование также установило простой метод получения норогонина из хризина в четыре этапа [24]. Эти исследования положительно повлияли на дальнейшую оценку биологической активности норогонина. Исследования показали, что норогонин обладает антиоксидантной [25], противораковой [26, 27], противовирусной [28] и противомикробной активностью [29], а также ингибирует стимулированную цианидом продукцию АФК [30]. Однако остается неизвестным, обладает ли норогонин защитными свойствами против повреждений, вызванных гипоксией. Целью настоящего исследования было изучение защитных эффектов норогонина против индуцированного гипоксией окислительного стресса и апоптоза в клетках PC12.

Методы

Материалы и реагенты

Норогонин (чистота выше или равная 98 процентам) был синтезирован в соответствии с нашим ранее описанным методом [24]. Рутин (чистота выше или равная 96%) был приобретен у Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Сиань, Шаньси, Китай). Норогонин и рутин растворяли в стерильном диметилсульфоксиде (ДМСО), хранили при -20°С и разбавляли в среде для культивирования клеток непосредственно перед использованием. Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), эмбриональная телячья сыворотка (FBS), стрептомицин и пенициллин были приобретены у компании Solarbio co., Ltd. (Пекин, Китай).

Наборы малонового диальдегида (МДА), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ) и глутатионпероксидазы (ГПк) были получены из Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Цзянсу, Китай). 2',7'-дихлорид-гидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) и (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5- дифенилтетразолий бромид) тетразолия (МТТ) был получен от Sigma-Aldrich Co (Сент-Луис, Миссури, США). Первичные антитела к фактору, индуцируемому гипоксией-1 (HIF-1), фактору роста эндотелия сосудов (VEGF), В-клеточной лимфоме-2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} ассоциированный белок X (Bax), каспаза -3, цитохром C и -актин были приобретены у Abcam (Кембридж, Великобритания). Вторичные антитела были получены от компании ZsBio (Пекин, Китай).

Набор для анализа апоптоза был получен из Института биотехнологии Beyotime (Цзянсу, Китай). Все химикаты и растворители были аналитической чистоты и были получены от коммерческого поставщика в Китае. Культура клеток. Клетки PC12 были приобретены в Cell Bank Китайской академии наук (TCR 9, Шанхай, Китай) и выдержаны в среде DMEM с 10% (об./об.) FBS, 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. при 37 градусах во влажном инкубаторе, содержащем 5 процентов CO2. Для оценки цитотоксичности норогонина клетки РС12 (пассаж 4 ~ 6) предварительно инкубировали с различными концентрациями (10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 моль/л) норогонина в течение 1 ч, а затем культивируют в течение 24 ч. Воздействие гипоксии Чтобы вызвать модель повреждения клеток гипоксией, клетки PC12 подвергали воздействию среды гипоксии (1 процент O2, 5 процентов CO2 и 94 процента N2) при 37 градусах в течение 24 часов во влажной камере. Нормоксические контрольные клетки культивировали при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 в течение 24 часов.

Для оценки защитного действия норогонина против повреждения, вызванного гипоксией, клетки РС12 предварительно инкубировали с различными концентрациями (10-8, 10-7, 10-6, 10-5 моль/л). L) норогонина за 1 ч до лечения гипоксией. Жизнеспособность клеток Жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа МТТ, как описано ранее [31]. Вкратце, клетки PC12 (1 × 105 клеток/мл) высевали в 96-луночные культуральные планшеты. Затем в лунки добавляли различные концентрации норогонина. В контрольные лунки добавляли равный объем ДМСО. Конечная концентрация ДМСО в среде для культивирования клеток составляет 0,1%. После инкубации в условиях нормоксии или гипоксии в каждую лунку добавляли по 10 мкл МТТ (5,0 мг/мл) с последующей инкубацией при 37°С в течение 4 ч. Затем супернатант с МТТ удаляли, а формазановый продукт растворяли в 100 мкл ДМСО. Поглощение измеряли на устройстве для считывания микропланшетов SpectraMax i3 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США) при 570 нм. Результаты выражали как относительный процент контрольной группы. Клетки PC12, окрашенные гематоксилином и эозином (HE), высеянные на покровные стекла, инкубировали в течение 24 часов, прежде чем их обрабатывали норогонином таким же образом, как описано выше.

Среду удаляли и покровные стекла промывали холодным PBS с последующей фиксацией метанолом в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем промывали холодным PBS три раза по 5 мин. Наконец, клетки окрашивали в соответствии с протоколом окрашивания HE [32]. Анализы клеток проводили с использованием микроскопа OLYMPUS IX73 (100×) для проверки морфологических изменений клеток. Цифровые изображения получали с помощью цифровой камеры DXM 1200 C (Nikon), связанной с микроскопом. Содержание АФК Внутриклеточный уровень АФК в клетках РС12 определяли с помощью анализа DCFH-DA [33]. Вкратце, клетки PC12 (1 × 105 клеток/мл) высевали в 6-луночные планшеты. После обработки гипоксией клетки PC12 промывали PBS и затем инкубировали в культуральной среде, содержащей 10 мкМ DCFH-DA, в течение 30 мин в темноте при 37°С. Клетки наблюдали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus (Токио, Япония) и анализировали на проточном цитометре Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, Калифорния, США) с длиной волны возбуждения 488 нм и длиной волны излучения 525 нм. Уровень АФК выражали как относительный процент от контроля. Утечку ЛДГ, содержание МДА и активность антиоксидантного фермента Клетки PC12 (1 × 105 клеток/мл) высевали в чашку диаметром 90 мм. После обработки гипоксией, как описано выше, из каждой чашки собирали по 50 мкл культурального супернатанта и определяли активность ЛДГ в среде с использованием коммерческих наборов для анализа (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, China) и выражали в ед/мл. Клетки PC12 собирали и гомогенизировали после двукратной промывки холодным PBS. Концентрацию общего белка измеряли с помощью набора для анализа белка ВСА. Содержание МДА и активность антиоксидантных ферментов определяли с помощью коммерческих наборов (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, China).

Содержание МДА выражали в нмоль/мг белка. Активность SOD, CAT и GPx была представлена ​​в виде ед/мг белка. Апоптоз клеток (окрашивание аннексином-V/PI) После обработки гипоксией клетки PC12 собирали, дважды промывали холодным PBS и затем суспендировали в буфере для связывания. Клетки обрабатывали раствором аннексина V-FITC и PI в соответствии с протоколом производителя (Beyotime, Шанхай, Китай). Сбор данных проводили с использованием проточного цитометра Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, Калифорния, США). Количественный ПЦР-анализ в реальном времени. Суммарную РНК клеток PC12 экстрагировали с использованием реагента Trizol (Takara, Далянь, Китай) и преобразовывали в кДНК с использованием набора реагентов PrimeScript TM RT (AK4301,

Такара, Далянь, Китай). кДНК, кодирующую HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, каспазу-3, цитохром С и ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), амплифицировали с помощью количественного ре- временная ПЦР с использованием системы обнаружения в реальном времени 7300 (Applied Biosystems, Калифорния, США). Используемые праймеры показаны в таблице 1. Условия циклирования ПЦР: 95° в течение 30 с, затем 40 циклов при 95° в течение 5 с и 60° в течение 31 с. Уровни мРНК рассчитывали с использованием метода 2-ΔΔCt и нормализовали по GAPDH, который является эталонным геном. Клетки вестерн-блоттинга PC12 собирали и гомогенизировали в агентах RIPA. Концентрацию общих белков определяли количественно с использованием набора для анализа белков BCA. 30 мкг образцов разделяли с помощью электрофореза в 12-процентном SDS-PAGE, а затем переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA).

Мембраны блокировали 5-процентным обезжиренным молоком в буфере TBST в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали с первичными антителами: анти-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, Великобритания), анти-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, Великобритания), анти-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, Великобритания), анти-Bax (1:500, ab32503, Abcam, Великобритания), антикаспаза-3 (1:300, ab44976, Abcam, Великобритания), антицитохром C (1:1000, ab13575, Abcam, Великобритания) и анти- -актин (1:2000, ab8227 , Абкам, Великобритания) ночью при температуре 4 градуса. Затем мембраны промывали и инкубировали со вторичными антителами (1:2000, ZsBio, Пекин, Китай;) в течение 1 ч при комнатной температуре. Иммунореактивные полосы визуализировали с использованием реагентов усиленной хемилюминесценции (ECL). Относительную интенсивность полос нормализовали к внутреннему контролю -актина и анализировали с использованием Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

статистический анализ

Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение, полученное по меньшей мере из трех независимых экспериментов. Различия между группами анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Стьюдента-Ньюмена-Кеулса. Значение P < 0,05="" считалось="" статистически="">

Полученные результаты

Норогонин защищает клетки PC12 от повреждения, вызванного гипоксией

Во-первых, чтобы исключить пролиферативную активность норогонина, его цитотоксичность в отношении нормальных клеток PC12 определяли с помощью анализа МТТ. Как видно на рис. 2а, клеточная пролиферация существенно не изменилась после обработки норогонином в концентрациях 1 × 10– 8 -1 × 10– 5 моль/л (P > 0,05). ). Однако жизнеспособность клеток значительно снижалась при увеличении концентрации норогонина до 1 × 10–4 моль/л (P < 0,05).="" результаты="" показали,="" что="" норогонин="" не="" проявлял="" токсичности="" или="" пролиферативной="" активности="" в="" отношении="" клеток="" pc12="" в="" концентрациях="" 1="" ×="" 10–8="" -1="" ×="" 10–5="">

Затем мы исследовали защитный эффект норогонина против повреждения клеток PC12, индуцированного гипоксией. Как показано на рис. 2b, по сравнению с контрольной группой жизнеспособность клеток в группе гипоксии снизилась до 58,71% (P < 0.01).="" по="" сравнению="" с="" лечением="" гипоксией,="" предварительно="" обработанные="" 1×10-="" 8="" ,="" 1×10-7="" и="" 1×10-6="" моль/л="" норогонина="" защищали="" в="" зависимости="" от="" дозы="" pc12="" клеток="" против="" вызванного="" гипоксией="" повреждения,="" восстанавливая="" жизнеспособность="" клеток="" с="" 58,71="" до="" 62,79%="" (p=""><0,05), 66,68%="" (p=""><0,01) и="" 69,88%="" (p=""><0,01) соответственно.="" предварительная="" обработка="" рутином="" в="" концентрации="" 1="" ×="" 10–6="" моль/л="" также="" оказывала="" защитное="" действие,="" значительно="" увеличивая="" жизнеспособность="" клеток="" до="" 63,78%="" по="" сравнению="" с="" обработкой="" гипоксией.="" жизнеспособность,="" предварительно="" обработанная="" 1="" ×="" 10–5="" моль/л="" норогонина,="" снизилась="" до="" 63,43%,="" что="" все="" еще="" значительно="" выше,="" чем="" в="" группе="" гипоксии="" (p=""><0,05). эти="" результаты="" показали,="" что="" норогонин="" проявлял="" значительную="" цитозащиту="" при="" концентрациях="" 1="" ×="" 10–8="" -1="" ×="" 10–5="" моль/л,="" а="" наиболее="" эффективная="" концентрация="" составляет="" 1="" ×="" 10–6="" моль/л.="" затем="" эта="" доза="" использовалась="" как="" оптимальная="" в="" следующих="">

Защитная способность норогонина была также подтверждена морфологическими изменениями. Как показано на рис. 2в, клетки PC12 без обработки гипоксией хорошо росли, имели правильную форму (веретенообразную) и одинаковые размеры. После воздействия гипоксии клетки PC12 демонстрировали сморщивание, округлую форму, десквамацию и снижение плотности клеток. Клетки, предварительно обработанные норогонином или рутином до воздействия гипоксии, росли лучше, количество клеток десквамации уменьшалось, форма клеток восстанавливалась нормально. Кроме того, защитная способность норогонина была подтверждена утечкой ЛДГ, что связано с потерей целостности клеточной мембраны. Как показано на рис. 2d, активность ЛДГ в культуральной среде заметно увеличилась после воздействия гипоксии (P <>

Предварительная обработка норогонином или рутином резко снижала утечку ЛДГ, что свидетельствует о том, что норогонин и рутин восстанавливали целостность клеточной мембраны. Норогонин ингибирует вызванный гипоксией окислительный стресс в клетках PC12. АФК и МДА являются двумя важными индикаторами клеточного окислительного стресса, вызванного гипоксией. Как показано на рис. 3а и б, после воздействия гипоксии в клетках РС12 наблюдалось значительно повышенное содержание АФК и МДА. Предварительная обработка норогонином или рутином значительно ингибировала продукцию АФК и МДА.

Антиоксидантные ферменты, такие как SOD, CAT и GPx, считаются основной системой защиты от окислительного стресса в клетках. Как показано на рис. 3c-e, воздействие гипоксии значительно ингибировало активность SOD, CAT и GPx в клетках PC12. Лечение норогонином или рутином обращало эти изменения вспять и восстанавливало активность антиоксидантных ферментов. Все эти результаты показали, что норогонин защищает клетки PC12 от окислительного стресса, вызванного гипоксией.