Часть 1: Фенилэтаноидные гликозиды Cistanche Tubulosa индуцируют апоптоз клеток гепатоцеллюлярной карциномы и усиливают противоопухолевый эффект
Mar 25, 2022
Контактное лицо: ali.ma@wecistanche.com
Пэнфэй Юань, BSc1, Чаншуан Фу, MSc1, И Ян, PhD1, Айпире Адила, PhD1, Фанфан Чжоу, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1, и Цзиньяо Ли, PhD1
Абстрактный
Цистанхе трубчатыеa представляет собой тип китайской фитотерапии и оказывает различные биологические функции. Предыдущие исследования показали, чтоЦистанхе тубулоза фенилэтаноидные гликозиды(CTPG) проявляют противоопухолевое действие на различные опухолевые клетки. Однако противоопухолевое действие CTPG на клетки гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) HepG2 и BEL-7404 все еще неясно. Наше исследование показало, что CTPG значительно ингибирует рост клеток HepG2 и BEL-7404 за счет индукции остановки клеточного цикла и апоптоза, что связано с активацией путей MAPK, характеризующихся повышением фосфорилирования p38, JNK, и ERK1/2 и митохондриально-зависимый путь, характеризующийся снижением митохондриального мембранного потенциала. Высвобождение цитохрома с и расщепление каспаз -3, -7, -9 и PARP впоследствии увеличивались при обработке CTPG. Кроме того, CTPG значительно подавлял миграцию HepG2 за счет снижения уровня матриксной металлопротеиназы-2 и факторов роста эндотелия сосудов. Интересно, что CTPG не только усиливал пролиферацию спленоцитов, но также уменьшал апоптоз спленоцитов, индуцированный цисплатином. В мышиной модели опухоли H22 CTPG в сочетании с цисплатином дополнительно ингибировал рост клеток H22 и уменьшал побочные эффекты цисплатина. Взятые вместе, CTPG подавляли рост HCC за счет прямого противоопухолевого эффекта и непрямого иммуностимулирующего эффекта, а также улучшали противоопухолевую эффективность цисплатина.
Ключевые словаCistanche tubulosa фенилэтаноидные гликозиды, апоптоз, МАРК-путь, митохондриально-зависимый путь, цисплатин, иммуностимулирование
Цистанхе обладает противоопухолевым действием.
Нажмите, чтобы перейти к продуктам Cistanche и Cistanches
Введение
Прогнозируется, что рак печени будет шестым наиболее часто диагностируемым раком и четвертой по значимости причиной смерти от рака в мире в 2018 г., при этом в Юго-Восточной Азии (Монголия, Камбоджа и Вьетнам) ежегодно регистрируется около 841 000 новых случаев и 782 000 смертей. .1 В Китае в 2015 году рак печени был третьей ведущей причиной смерти от рака.2 Более 90 процентов первичных случаев рака печени приходится на гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК) во всем мире. В настоящее время гепатэктомия, трансплантация печени и чрескожная абляция являются основными методами лечения ГЦК. К сожалению, эти методы лечения эффективны у 30% пациентов с диагностированным ранним раком печени, в то время как пациенты с поздним раком печени (составляющие 40%) вынуждены полагаться на паллиативное лечение для увеличения времени выживания.3,4 Сорафениб в сочетании с препаратами для печени артериальная химиоэмболия является важной и распространенной паллиативной терапией для большинства пациентов с распространенным ГЦК в Азиатско-Тихоокеанском регионе.5 Сорафениб, одобренный FDA в 2006 г. продукции и способствует апоптозу опухолевых клеток. Сорафениб значительно увеличивает продолжительность жизни пациентов на 3–5 месяцев, но имеет серьезные побочные эффекты и тесно связан с возникновением лекарственной устойчивости.6 Поэтому необходимо срочно разработать новые препараты или стратегии лечения ГЦК.
Традиционная китайская медицина (ТКМ) отдельно или в сочетании с другими стратегиями использовалась для лечения ГЦК и продемонстрировала клинические преимущества, включая увеличение продолжительности жизни, улучшение качества жизни, уменьшение побочных реакций и т. д.7,8.Цистанхепредставляет собой ТКМ, содержащую фенилэтаноидные гликозиды (PhG), иридоиды, лигнин и полисахариды, которые обладают различными биологическими функциями, такими как антиоксидантная, противовоспалительная, антивозрастная, улучшающая память и повышающая иммунитет функция.9 PhG рассматривались как основные активные компоненты цистанхе и выполняют множество функций, включая антиоксидантную, противовоспалительную, антиапоптозную, гепатозащитную и нейрозащитную.10-12 Наша группа сообщила, чтоЦистанхеTubulosa фенилэтаноидные гликозиды(CTPG) может ингибировать рост клеток меланомы B{0}}F10, клеток карциномы пищевода Eca-109 и клеток HCC H22 посредством внешних или внутренних сигнальных путей in vitro или in vivo; кроме того, CTPG оказывает иммуностимулирующее действие.13-15
В этом исследовании мы исследовали противоопухолевый эффект и механизм CTPG на клетках HepG2 и BEL-7404 in vitro, проанализировали иммуномодулирующую функцию CTPG in vitro и in vivo, а также оценили терапевтический эффект CTPG в сочетании с химиотерапией. препарат цисплатин на мышах с опухолью HCC H22 in vivo. Мы обнаружили, что CTPG может ингибировать рост клеток HepG2 и BEL-7404 посредством митохондриально-зависимого апоптоза и сигнального пути MAPK. CTPG значительно ингибировал миграцию клеток HepG2 за счет снижения уровней матриксной металлопротеиназы-2 (MMP-2) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Кроме того, CTPG способствовал пролиферации и активации иммунных клеток и повышал иммунитет мышей. Важно отметить, что CTPG в сочетании с цисплатином может дополнительно ингибировать рост клеток H22 in vivo и уменьшать побочные эффекты цисплатина.
Цистанхе повышает иммунитет.
Материалы и методы
Животные
Самцы мышей BALB/c, Kunming в возрасте от 6 до 8 недель и самки мышей C57BL/6 были приобретены в Лабораторном центре животных Синьцзянского медицинского университета (Урумчи, Синьцзян, Китай) и помещены в виварии Синьцзянского университета при комнатной температуре. (RT) 25±3 градуса и световой день 12/12 часов.
Клеточные линии и клеточная культура
Мышиные клетки H22 были приобретены у Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Ухань, провинция Хубэй, Китай), а человеческие клетки HCC HepG2 и BEL-7404 были получены из Синьцзянской ключевой лаборатории биологических ресурсов и генной инженерии, Синьцзянского университета (Урумчи, Синьцзян, Китай) и культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco, США) или среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Gibco), содержащей 10 % инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (MRC, Китай), 1 % L- глутамин (100 мМ), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 градусах во влажной атмосфере с 5% СО2.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
Основные соединения CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Шанхай, Китай) были квалифицированы и количественно определены с помощью ВЭЖХ, как сообщалось ранее.13 Использовали колонку ZORBAX SB-C18 (250×4,6 мм; 5 мкм). а подвижная фаза состояла из 0,2% раствора муравьиной кислоты и метанола с градиентом от 23% до 31%. Всего было введено 10 мкл образца, который был обнаружен при длине волны 330 нм. Стандарты эхинакозида и актеозида (Юанье, Шанхай, Китай) использовали для анализа компонентов CTPG.
эхинакозид
Анализ жизнеспособности клеток
Противоопухолевое действие CTPG на клетки HepG2 и BEL-7404 оценивали с использованием МТТ (3-(4, 5-диметил-2-тиазолил)-2, {{7 }}дифенил-2-H-тетразолия бромид). Клетки HepG2 и BEL-7404 высевали в 96-луночные планшеты (5 × 104 клеток/лунку) и обрабатывали 0, 200, 400 и 600 мкг/мл CTPG в течение 24 и 48 часов соответственно после 24 часов инкубации при 37°С. Около 35 мкг/мл цисплатина (Yuanye) использовали в качестве положительного контроля. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл МТТ (0,5 мг/мл, разбавленный средой без среды FBS) и культивировали в течение 3 часов при 37°С и 5% СО2. После инкубации планшеты центрифугировали при 1200 об/мин в течение 7 минут, удаляли среду и в каждую лунку добавляли 200 мкг/мл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Значения OD490 измеряли с помощью 96-луночного считывателя микропланшетов (Bio-Rad Laboratories, Калифорния, США). Чтобы оценить влияние CTPG на спленоциты, клетки выделяли у мышей C57BL/6 и высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 105 клеток/лунку. Спленоциты обрабатывали 0, 200, 400 и 600 мкг/мл в течение 24, 48 и 72 часов соответственно. Жизнеспособность клеток рассчитывали по следующей формуле: Жизнеспособность клеток (в процентах)=(ОП обработанных/ОП необработанных) × 100 процентов.
Обнаружение Ки-67
Обнаружение Ki{{0}} проводилось в соответствии с нашим предыдущим исследованием.16 Вкратце, клетки BEL-7404 обрабатывали различными концентрациями (0, 200, 400 и 600 мкг/мл) CTPG. или цисплатин (35 мкг/мл). Через 24 часа клетки собирали и промывали PBS, затем фиксировали и пермеабилизировали с помощью набора буферов для окрашивания Foxp3 (eBioscience, США) в соответствии с инструкциями производителя. Внутриклеточное окрашивание проводили с использованием конъюгированного с FITC антитела Ki-67 (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) в течение 15 минут при комнатной температуре. Образцы анализировали методом проточной цитометрии (BD FACSCalibur, Калифорния, США).
Анализ клеточного апоптоза и клеточного цикла
Клетки HepG2 и BEL-7404 высевали при плотности 2,5×105 клеток/чашку и инкубировали при 37° в течение ночи. Клетки трипсинизировали и собирали центрифугированием после обработки различными концентрациями CTPG или предварительной обработки ингибитором каспазы (Z-VAD-FMK) или ингибитором каспазы-3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Китай) в течение 2 часов до Лечение КТПГ. Через 24 часа с помощью проточной цитометрии был обнаружен апоптоз. Вкратце, собранные клетки промывали холодным PBS (Gibco) и ресуспендировали в буфере для связывания аннексина с 2,5 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл окрашивающего раствора PI-PE (Solarbio, Пекин, Китай), а затем клетки инкубировали при комнатной температуре. в темноте 15 минут. Для анализа распределения клеточного цикла клетки собирали после обработки CTPG и фиксировали в холодном 70-процентном этаноле при 4 градусах в течение 30 минут. Клетки окрашивали PI (BD Biosciences) в темноте в течение 30 минут. Образцы анализировали на проточном цитометре (BD FACSCalibur). Уровни экспрессии клеточного апоптоза и связанных с циклом белков определяли вестерн-блоттингом.
Вестерн-блот
Вестерн-блоттинг проводили в соответствии с нашим предыдущим исследованием. 17 HCC обрабатывали CTPG в течение 24 часов. После двукратной промывки ледяным PBS все прикрепленные и плавающие клетки собирали и лизировали в буфере для лизиса RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) в течение 2{9}}минут на льду. После центрифугирования при 12000 об/мин при 4 градусах в течение 10 минут определяли концентрацию белка с помощью набора для анализа бихинхониновой кислоты (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя. Белки той же концентрации разделяли с помощью 12-процентного SDS-PAGE и переносили на мембраны PVDF. После промывки буфером PBST (PBS с 0,05% Tween-20) мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком при 37°С в течение 1 часа, а затем инкубировали с первичными антителами (Cell Signaling Technology, Массачусетс, США). при правильном разведении в течение ночи при 4 градусах. После 3-кратной промывки PBST мембрану инкубировали с соответствующими HRP-конъюгированными вторичными антителами (eBioscience) в течение 2 часов при 37°С. Белки-мишени выявляли с помощью набора для анализа ECL (Beyotime). Данные сканирования в оттенках серого были получены с помощью Image J.
Анализ потенциала митохондриальной мембраны (Δψm)
Δψm определяли мембранопроницаемым красителем JC-1 (Beyotime). Вкратце, клетки HepG2 и BEL-7404 обрабатывали различными концентрациями CTPG (0, 200, 400 и 600 мкг/мл) в течение 24 часов. Все клетки собирали и промывали промывочным буфером JC-1. Клетки окрашивали флуоресцентным зондом JC-1 согласно инструкции производителя в течение 20 минут при комнатной температуре. После двукратной промывки PBS все образцы анализировали с помощью проточной цитометрии (BD FACSCalibur).
Hoechst 33342 Окрашивание
Окрашивание Hoechst 33342 проводилось в соответствии с нашим предыдущим исследованием.16 Морфологические изменения ядер изучали с использованием проницаемого для мембран ДНК-связывающего красителя Hoechst 33342 (Beyotime). Вкратце, клетки инокулировали в 6-луночный планшет в концентрации 1×105 клеток/лунку в 2 мл среды. При достижении слияния от 70 до 80 процентов клетки обрабатывали 200, 400 и 600 мкг/мл CTPG или цисплатина в течение 24 часов. Клетки промывали PBS и фиксировали 4-процентным ледяным параформальдегидом при 4 градусах в течение 10 минут. После промывки PBS клетки окрашивали Hoechst 33342 при 4 градусах в течение 10 минут. Образцы исследовали с помощью флуоресцентного инвертированного микроскопа (Nikon Eclipse Ti-E, Япония).
экстракт цистанхе
Анализ миграции
Миграция клеток HCC была обнаружена с помощью анализа заживления ран. Вкратце, клетки HepG2 (2×104/лунку) высевали в 24-луночный планшет. После достижения 80 процента слияния центр каждой лунки царапали один раз наконечником пипетки на 20 мкл. После промывки PBS клетки обрабатывали цисплатином (35 мкг/мл) или различными концентрациями (0, 200, 400 и 600 мкг/мл) CTPG при 37°С. Через 24 часа были сделаны снимки каждого образца под микроскопом (Nikon Eclipse Ti-E). Средние расстояния миграции клеток анализировали с помощью изображения J. Процент заживления ран рассчитывали по уравнению: заживление ран (проценты)=(1-площадь царапины в указанный момент времени/площадь царапины в 0 часов)×100 процент . Уровни экспрессии белков, связанных с миграцией клеток, MMP-2 и VEGF определяли вестерн-блоттингом.
Пролиферация и апоптоз спленоцитов
Для анализа пролиферации спленоциты выделяли у 3 мышей C57BL/6 и окрашивали CFSE (eBioscience). Клетки, меченные CFSE, инокулировали в 24-луночные планшеты с плотностью 2 × 106 клеток в 1 мл среды на лунку и обрабатывали различными концентрациями CTPG (200, 400 и 600 мкг/мл) или комбинировали с 35 мкг /мл цисплатина в течение 72 часов. Анализ методом проточной цитометрии выполняли после окрашивания CD3-APC и CD19-PE (BD Biosciences). Для анализа апоптоза спленоциты инокулировали в 24-луночные планшеты с плотностью 2 × 106 клеток в 1 мл среды на лунку и обрабатывали различными концентрациями CTPG (200, 400 и 600 мкг/мл) или комбинировали с цисплатин в течение 24 часов. Анализ методом проточной цитометрии выполняли после окрашивания 2,5 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл раствора PI-PE.
Оценка безопасности и иммуностимулирующая активность CTPG in vivo
Для оценки иммуностимулирующей активности CTPG in vivo самцов мышей Kunming в возрасте от 6 до 8 недель случайным образом делили на 7 групп (5 мышей в группе). Подкожное введение (п/к, 200, 400 мг/кг), внутрибрюшинное введение (в/б, 200, 400 мг/кг) и внутрижелудочное введение (в/ж, 200, 400 мг/кг) применяли каждые 2 дня, всего 7 раз. , в то время как контрольная группа не получала никакого лечения. Мышей взвешивали через день и каждый день наблюдали за состоянием мышей. После обработки CTPG органы мышей отделяли и взвешивали. Индексы органов рассчитывали по формуле: индекс органов=масса органа (мг)/масса тела (г). Спленоциты собирали, подсчитывали и окрашивали анти-CD3-APC, анти-CD19-PE, анти-CD49b FITC или анти-CD4-APC, анти-CD{{ 22}}PE, анти-CD8-FITC (BD Biosciences). Образцы обнаруживали с помощью проточной цитометрии (BD FACSCalibur).
Противоопухолевая эффективность CTPG в сочетании с цисплатином у мышей с опухолью H22 Самцам мышей BALB/c в возрасте от 6 до 8 недель подкожно вводили клетки H22 (1,{7}} × 106 на мышь в 100 мкл PBS). Когда объем опухоли достиг приблизительно 60 мм3, мышей с опухолью случайным образом разделили на 4 группы (6 мышей в группе) и обработали цисплатином (4 мг/кг), CTPG (400 мг/кг), цисплатином (4 мг/кг) плюс CTPG ( 400 мг/кг) или без лечения (контрольная группа) соответственно. Опухолевым мышам внутрибрюшинно вводили CTPG на 5-е, 7-е, 9-е, 11-е и 13-е сутки соответственно. Цисплатин вводили внутривенно на 7-е и 11-е сутки. Объем опухоли и массу тела измеряли через день. Объем опухоли рассчитывали следующим образом: Объем опухоли (V)=a × b2/2, где a и b представляют собой самый длинный и самый короткий диаметры опухоли, измеренные штангенциркулем соответственно. На 20-е сутки выделяли и взвешивали органы и опухоли. Спленоциты собирали, подсчитывали и окрашивали анти-CD3-APC и анти-CD19-PE или анти-CD4-FITC и анти-CD8-APC или анти-CD11b-PE и анти-Gr-1-APC или анти-CD4-FITC, анти-CD25-APC и анти-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Затем частоты и количество клеток анализировали с помощью проточной цитометрии (BD FACSCalibur).
Цистанхе усиливает противоопухолевый эффект и повышает иммунитет.
Для получения дополнительной информации, пожалуйста, нажмите на картинку.
Статистический анализ
Все данные были выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Статистический анализ был проведен с использованием однофакторного/двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения Prism5.0. п<.05 was="" considered="" statistically="">
