Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы перейти к части 1

Трава цистанхе обладает очень хорошим нейропротекторным действием.

2.6. Антиапоптотические эффекты цитокининов, определяемые измерением активности каспазы-3/7

Как показали анализы окрашивания PI, описанные выше, SAL индуцировала увеличение скорости гибели клеток SH-SY5Y. Поскольку SAL связан как с апоптозом, так и с некрозом [51], мы также исследовали активацию каспазы -3 и 7 (casp-3}/7) в качестве специфического маркера апоптоза (фаза выполнения) [52]. после воздействия на клетки ЦК. Активность каспазы-3/7, зарегистрированная после обработки каждым из испытуемых соединений, была нормализована по отношению к активности, зарегистрированной после обработки 50{{30}} мкМ SAL (установлено как 100 процент ). Как показано на рисунке 4, хорошо известный ингибитор каспазы Ac-DEVD-CHO (включенный в качестве специфического контроля, связанного с апоптозом) сильно ингибировал активность каспазы-3/7 в субмикромолярных концентрациях (до 36,3 ± 2,66 и 25,2). ± 2,69% от уровней в клетках, обработанных только SAL в концентрации 0,05 и 0,5 мкМ соответственно). Подобные уровни ингибирования ранее наблюдались [53] в различных моделях нейродегенерации на основе клеток SH-SY5Y in vitro. Положительный контроль NAC также значительно снижал активность каспазы-3/7 до 88,7 ± 1,87% и 78,5 ± 2,56% от SAL-индуцированных уровней при 100 мкМ и 1000 мкМ соответственно. Протестированные CK оказывали широкий спектр эффектов на активность каспазы-3/7. Интересно, что из рибозидов CK только cZR оказывал значительное влияние на активность при 0,1 мкМ (снижая ее до 83,3 ± 4,33% SAL-индуцированных уровней соответственно), в то время как iPR при 1 мкМ не вызывал значительного снижения активности casp-3 ,7. Наконец, K3G снижал активность каспазы -3/7 с максимальным эффектом при 10 мкМ (до 81,7 ± 4,31% от SAL-индуцированного уровня). В целом SAL-индуцировал 1,6-кратное увеличение активности каспазы-3/7 по сравнению со здоровыми контрольными клетками (CTR, рис. 4) в соответствии с результатами более раннего исследования, в котором Использовали концентрацию SAL (400 мкМ) и ту же клеточную линию [54]. Известно, что NAC влияет на активность каспазы-3/7 в нескольких моделяхнейронныйсмерть [55–58]. Тем не менее, результаты, представленные здесь, обеспечивают первую демонстрацию их каспазы -3/7 в SAL-индуцированной модели SAL на основе клеток SH-SY5Y.нейронныйсмерть. Положительный контроль снижал активность каспазы-3/7, индуцированную 500 мкМ SAL, аналогично CK, но cZR и K3G были эффективны даже в субмикромолярных или микромолярных концентрациях. Другие исследования со стрессовыми моделями, связанными с болезнью Паркинсона (протеасомный ингибитор MG 132- или H2O2-, индуцированный токсичностью в клетках SH-SY5Y [17] и фибробластах [15]) и болезнью Гентингтона (модель голодания сыворотки в Клетки PC12 [19]) также показали, что CKs K и tZR могут обладать антиапоптотической (каспазной -3) активностью [17], и что как K, так и tZR могут обладать активностью против старения [17,19]. . Более того, связь между снижением активности касп-3,7 инейропротекторныйсообщалось об активности SAL и связанных с SAL моделей [54,59,60].

Рисунок 4. Активность каспазы-3/7 в SAL-индуцированной модели БП. Удваивается как минимум за четыре независимых дня. * P по сравнению с носителем с 500 мкМ SAL, # P по сравнению с носителем без 500 мкМ SAL.

2.7. Идентификация нейропротекторной активности цитокинина в модели глутамат-индуцированной гибели клеток

Поскольку клетки SH-SY5Y не экспрессируют все субъединицы рецептора NMDA [61], наиболее вероятным механизмом глутаматной (Glu) токсичности является блокирование цистин/глутаматного Xc-антипортера с массивной индукцией окислительного стресса [62]. Предыдущие авторы уже продемонстрировали связь между вызванной глутаматом гибелью клеток и некроптозом в клетках SH-SY5Y [63] и важностью активации каспазы-3 в индуцированной глутаматом токсичности по отношению к ним [62,64]. Несколько исследований также показали возникновение гибели клеток, вызванной железом (ферроптоз), после интоксикации глутаматом [62, 65, 66] и указали на возникновение трех типов гибели клеток (некроптоз, апоптоз и ферроптоз) после блокады Xc. -система антипортер. Для того, чтобы провести всестороннюю оценкунейропротекторныйпотенциал испытуемогоцитокинины, система анализа глутамат-индуцированной гибели клеток была включена в аналитическую панель с известнымнейропротекторныйхелатор железа дефероксамин (ДФО) и ингибитор некроптоза некростатин-1 (NEC-1) [67] в качестве положительных контролей. Здесь клетки SH-SY5Y дифференцировались в течение 48 ч, затем обрабатывались 160 мМ Glu или при их совместной обработке различнымицитокининконцентрации ({{0}}.1–10 мкМ) в течение 24 ч и окрашивали PI. В этой модели влияние Glu на гибель клеток соответствовало 100-процентному сигналу PI, поэтому оценивали снижение гибели клеток под действием испытуемых соединений. Glu индуцировал почти 4-кратное увеличение гибели клеток по сравнению со здоровым контролем SH-SY5Y (26,1 ± 0,42 процента). Скрининг положительных контролей ицитокининыпоказали, что оба положительных контроля NEC-1 (50 мкМ, 76,6 ± 2,51 процента) и DFO (10 мкМ, 84,2 ± 4,54 процента) уменьшали гибель клеток, вызванную глутаматом. Как показано на рисунке 5А, с панелицитокинины, только трицитокининысмогли защититьнейрон-подобные клетки SH-SY5Y аналогично положительным контролям. Самый активныйцитокининыбыли транс-зеатин (tZ) (0,1 мкМ, 79,5 ± 2,91 процента; 1 мкМ, 81,3 ± 2,77 процента) и цис-зеатин (CZ) (0,1 мкМ, 82,1 ± 3,29). процентов; 1 мкМ, {{20}},2 ± 2,89 процента) и кинетин (К) (1 мкМ, 88,0 ± 3,76 процента; 10 мкМ, 79,9 ± 3,44 процента). Чтобы подтвердить их многообещающую активность, был использован ортогональный анализ для более подробного выяснения биологических эффектов ЦК в этой модели: анализ высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) [68], который также показал резкое ({36}}кратное увеличение) увеличение токсичности после лечения Glu. Интересно, что определение высвобождения ЛДГ позволило нам различать активность ЦК и положительных контролей (НЭК-1 и ДФО). ЦК обладали умеренной, но значительной защитной активностью (tZ снижал смертность до 91,9 ± 1,40% при 0,1 мкМ; cZ снижал их до 92,3 ± 1,15% при 0,1 мкМ и 91,7% ± 1,56% при 1 мкМ; K снижал их до 92,2 ± 1,56 %. 1,06 процента при 1 мкМ). Положительные контроли NEC-1 и DFO обладали более сильным защитным действием, но были эффективны при гораздо более высоких концентрациях (снижение показателей до 76,9 ± 2,94 процента и 81,6 ± 3,74 процента при 50 и 10 мкМ соответственно) (рис. 5B). Анализ LDH подтвердил показания, полученные при окрашивании PI, и наблюдаемые эффекты положительных контролей соответствовали опубликованным данным [69,70]. Выводы, касающиеся эффектов K в модели Glu-индуцированной гибели клеток в клетках HT22 [18] и наши наблюдения за эффектами репрезентативных CK, таких как tZ, cZ и K, показывают, что CK являются многообещающими кандидатами для лечения нейродегенеративных заболеваний, связанных с окислительным стрессом. 71]. Наконец, tZ и cZ были предпочтительны, потому что они были эффективны при более низких концентрациях, и были выбраны вместе с K для дальнейших исследований их влияния на уровни окислительного стресса и активации каспазы-3,7.

цистанхеобзорыо последствияхнейропротекция

2.8. Влияние цитокининов на Glu-индуцированный окислительный стресс в клетках SH-SY5Y

В отличие от предыдущей модели Glu может вызывать окислительный стресс в клетках SH-SY5Y разными путями. Один из них основан на блокировании антипортера цистина/глутамата (Xc-), что приводит к истощению запасов глутатиона (GSH) и негативному влиянию на активность супероксиддисмутазы (СОД) [62]. Glu-опосредованная гибель клеток также предположительно включает образование АФК, управляемое Rac-NADPH-оксидазой (в частности, супероксидного радикала) в клетках SH-SY5Y [72]. Эти данные указывают на то, что основной причиной гибели клеток в Glu-индуцированной модели является OS. В рамках модели,нейрон-подобные клетки совместно обрабатывали Glu и тестируемыми соединениями, окрашивали DHE и наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии. Как видно на фигуре 6А, в клетках, обработанных Glu, наблюдалось резкое повышение красной флуоресценции ДГЭ, которое было улучшено веществами положительного контроля и протестированными ЦК. Основываясь на наблюдениях под микроскопом, количественную оценку уровней супероксида проводили в Glu-индуцированных клетках таким же образом, с помощью анализа DHE, как и в SAL-индуцированных клетках. Результаты были нормализованы по отношению к уровням, индуцированным одним Glu (установленным за 100 процентов), что вызвало резкое, почти 3-кратное увеличение уровней супероксида всего за 4 часа в организме.нейрон-подобные клетки SH-SY5Y по сравнению с уровнями в здоровых контрольных клетках (CTR: 33,79 ± 1,45%). Как показано на рисунке 6B, CK, такие как tZ, cZ и K, значительно снижали уровень супероксида в клетках, отравленных Glu: 0,1 мкМ tZ, 0,1 мкМ cZ, 1 мкМ и 10 мкМ K снижал его до 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 и 83,8 ± 2,32 процента от уровней в клетках, обработанных одним Glu. Эти уровни сравнимы с уровнями, полученными при использовании ингибитора некроптоза NEC-1 (80,5 ± 3,19% при 5 мкМ и 80,4 ± 2,70% при 50 мкМ) и хелатора железа ДФО (80,2 ± 3,80% при 10 мкМ). Результаты, полученные с помощью модели гибели клеток, вызванной Glu, особенно эффекты положительного контроля, согласуются с предыдущими отчетами [70,73]. Предыдущие доказательства того, что CK обладают эффектом снижения OS в Glu-индуцированных или подобных моделях, ограничиваются демонстрацией того, что K является мощным агентом, снижающим OS (примерно 23 мкМ) в модели гибели клеток на основе клеток HT22, индуцированной Glu [18]. ]. Мы обнаружили, что K обладает эффектом снижения ОС при более низких концентрациях (1–10 мкМ) в наших клетках SH-SY5Y. Кроме того, наблюдались благоприятные долгосрочные эффекты tZ на фибробласты человека, включая активность по разложению перекиси водорода [15], что позволяет предположить, что tZ и cZ могут иметь косвенные эффекты снижения ОС в моделях гибели клеток, индуцированных Glu. Кроме того, в других сообщениях указывалась связь между опосредованным CK эффектом снижения ОС и защитной активностью [22,74–76]. Взятые вместе, tZ, cZ и K продемонстрировали удивительно сильный эффект снижения ОС, сравнимый с эффектом положительного контроля, несмотря на различную силу в целом.нейропротекторныйэффект.

Рисунок 5. (A) Смертностьнейрон-подобные клетки SH-SY5Y в глутамат-индуцированной модели гибели клеток; (B) Glu-индуцированная токсичность (высвобождение ЛДГ)нейрон-подобные клетки SH-SY5Y. Тройное повторение по меньшей мере за три независимых дня.* P по сравнению с носителем с 160 мкМ Glu, # P по сравнению с носителем без 160 мкМ Glu.

Рисунок 6. (A) Glu-индуцированный окислительный стресс (OS) и OS-снижающая активность указанных соединений у человека.нейрон-подобные клетки SH-SY5Y, визуализированные с помощью флуоресцентной микроскопии после мечения дигидроэтидием (DHE). Бары=50 гм. Изображения показываютнейрон-подобные клетки SH-SY5Y, обработанные ДМСО (контроль), 160 мМ глутамата (Glu) отдельно и вместе с: 10 мкМ дефероксамина (плюс ДФО), 50 мкМ некростатина{{6} } (плюс NEC-1), 0,1 мкМ tZ (плюс tZ) и 0,1 мкМ cZ (плюс цЦ) в течение 4 ч, затем окрашивали ДГЭ. (B) Индуцированное Glu образование супероксидного радикала внейрон-подобные клетки SH-SY5Y через 4 часа. На графике показано количественное определение клеток, окрашенных ДГЭ, с использованием устройства для считывания микропланшетов Infinite M200 Pro (Tecan, Австрия). Трижды за пять независимых дней.

* P по сравнению с носителем с 160 мкМ Glu, # P по сравнению с носителем без 160 мкМ Glu.

2.9. Влияние цитокининов на активность каспазы -3/7 в модели Glu-индуцированной гибели клеток

Glu оказывает такое же токсическое действие на клетки SH-SY5Y, как ранее сообщалось о воздействии на клетки HT22, связанном с блокировкой Xc-антипортера. Таким образом, в обоих случаях задействованы неапоптотические механизмы гибели клеток (ферроптоз, некроптоз и др.) [62], хотя экспрессия каспазы -3 и, в некоторой степени, субъединицы NMDA NR1 может быть более выражена в SH. -клеток SY5Y [61]. Следовательно, конечные стадии гибели клеток в двух клеточных линиях могут различаться. Сопутствующая роль активности каспазы -3 наблюдалась во многих исследованиях в Glu-индуцированной модели клеточной гибели клеток SH-SY5Y [62,77–79]. В этом анализенейрон-подобные клетки SH-SY5Y обрабатывали здесь 160 мМ Glu, что приводило к повышению активности каспазы-3/7. В попытках выяснить роль апоптоза в Glu-индуцированной гибели клеток SH-SY5Y был применен специфический ингибитор каспазы -3/7, Ac-DEVD-CHO, и было обнаружено, что он оказывает сильное ингибирующее действие: при 50 нМ он снижал активность каспазы-3,7 до 23,70 ± 1,01 процента от уровня в клетках, обработанных

только с Glu и при 0,5 мкМ он почти полностью блокировал активность (снижая ее до нормализованного уровня всего 7,22 ± 1,05 процента, что сравнимо с уровнем, наблюдаемым в здоровых клетках:

7,8 ± 0,39 процента), как показано на рисунке 7. Применение положительных контролей приводило к постепенному дозозависимому снижению активности каспазы-3,7. Интересно, что НЭК{8}} оказывал незначительное влияние с максимальным эффектом при 50 мкМ, а ДФО обладал более сильной ингибирующей активностью при 10 мкМ (снижение активности до 80,5 ± 1,85 и 75,8 ± 3 мкМ). .00 процентов соответственно). С другой стороны, лишь небольшое, но значительное влияние на casp-3,7 было достигнуто при использовании tZ в дозе 1 мкМ (89,5 ± 2,50%), cZ в дозе 0,1 мкМ (87,4 ± 1,62%) и K в дозе 1 мкМ ( 91,0 ± 2,06 процента). В совокупности результаты показывают, что оба положительных контроля имели более сильную активность по снижению активности каспазы -3/7, чем протестированные CK, но CK оказывали действие при гораздо более низких концентрациях. В целом, результаты показывают, что модуляция активности каспазы-3/7 играет ключевую роль в мощномнейропротекторныйактивности таких агентов, как ДФО [58] в Glu-индуцированной модели гибели клеток [79,80]. Однако, как показано в этом разделе, NEC-1 такженейропротекторныйактивности, предполагая, что другие типы гибели клеток могут быть вовлечены в Glu-индуцированную гибель нейроноподобных клеток SH-SY5Y [63,67,81]. Указания на то, что каспазо-независимые механизмы вовлечены в Glu-индуцированную гибель клеток, также были получены при анализе эффектов NEC-1 [70], DFO [69] и K [18] на клетки HT22.

Рис. 7. Активность каспазы-3/7 в Glu-модели окислительного повреждениянейрон-подобные клетки SH-SY5Y. Удваивается как минимум за четыре независимых дня. * P по сравнению с носителем с 160 мкМ Glu, # P по сравнению с носителем без 160 мкМ Glu.

3. Выводы

Таким образом, наше исследование показало, что ЦК и их метаболиты обладаютнейропротекторныйактивности в SAL-индуцированной моделиболезнь Паркинсонаи Glu-индуцированное окислительное повреждение в дифференцированном SH-SY5Y человеканейронныйклетки. Было обнаружено, что K3G, cZR и iPR обладают биологически значимыми свойствами.нейропротекторныйвиды деятельности. Более того, активные ЦК были эффективны при более низких (субмикромолярных и микромолярных) концентрациях, чем вещество положительного контроля NAC. K3G, cZR и iPR также оказывали положительное влияние на жизнеспособность, цитотоксичность, окислительный стресс и активность каспазы-3,7 (кроме iPR). Ортогональные демонстрации убедительно указывают на то, что активность антиоксидантного стресса играет ключевую роль в защитных эффектах ЦК в модели гибели клеток, вызванной SAL. Только три метаболита в протестированной панели CK (tZ, cZ и K) защищалинейрон-подобные клетки SH-SY5Y в Glu-индуцированной модели окислительного повреждения аналогично хелатору железа NEC1 и ингибитору некроптоза DFO. Чтобы подтвердить их многообещающую активность, мы проверили их действие в анализе высвобождения ортогональной лактатдегидрогеназы (ЛДГ). ЦК обладали умеренной, но значительной защитной активностью. Это было слабее соответствующих активностей контрольных веществ, но, несмотря на различия в модуляциинейронныйздоровья, все три протестированных CK стимулировали сильное снижение образования супероксидных радикалов, аналогично веществам положительного контроля. ЦК также оказывали сравнимое действие на индуцированный Glu окислительный стресс в клетках SH-SY5Y с действием NEC1 и DFO, но эти соединения оказывали более сильное ингибирующее действие на активность каспазы -3/7, чем ЦК. Поскольку Glu-индуцированная гибель клеток не зависит от каспаза-зависимого пути, как показано в исследованиях эффектов DFO и NEC-1 на HT-22 клетки [70], CK, по-видимому, могут модулировать как каспазо- зависимая и независимая гибель клеток за счет снижения окислительного стресса [18,82]. В текущих исследованиях детальный механизм действия ЦК и/или их митохондриальные эффекты нанейронныйили клетки астроцитов будут исследованы.

цистанхеопытдляПДа такжеПамять

4. Материалы и методы

4.1. Химикаты и реагенты

Цитокининстандарты были получены от OlChemIm (Оломоуц, Чехия). Calcein AM (раствор 1 мг/мл), набор для высвобождения LDH и набор для роста нейритов были приобретены у ThermoFisher. Йодид пропидия, дигидроэтидий, компоненты буфера для анализа каспазы- 3/7, среда DMEM/F12 1:1, эмбриональная телячья сыворотка, трипсин, ATRA, гидробромид салсолинола, мононатриевая соль глутамата, дефероксамин, N-ацетилцистеин , Ac-DEVD-CHO и ДМСО для клеточных культур были приобретены у Sigma Aldrich (Merck). Субстрат Ac-DEVD-AMC был предоставлен Enzo Life Science.

4.2. Анализы активности удаления радикалов ORAC

Способность соединений удалять свободные радикалы in vitro определяли с помощью анализа способности поглощения радикалов кислорода (ORAC). Вкратце, флуоресцеин (100 мкл, 500 мМ) и 25 мкл раствора тестируемого соединения добавляли в микропланшет с 96-лунками, предварительно инкубированный при 37oC. Далее 25 мкл 250 мМ 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. Культура клеток SH-SY5Y

Линия клеток нейробластомы человека SH-SY5Y, приобретенная в ATCC (Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния, США), выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла и питательной смеси Хэма F12 (DMEM: F-12, 1:1). ), с добавлением 10-процентной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1-процентного пенициллина и стрептомицина при 37 oC во влажной атмосфере с 5-процентным содержанием CO2. Клетки пассировали до 20 раз и меняли среду дважды или трижды в неделю. Плотность клеток устанавливали в соответствии с запланированным анализом (5000, 7000, 10 000 или 20 000 клеток на лунку) в 96-многолуночных планшетах в 100 мкл общего объема среды для каждого эксперимент. На следующий день после посева к клеткам добавляли ATRA в среде DMEM/F12 с 1% FBS до конечной концентрации 10 мкМ и продолжали инкубацию еще в течение 48 часов, чтобы индуцировать дифференцировку, обеспечить образование более длинных нейритов и уменьшить распространение.

4.4. микроскопия

Микрофотографиинейрон-подобные клетки SH-SY5Y получали с использованием флуоресцентного микроскопа DM IL LED (Leica Microsystems, Мангейм, Германия) с соответствующим фильтром возбуждения для анализа или установки для яркого поля с высокопроизводительной цифровой камерой DP73 (Olympus, Токио, Япония). ). Поскольку отношение сигнал/шум для окрашивания было умеренным, контраст был слегка отрегулирован в программном обеспечении ImageJ (Fiji), не влияя на результирующее наблюдение. Оригинальные изображения включены в дополнительные материалы.

4.5. Окрашивание клеточной мембраны (набор для роста нейритов, Invitrogen™)

Нейрон-подобные клетки SH-SY5Y (5000 клеток на лунку), полученные в результате 48-часовой процедуры дифференцировки, окрашивали набором Neurite outgrowth kit (Invitrogen™) в соответствии с рекомендациями производителя с небольшой модификацией. Клетки промывали PBS, метили раствором окрашивающего мембраны красителя, входящего в комплект (по протоколу для 96 многолуночных планшетов), в PBS в течение 20 мин при 37 oC, снова промывали PBS и просматривали под флуоресцентным микроскопом ( с длинами волн возбуждения и излучения 533 и 585 нм соответственно).

4.6. Лечение клеток

После процедуры дифференцировки среду дифференцировки заменяли на 1-процентную среду DMEM/F12 с добавлением испытуемых соединений в концентрациях 0,1, 1 и 10 мкМ (с 7000 мкМ). клеток на лунку для тестов на цитотоксичность) или вместе с токсином SAL в концентрации 500 мкМ (с 7000–10 000 клеток на лунку) или 160 мМ Glu (с 20 000 клеток на лунку) в течение соответствующей продолжительности для типа анализа (жизнеспособность, гибель клеток и др.). Контрольные клетки обрабатывали средой, содержащей 0,1% ДМСО.

4.7. Жизнеспособность клеток и гибель клеток

Жизнеспособностьнейрон-подобные клетки SH-SY5Y, растущие в 96-луночных микропланшетах (примерно 7{7}}00 клеток на лунку) после 24 ч обработки, оценивали с помощью анализа Calcein AM с небольшой модификацией [31]. Используемый раствор Calcein AM в PBS имел концентрацию 0,75 мкМ, а время инкубации было установлено на 50 минут. Количество живых клеток в каждой лунке определяли с помощью планшет-ридера Infinite M200 Pro (Tecan, Австрия) с длинами волн возбуждения и испускания 495 и 517 нм соответственно.

Гибель клетокнейрон-подобные клетки (модель SAL: 10 000 клеток на лунку; модель Glu: 20 000 клеток на лунку) определяли с помощью анализа PI, как сообщалось Stone et al. 2003 г. с небольшой модификацией [83]. Вкратце, среду модели, индуцированной SAL, отсасывали и заменяли на раствор PI с концентрацией 1 мкг/мл в PBS, но клетки, подвергшиеся Glu-индукции, имеют более слабую адгезию, поэтому раствор PI с концентрацией 1 мг/мл в PBS добавляли к дают окончательную концентрацию 1 мкг/мл. В обоих случаях клетки инкубировали еще 15–25 мин при комнатной температуре, затем флуоресценцию PI измеряли с помощью ридера Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Австрия) с длинами волн возбуждения 535 и 617 соответственно. Полученная флуоресценция PI, полученная только с токсинами, была принята за 100-процентную гибель клеток.

4.8. Измерение окислительного стресса с помощью анализа дигидроэтидия (DHE)

Клетки дифференцировали и обрабатывали, как описано в предыдущем разделе, для SAL-индукции (10 000 клеток на лунку, 24 ч или Glu-индукции (20 000 клеток на лунку, 4 ч). После обработки клетки центрифугировали при 500 xg в течение 330 с, затем культуральную среду заменяли (после аспирации) на 10 мкМ раствор ДГЭ в PBS. 96-многолуночные планшеты с клетками инкубировали в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. температуры, затем измеряли флуоресценцию ДГЭ с помощью устройства для считывания микропланшетов Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Австрия) с длинами волн возбуждения и испускания 500 и 580 нм соответственно.Полученная флуоресценция ДГЭ, полученная только с SAL или Glu, была установлена ​​как 100-процентный супероксидный радикал. Иллюстративные флуоресцентные микрофотографии клеток, окрашенных ДГЭ, были получены после измерения ДГЭ с помощью устройства для считывания микропланшетов.

Цистанхе обладает очень хорошим нейропротекторным действием.

4.9. Измерение активности каспазы-3/7

Одноэтапный анализ каспазы-3/7 выполняли в соответствии с ранее опубликованной процедурой [84]. Для культур, подвергнутых SAL-индукции и Glu-индукции, реакционные смеси (каспазный-3,7 буфер и компоненты с клетками в 96-многолуночных планшетах) инкубировали в течение 2 ч и 3 ч при 37 oC, соответственно. Затем активность каспазы-3/7 измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов Infinite M200 Pro (Tecan, Австрия) с длинами волн возбуждения и испускания 346 и 438 нм соответственно.

4.10. Статистический анализ

Опыты проводили в трех повторностях и повторяли через три-пять (n {{0}}-5) независимых дней. Все данные выражены как среднее ± SEM. Значения для всех измеренных переменных выражены как средние ± SEM, которые были рассчитаны с использованием Prism 8.4.3 (программное обеспечение GraphPad, Ла-Хойя, Калифорния, США), которое также использовалось для получения рисунков. Статистический анализ проводили с помощью пакета программ PAST (ver. 1.97) [85]. Для эксперимента по дифференцированию использовали t-критерий Стьюдента. Остальные эксперименты оценивали с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса с апостериорным критерием Манна-Уитни с последовательной коррекцией Бонферрони. Значение p < 0,05="" считалось="">

Дополнительные материалы: исходные изображения доступны в Интернете.

Вклады авторов: Вклады авторов заключались в следующем: исследование, методология, проверка, анализ данных, GG, CWD и JG; написание - первоначальная черновая подготовка GG, CWD и MS; курирование данных, получение финансирования, надзор, написание - обзор и редактирование, CWD, MS и PK. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование: Эта работа частично финансировалась за счет грантов Агентства внутренних грантов Университета Палацкого в Оломоуце, Чешская Республика (IGA{{0}}PrF_2020_021), Чешского агентства грантов ({{ 2}}S) и Европейского фонда регионального развития — проект ENOCH (№ CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) и студенческий грант Фонда пожертвований Университета Палацкого.

Заявление Институционального контрольного совета: неприменимо.

Заявление об информированном согласии: неприменимо.

Заявление о доступности данных: данные содержатся в статье или дополнительных материалах.

Благодарности: Авторы благодарят Диту Йордовд, Яну Хрубешовд и Люси Копликовд за отличную техническую помощь. Кроме того, авторы благодарят Sees-editing Ltd., Великобритания, за редактирование рукописи на английском языке.

Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Доступность образцов: образцы соединений не доступны у авторов.