Часть 1 Хроническая болезнь почек и старение по-разному уменьшают костный материал и микроархитектуру у мышей C57Bl/6

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Хроническая болезнь почек и старение по-разному уменьшают костный материал и микроархитектуру у мышей C57Bl/6.

Челси М. Хеверан1, Чарльз Шурман2,*, Клэр Асеведо3, Эрик В. Ливингстон4, Даниэль Хоу5, Эрик Г. Шайбл6, Хизер Хант7, Адам Рауфф8, Ив Доннелли7,#, Р. Дана Карпентер9, Моше Леви10, Энтони Лау5, Тед Бейтман4 , Тамара Аллистон2,*, Карен Б. Кинг11, Вирджиния Л. Фергюсон1

1Кафедра машиностроения, Колорадский университет, Боулдер, Колорадо

2Кафедра ортопедической хирургии, Калифорнийский университет, Сан-Франциско, Калифорния

3Кафедра машиностроения, Университет штата Юта, Солт-Лейк-Сити, Юта

4Кафедра биомедицинской инженерии, Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, Северная Каролина

5Кафедра биомедицинской инженерии, Колледж Нью-Джерси, Юинг, Нью-Джерси

6 Усовершенствованный источник света, Национальная лаборатория Лоуренса Беркли, Беркли, Калифорния.

7Кафедра материаловедения и инженерии, Корнельский университет, Итака, Нью-Йорк

8Кафедра биоинженерии, Колорадский университет, Денвер, Колорадо

9Кафедра машиностроения, Колорадский университет, Денвер, Колорадо

10 Кафедра биохимии, молекулярной и клеточной биологии, Джорджтаунский университет, Вашингтон, округ Колумбия

11Кафедра ортопедии, Медицинский факультет Университета Колорадо, Аврора, Колорадо * Калифорнийский университет в Беркли – Программа для выпускников Калифорнийского университета в Сан-Франциско по биоинженерии, Сан-Франциско, Калифорния

# Исследовательский отдел, Госпиталь специальной хирургии, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк

Цистанхе может помочь при заболеваниях почек

Абстрактный

Хроническая болезнь почек (ХБП) является распространенным заболеванием старения и увеличивает риск переломов только в пожилом возрасте. Старение и ХБП по-разному ухудшают метаболизм и минерализацию костной ткани. Таким образом, мы предполагаем, что потеря качества кости будет наибольшей при сочетании пожилого возраста и ХБП. Мы оценили костную ткань молодых взрослых (6 мес.), среднего возраста (18 мес.) и старых (24 мес.) самцов мышей C57Bl/6 через три месяца после 5/6-й нефрэктомии, чтобы вызвать ХБП, или симуляционных процедур. ХБП усугубляет потерю кортикальной и трабекулярной микроархитектоники, связанную со старением. Старение и ХБП приводили к более тонкой, более пористой коре и меньшему количеству и более тонким трабекулам. Качество костного материала также снижалось при ХБП, и эти изменения костного материала отличались от возрастных. Старение снижает прочность и модуль прочности на изгиб всей кости, микрометровый модуль наноиндентирования и нанометровую деформацию тканей и коллагена (малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS)). Напротив, при ХБП работа сводилась к переломам и изменениям модуля и состава костной ткани (спектроскопия комбинационного рассеяния), а также увеличивалась процентная деформация коллагена. Повышенная деформационная нагрузка коллагена была связана с потерей прочности при ХБП. Кроме того, лакуны остеоцитов становились меньше, реже и более беспорядочными с возрастом у мышей Sham, однако эти возрастные изменения четко не наблюдались при ХБП. Однако при ХБП более крупные лакуны положительно коррелировали с повышенным уровнем фосфатов в сыворотке, что позволяет предположить, что остеоциты играют роль в системном минеральном гомеостазе. Эта работа демонстрирует, что ХБП снижает качество кости, включая микроархитектонику и свойства костного материала, и что потеря качества кости с возрастом усугубляется ХБП. Эти результаты могут помочь понять, почему костная масса не всегда предсказывает переломы у пациентов с ХБП, а также почему пожилые люди с ХБП подвержены высокому риску хрупкости.

Ключевые слова: ХБП; старение; качество костей; хрупкость костей; коллаген

1. Введение

Хроническая болезнь почек (ХБП) затрагивает примерно 23–36 процентов пожилого населения и связана с повышенным риском переломов и связанной с ними смертности (1,2). Хотя потеря костной массы (измеряемая с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии) предсказывает будущие переломы на всех стадиях ХБП, пожилые люди с низкой костной массой и ХБП более склонны к переломам по сравнению с людьми с низкой костной массой и здоровыми почками. функция (3). Риск перелома костей, как правило, выше при ХБП по сравнению с эффектами только старения (4,5). Например, в трехлетнем исследовании у лиц в возрасте 40–65 лет с умеренной или терминальной стадией ХБП частота переломов увеличилась в 1,7–5,1 раза по сравнению с контрольной группой того же возраста, в то время как у лиц в возрасте 65 лет и старше ХБП продолжала увеличивать частоту переломов. перелома в 1,8 – 4,3 раза по сравнению с контролем (4).

микроархитектуры трабекулярной кости (10, 13), в то время как другие не сообщают об изменениях по сравнению с контролем (9). Хотя эти исследования различаются по видам и линиям грызунов, методам индукции ХБП и измеренным результатам, эти предыдущие работы предоставляют существенные доказательства того, что ХБП изменяет качество костей.

Остается несколько ключевых вопросов о том, как ухудшается качество кости при ХБП, в какой степени ухудшение качества кости связано с дефектами в минеральной и органической фазах, а также о том, как изменения качества кости влияют на потерю прочности костной ткани. Примечательно, что хотя в нескольких исследованиях были выявлены изменения перекрестных связей коллагена и зрелости тканей (т. е. времени, прошедшего с момента формирования кости) при ХБП, неизвестно, изменяются ли при ХБП наноразмерные взаимодействия коллагеновых волокон во время механической нагрузки и влияют ли эти изменения в наномеханике на весь процесс. - Прочность костей (11, 12). В более широком смысле, пока не сообщалось об оценке изменений качества и механики кости в ответ на ХЗП от наноразмерной до целой кости.

Роль остеоцитов во влиянии на качество кости при ХБП и старении также неясна. Эти клетки ведут себя ненормально, существенно повышая экспрессию FGF23 на ранних стадиях ХБП (7, 14). Остеоциты необходимы для поддержания качества костного материала и для регуляции устойчивости костей к переломам (15–17). Здоровье остеоцитов частично определяется лакунарной морфологией. Лакунарная морфология остеоцитов изменяется, когда остеоциты участвуют в минеральном гомеостазе, например, при лактации (18, 19) и Х-сцепленной гипофосфатемии (20). Лакунарная геометрия также может становиться меньше, реже и более беспорядочной как со старением, так и с неиспользованием (21–23). Изменения лакунарной морфологии остеоцитов при ХБП потенциально могут влиять на деформации костной ткани, структурную целостность и механочувствительность остеоцитов (24). Пока неизвестно, влияет ли ХБП на лакунарную морфологию остеоцитов и может ли такая взаимосвязь меняться с возрастом.

Хотя более распространенные популяции с ХБП включают пожилых людей, комбинированное влияние старения и ХБП на качество кости еще предстоит изучить. Предыдущие работы установили, что старение снижает модуль, прочность и работу кости при изгибе (25), вязкость разрушения (26), микроархитектонику кортикальной и трабекулярной кости (27–29), а также увеличивает содержание минералов и зрелость (30, 31). Эти изменения кости с возрастом вызывают недоумение и происходят в разных масштабах длины, при этом на механику всей кости влияют изменения материала костной ткани, а также ее структуры. На возрастные изменения костного материала и объема кости частично влияет снижение оборота костной ткани (т.е. более высокая зрелость ткани) и отрицательный баланс в многоклеточной единице кости, соответственно (30,32). Такие возрастные изменения контрастируют с аномальным метаболизмом и минерализацией костной ткани, которые часто возникают при ХБП. Потеря микроархитектоники связана с отрицательным балансом, который ожидается при старении и может иметь место при ХБП (9, 10, 13). Тем не менее, зрелость тканей увеличивается с возрастом и снижается в контексте высокообновляемой ХБП. Существуют значительные пробелы в понимании основ хрупкости костей при ХБП, а также того, как старение и ХБП в сочетании снижают качество костей и устойчивость к переломам. Выяснение комбинированного влияния старения и ХБП на качество кости могло бы восполнить эти пробелы в знаниях.

Цель этого исследования заключалась в изучении комбинированного влияния старения и ХБП на качество костей, от шкалы длины нано- до целой кости, в хирургической модели ХБП у стареющих мышей. Мы предположили, что ХБП и старение снижают качество кости, но эти два фактора по-разному и отрицательно влияют на свойства материала костной ткани. Мы также предположили, что комбинированные эффекты старости и ХБП наиболее вредны для качества костей. Чтобы оценить эти гипотезы, мы оценили качество кости, включая кортикальную и трабекулярную микроархитектонику и свойства кортикального костного материала, у молодых взрослых мышей и старых мышей с ХБП, индуцированной 5/6-й нефрэктомией (5/6 Nx) или ложными операциями.

О цистанхе

2. Методы

2.1 Животная модель и подготовка образцов

Самцов мышей C57Bl/6 получали из колонии Национального института старения в возрасте 3, 15 и 21 месяца. Мышей содержали при цикле 12-свет/12-ч темнота, размещали индивидуально в поликарбонатных клетках со стандартной подстилкой, кормили кормом Harlan Teklad 2920X и давали свободный доступ к воде. Для каждого из трех возрастов мышей случайным образом распределяли в группы CKD или Sham. В группе ХБП выполнена двухэтапная нефрэктомия. Эти процедуры были описаны ранее (33). Вкратце, доступ к левой почке осуществляли через срединный разрез, декапсулировали, чтобы избежать повреждения мочеточника и надпочечников, а затем удаляли. Через неделю правая почка была декапсулирована, а верхний и нижний полюса частично резецированы, чтобы добиться уменьшения объема почки на 2/3. Контрольная группа получила симуляционные процедуры (т.е. срединный разрез без повреждения почек) в те же сроки. Мышей анестезировали 1,5-процентным изофлураном во время процедур. После этих процедур и до выздоровления, а также каждые 12 часов в течение следующих двух дней вводили послеоперационную дозу бупренорфина (0,5 мг/кг). Мышей подвергали эвтаназии через три месяца с помощью CO2 и смещения шейных позвонков. В конечной точке исследования мышей было 6 (молодые взрослые; имитация: n=6, ХБП: n=7), 18 (средний возраст; имитация: n=8; ХБП: n { {25}}) и 24 (старые; симуляция: n=8; ХБП: n=8) месяцев. Все процедуры с животными были одобрены Институциональным комитетом по использованию и уходу за животными Университета Колорадо в Денвере.

Левое бедро, большеберцовая кость, плечевая, лучевая и локтевая кости были зарезервированы для анализа качества костей. Левая большеберцовая кость была консервирована в 70-процентном этаноле при 4°С. Все остальные кости были обернуты марлей, смоченной фосфатом, и хранились при температуре -20°С до анализа.

2.2 Химический анализ сыворотки и мочи

Биохимический анализ сыворотки крови и мочи, собранных в конечной точке исследования, выполняли. Мочевину в сыворотке и моче, а также концентрацию фосфата, кальция и паратгормона в сыворотке измеряли в соответствии с указаниями производителя (BioAssays Systems и Immunotropics соответственно).

2.3 микроКТ

Микроархитектонику оценивали для кортикальной кости средней части бедра и трабекулярной кости проксимального отдела большеберцовой кости с использованием микроКТ для всех исследуемых мышей (μCT, Scanco 80, Scanco AG, Бассердорф, Швейцария). Перед сканированием бедра размораживали в течение ночи при 4°С. Сканирование было выполнено с размером вокселя 10 мкм в соответствии с методами сбора и анализа, описанными ранее (10). Кортикальные параметры включали объем кости/общий объем (BV/TV), площадь кости/общую площадь (BA/TA), пористость коры (Ct. Po), толщину коры (Ct. Th), общую минеральную плотность (TMD), момент инерции относительно медиально-латеральной оси (IML), расстояние между центром тяжести и поверхностью кости в передне-заднем направлении (C) и полярный момент инерции (pMOI) (34). Трабекулярные параметры включали трабекулярное число (Tb.N), трабекулярное расстояние (Tb.Sp), толщину трабекулы (Tb.Th), объем кости (BV), общий объем (TV), объем кости/общий объем (BV/TV), объемная минеральная плотность кости (vBMD) и плотность связности (Conn.D). После микроКТ бедренные кости снова заворачивали в смоченную фосфатом марлю и хранили при температуре -20°C для последующей механической характеристики всей кости.

2.4 Механические свойства цельной кости и материала

После микроКТ левые бедра подверглись трехточечному изгибу (система тестирования материалов Insight II, тензодатчик 250 Н, MTS Systems Corporation, Eden Prairie MN). Бедренные кости извлекали из марли, смоченной в фосфатно-солевом буфере, и испытывали на прочность при скорости отклонения 5 мм/мин на специальной наковальне с размахом 8 мм. Кривые нагрузка-перемещение были проанализированы для механических свойств, включая жесткость, максимальную нагрузку, смещение при максимальной нагрузке, энергию при максимальной нагрузке, нагрузку при текучести, смещение при текучести, энергию при текучести, смещение после текучести, нагрузку при разрушении, смещение при разрушении, и энергия разрушения. Точка текучести определялась как пересечение секущей, проведенной с 10-процентным уменьшением наклона от начальной касательной жесткости и кривой нагрузки-перемещения. Используя IML и C из µCT, мы оценили свойства материала, включая модуль изгиба, предел текучести, предельное напряжение и ударную вязкость, исходя из данных трехточечного изгиба с использованием стандартных уравнений изгиба балки применительно к бедренной кости мыши (35).

2.5 Анализ методом конечных элементов жесткости проксимального отдела большеберцовой кости

Для исследования механического поведения кости использовалось компьютерное моделирование методом конечных элементов (КЭ) для имитации осевого сжатия проксимального отдела большеберцовой кости в каждой модели. Проксимальная часть большеберцовой кости была выбрана потому, что большеберцовая кость является несущей структурой у мышей и является обычным местом анализа свойств кости с помощью микроКТ. Данные микроКТ-изображения проксимального отдела большеберцовой кости (кортикальной и трабекулярной кости) были экспортированы в виде 16-битовых срезов изображений DICOM для дальнейшей сегментации и построения моделей конечных элементов для конкретного объекта. Данные изображений DICOM были импортированы в пакет Mimics Innovation Suite 18 (Materialise, Leuven, Бельгия) для обработки и сегментации изображений для создания соответствующей модели КЭ для той же проксимальной области большеберцовой кости, проанализированной с помощью микроКТ. Костная ткань была отделена от других тканей на изображении с использованием порога сегментации 313 мг/см3 (36,37). После того, как костная область была сегментирована, была экспортирована специфическая для субъекта сетка КЭ, которая содержала как кортикальные, так и трабекулярные компартменты. В модели КЭ использовалась шестигранная сетка КЭ с изотропным размером элемента 10 мкм.

Сетки КЭ, экспортированные из Mimics, были импортированы в ABAQUS CAE 6.9 для назначения свойств материала, применения граничных условий и моделирования осевой механической нагрузки. Свойства материала кости были заданы как однородные, изотропные и линейно-упругие (модуль Юнга, E= 10 ГПа и коэффициент Пуассона, v= 0.3). Для имитации осевого сжатия к узлам на нижней поверхности кости применялось фиксированное граничное условие, а к узлам на верхняя поверхность кости. Структурную жесткость кости рассчитывали как силу реакции (Н) на приложенное смещение.

2.6. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

Деформация коллагеновых фибрилл во время теста на одноосное растяжение комбинированных локтевых и лучевых костей измерялась с помощью синхротронного малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) на линии луча 7.3.3 в Advanced Light Source (LBNL, Berkeley, CA) (38). Кости закрепляли клеем и наждачной бумагой между зажимами на их дистальном и проксимальном концах. Испытания на растяжение на месте проводились на стенде для испытаний на растяжение TST350 (Linkam Scientific Inc.) на гидратированных образцах при скорости смещения 2,5 мкм/с. Во время тестирования костный диафиз подвергался воздействию рентгеновского излучения с энергией 10 кэВ в течение 0,1 с каждые 5 с. Суммарная радиация была ограничена 30 кГр, чтобы смягчить любое влияние облучения на механические характеристики (39). D-интервал коллагена, представляющий повторяющиеся участки разрыва внутри суперструктуры коллагена, проявляется в виде заметного пика дифракции Брэгга на картине SAXS. Специфическую для коллагена деформацию во время испытания на растяжение измеряли путем отслеживания сдвига положения пика Брэгга при увеличении нагрузки. Используя пользовательскую программу LabVIEW, это прогрессивное изменение картины рассеяния было преобразовано в деформацию коллагеновых фибрилл путем нормализации к d-расстоянию при нулевых нагрузках, как обсуждалось ранее (40). Тканевое напряжение рассчитывали по силам, зарегистрированным на этапе тестирования, деленным на измерения площади поперечного сечения тестируемых костей. Суммарные площади поперечного сечения локтевой и лучевой костей были измерены от середины длины локтевой кости с использованием светлопольной рефлективной визуализации (Leica DM, объектив 20x) и количественно оценены с помощью ImageJ (41). Штаммы цельной костной ткани были получены с помощью специального пакета MATLAB для цифровой корреляции изображений (DIC), который отслеживал и измерял расстояния между сеткой точек, наложенных на образец кости на протяжении всего тестирования. Полученные DIC штаммы были объединены с напряжениями на уровне ткани для получения стандартных кривых напряжение-деформация. Из этих кривых был извлечен линейный модуль упругости, а также предел текучести и деформация текучести, определенные смещением точки текучести на 0,2%. Деформация ткани была сопоставлена ​​по времени с деформациями коллагена из SAXS при пределе текучести и максимальном напряжении, чтобы произвести сравнение компонентов, несущих нагрузку, с костью во время деформации.

Контролируемый анализ композита локтевая/лучевая кость во время испытания на растяжение был выполнен путем сопоставления деформации на уровне ткани по изображениям с цифровой камеры с деформациями, рассчитанными по картинам рассеяния рентгеновских лучей. Цифровые видео были независимо просмотрены двумя обученными наблюдателями на предмет перелома и смещения тканей (например, смещения между локтевой и лучевой костями). Затем эти события были сопоставлены по времени с кривыми деформации, и все данные напряжения-деформации были усечены до первого разрыва. При анализе учитывались только данные до первого перелома. Образцы исключали, если имело место проскальзывание между натяжными захватами и костями, или если до первого перелома имело место проскальзывание между лучевой костью. Образцы также были исключены, если было плохое соответствие между кривыми деформации ткани и SAXS, что указывает на то, что пятно луча было сфокусировано на локтевой кости, но большая часть деформации была передана на лучевую кость.

2.7 Оценка микромасштабного состава и модуля костной ткани в соответствии с сайтом

После трехточечного изгиба бедренные кости были гистологически обезвожены в градуированной серии этанола, очищены в ацетоне и заключены в ПММА. Закладные кости разрезали в средней части бедренной кости с помощью низкоскоростной алмазной пилы (Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Образцы шлифовали влажной карбидокремниевой бумагой (60{{10}} и зернистостью 1200), а затем полировали пастами из оксида алюминия (9, 5, 3, 1, 0,1, 0,05 мкм). и ткани из вискозы (South Bay Technologies, Сан-Клементе, Калифорния) до окончательной шероховатости 0,05 мкм. Образцы обрабатывались ультразвуком между каждым этапом полировки.

Спектроскопия комбинационного рассеяния была выполнена на картах, охватывающих толщину коры, с помощью специальной системы: системы конфокальной микроскопии Renishaw inVia (Renishaw, Wotton-under-Edge, Gloucestershire, UK) с использованием лазерного излучения с длиной волны 785 нм, которое направлялось через оптоволоконные кабели к 5 { {4}}x объектив (числовая апертура 0,75), установленный на Z-столике наноиндентора (TI 950, Hysitron, Миннеаполис, Миннесота). Для каждого местоположения было собрано 10 накоплений 10-секундных экспозиций. Ряды из трех отпечатков, отстоящих друг от друга на 15 мкм, проходят через каждые 10 мкм через толщину коры.

Базовая линия флуоресценции была вычтена с помощью полинома 11-го порядка, а космические лучи были удалены с помощью программного обеспечения Renishaw WIRE. Эталонный спектр ПММА был вычтен из каждой точки с использованием пользовательского кода MATLAB. Затем эти скорректированные спектры анализировали на содержание пролина (855 см-1), ν1-фосфата (961 см-1) и ν1-карбоната (1071 см-1). Затем были рассчитаны соотношения площадей для минерал: матрица (фосфат: пролин),

карбонат: фосфат и кристалличность (обратно полуширине при полной максимальной высоте фосфатного пика v1).

Затем выполняли наноиндентирование в местах, совпадающих с участками, оцениваемыми с помощью рамановской спектроскопии. Сферический наконечник диаметром 5 мкм вдавливал кость со скоростью 30 нм/с до достижения максимальной глубины 500 нм. Эта глубина поддерживалась в течение 120 с для рассеивания вязкоупругой энергии. Приведенный модуль (Er) был рассчитан с использованием анализа Оливера-Фарра с учетом первых 45 процентов кривой разгрузки (42,43).

2.8 Высокоэффективная жидкостная хроматография

Плечевую кость рассекали от всех мягких тканей, костный мозг удаляли водой. Плечи были C, а затем центрифугированы для выпаривания избытка HCl. Отфильтрованные образцы разбавляли 1:5 в 10 ацетонитриле и 0.05 % гептафтормасляной кислоте (HFBA), загружали в обращенно-фазовый Gemini-NX C{{7} } (Phenomenex, Torrance, CA) и анализировали перекрестные связи гидроксилизилпиридинолина (HP), лизилпиридинолина (LP) и пентозидина в соответствии с методами, описанными Bank et al (44). Детали системы ВЭЖХ (модель 126, Beckman-Coulter, Fullerton, CA) подробно описаны в Oren et al (45). Разделение сшивок коллагена осуществлялось по следующему протоколу: 15 мин. растворителя, содержащего 24% метанола и 0,15% HFBA, 10 мин. растворителя, содержащего 40% метанола и 0,05% ГФБК, и 10 мин. растворителя, содержащего 75 процентов ацетонитрила и 0,1 процента HFBA. Колонку уравновешивали 24-процентным метанолом и 0,15-процентным раствором HFBA в течение не менее 10 минут. между запусками проб. Пики сшивания коллагена измеряли с помощью флуоресцентного детектора (FP1520, JASCO; Easton, ML). Длины волн возбуждения и испускания составляли 295 нм и 400 нм соответственно для HP и LP. Пентозидин был обнаружен с возбуждением 328 нм и эмиссией 378 нм. Калибровочные кривые были построены на основе измеренных интенсивностей пяти разведений калибратора, содержащего очищенные HP и LP (Quidel Corporation) и пентозидин (L. Sayre, Case Western Reserve University, Cleveland, OH).

Концентрации поперечных связей затем нормализовали к концентрации коллагена. Коллаген оценивали по концентрации гидроксипролина в образце, проанализированном на наличие поперечных связей. Аликвоту образца, проанализированного на перекрестные связи, разбавляли 1:50 и дериватизировали 9-фторонилметилхлорформиатом (46). Для аминокислотного протокола использовали следующие растворы (1) 20 мМ лимонной кислоты, 5 мМ хлорида тетраметиламмония и 0,01% азида натрия, pH 2,85; (2) 20 мМ ацетата натрия, 5 мМ хлорида тетраметиламмония и 0,01% азида натрия, pH 4,5, и (3) 100% ацетонитрила. Профиль градиентного элюирования следующий: от 0 до 11,5 мин. градиент от 75 процентов (1)/25 процентов (3) до 60 процентов (1)/40 процентов (3) через 13 мин. переключиться на 64 процента (2) / 36 процентов (1), с 13,1 до 18 мин. градиент от 64% (2)/36% (3) до 62% (2)/38% (3), затем через 18 мин. переключение на 25 процентов (2)/75 процентов (3) до конца цикла через 23 мин. Колонку уравновешивали при 75 процентах (1)/25 процентах (3) в течение по меньшей мере 10 минут. между запусками проб. Пики аминокислот контролировали при возбуждении 254 нм и испускании 630 нм. Калибровочную кривую строили из пяти разведений аминокислотного стандарта, приготовленного из гидролизата коллагена (Sigma-Aldrich #A9531, Сент-Луис, Миссури). Коллаген имеет постоянную концентрацию гидроксипролина, поэтому концентрация гидроксипролина была преобразована в концентрацию коллагена (285 моль гидроксипролина на моль коллагена).

2.9 Измерение флуоресцентных AGE

Флуоресцентные КПГ в каждом образце определяли флуорометрическим анализом, который сравнивает общую эндогенную флуоресценцию костной ткани со стандартом хинина. Аликвоту гидролизованной кости, ресуспендированной во внутреннем стандарте для ВЭЖХ, разбавляли деионизированной водой до концентрации 1,6 мкг кости/мл раствора. Флуоресценцию разбавленного гидролизата и серийно разведенного исходного раствора хинина (исходный раствор: 10 мкг хинина/мл 0,1 N H2SO4) измеряли в 96-луночном планшете (продукт № 3370, Corning) с использованием многорежимный считыватель микропланшетов (Synergy H1, BioTek) при возбуждении 360 нм и эмиссии 460 нм.

Объемные флуоресцентные КПГ нормализовали по содержанию коллагена в костной ткани с использованием колориметрического анализа гидроксипролина. Вкратце, гидролизат дополнительно разбавляли до мк/ед исходного раствора гидроксипролина (200 мкг L-гидроксипролина/мл 0,001 н. HCl). К разбавленному гидролизату добавляли хлорамин-Т для инициирования реакции и инкубировали растворы в течение 20 мин. при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 3,15 М хлорной кислоты и через 5- мин. инкубации при комнатной температуре добавляли п-диметиламинобензальдегид. Далее раствор инкубировали на водяной бане при температуре 60 градусов в течение 20 мин, затем охлаждали в холодной воде в темноте до комнатной температуры. Поглощение образцов и стандартов измеряли при длине волны 570 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов. Флуоресцентные AGE представлены в единицах нг флуоресценции хинина/мг коллагена.

2.10 3D лакунарная геометрия остеоцитов

Левая большеберцовая кость была гистологически обезвожена в градуированной серии этанола и окрашена 1-процентным основным фуксином (47). Затем голени очищали ацетоном и заливали поли(метил)метакрилатом (ПММА). Залитые образцы разрезали в поперечном направлении на 1 мм проксимальнее соединения большеберцовой и малоберцовой костей с помощью низкоскоростной пилы (Buehler Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Наземный срез был приготовлен из дистального среза с заданной толщиной 200 мкм (Exakt 400 CS, Exakt Technologies Inc, Оклахома-Сити, Оклахома).

Изображение наземных срезов выполняли в режиме пропускания с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 710 с возбуждением 555 нм, полосовым фильтром 568–1000 нм и иммерсионным объективом 40x. Разрешение по осям x, y и z составило 0,447 и 0,493 мкм соответственно. Вертикальные z-стеки были получены через видимый диапазон лакун остеоцитов (глубина изображения 50–100 мкм). Трехмерные изображения лакун остеоцитов были построены и проанализированы на предмет лакунарной геометрии с использованием программы 3D Osteocyte Lacunae Analysis с открытым исходным кодом и MATLAB v17 (21). ). Вкратце, каждое 2D-изображение в z-стеке автоматически сегментировалось для определения пробелов, которые затем реконструировались в 3D. На основе наиболее подходящих эллипсоидов лакуны анализировались по объему, площади поверхности, ближайшему центру масс, сферичности (отношение наименьшего к наибольшему радиусу лакуны, где 1=сфера), охвату тета (абсолютное значение разности Трехмерный вектор, описывающий направление большой оси от среднего направления всех лакун), сплющенность (-1=идеально вытянутая, 1=идеально сплющенная) и числовая плотность лакун (количество остеоцитов/объем изображения).

2.11 Анализ данных

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Для каждого массива из рамановской спектроскопии и наноиндентирования усреднялись так, чтобы каждая кость имела одно значение для каждой микромасштабной меры. Аналогичным образом для каждого массива рассчитывали стандартное отклонение для оценки пространственной изменчивости костной ткани на микроуровне. Эффекты старения и ХБП, а также их взаимодействие были проверены с помощью двухфакторного дисперсионного анализа для всех параметров. Зависимые переменные преобразовывались, если это было необходимо, чтобы удовлетворить предположения об остаточной нормальности и гомоскедастичности. Значимость основных эффектов была установлена ​​априори как p < 0.05.="" в="" случае="" значительного="" взаимодействия="" между="" возрастом="" и="" хбп="" было="" проведено="" апостериорное="" тестирование="" для="" проверки="" влияния="" хбп="" в="" каждом="" возрасте.="" семейная="" ошибка="" контролировалась="" для="" этих="" апостериорных="" анализов="" с="" использованием="" скорректированного="" по="" бонферрони="" альфа,="" что="" привело="" к="" критической="" альфа="" 0.05="" 3="0.017." результаты,="" в="" которых="" сравнения="" простых="" эффектов="" имели="" p-значения="" от="" 0,017="" до="" 0,05,="" были="" интерпретированы="" как="">

Была проведена линейная регрессия, чтобы проверить, предсказывают ли измерения качества кости нано-микромасштаба механическую прочность всей кости. Поскольку механические свойства цельной кости сильно зависят от возраста, эта линейная регрессия включала возраст как ковариант. Корреляции Спирмена также оценивались для лакунарной геометрии остеоцитов и показателей биохимического анализа сыворотки и мочи, а также для ПТГ и показателей микромасштабного качества кости. Значимость линейных регрессий и корреляций была установлена ​​на уровне p < 0,05.="" для="" всех="" анализов="" использовали="" minitab="">

Выбросы были идентифицированы с помощью теста Граббса (уровень значимости=0.05). Несколько выбросов были исключены из анализа сывороточного кальция и мочевины. Выбросы для 24-месяцев симуляции и ХБП были исключены из всех анализов микроархитектоники коры и трабекул, а также анализа FEA. Один выброс был исключен из группы с 24-месяцем CKD для анализа LP, а один выброс был исключен из группы с имитацией 24-месяца по показателям прочности, работы до разрушения и смещения после предела текучести. Один отдельный 24-месячный выброс Sham был обнаружен для стандартного отклонения модуля наноиндентирования и стандартного отклонения кристалличности.