Часть 1 Цистанхи облегчают вызванную севофлураном когнитивную дисфункцию, регулируя PPAR- -зависимую антиоксидантную и противовоспалительную активность у крыс

Больше информации обращайтесь:Joanna.jia@wecistanche.com

Цистанхе пустынная имеет много эффектов, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Абстрактный

Это исследование было направлено на изучение защитных эффектов и основных механизмовцистанхена модели стареющей крысы с когнитивной дисфункцией, индуцированной севофлураном. Самцов крыс SD в возрасте (24 месяца) случайным образом распределили на четыре группы: контрольная группа, группа севофлурана, контрольная группа плюс цистанхе и севофлуран плюсцистанхегруппа. Впоследствии уровни воспалительных цитокинов измеряли с помощью ELISA, а когнитивную дисфункцию крыс оценивали с помощью теста водного лабиринта, теста открытого поля и теста условного рефлекса страха. Через три дня после анестезии крыс забивали и собирали гиппокамп для анализа соответствующих биомолекул. Уровень окислительного стресса определяли как концентрацию нитритов и МДА, а также активность СОД и КАТ. Наконец, антагонист PPAR был использован для изучения механизмацистанхев естественных условиях. Результаты показали, что после ингаляции севофлурана у 24-, но не у 3-месячных крыс-самцов SD через 3 дня после анестезии развились явные когнитивные нарушения в поведенческом тесте. Внутрибрюшинная инъекцияцистанхев дозе 50 мг/кг в течение 3 дней подряд перед анестезией ослаблял вызванное севофлураном повышение уровня нейровоспаления и значительно ослаблял гиппокампзависимые нарушения памяти у 24-месячных крыс.Цистанхетакже снижал окислительный стресс за счет снижения содержания нитритов и МДА при одновременном повышении активности СОД и КАТ. Более того, такое лечение также ингибировало активацию микроглии. Кроме того, мы продемонстрировали, что ингибирование PPAR, наоборот, облегчалоцистанхеиндуцированный защитный эффект. В совокупности мы продемонстрировали, что цистанхе может оказывать антиоксидантное, противовоспалительное, антиапоптозное и антиактивирующее действие микроглии на развитие когнитивной дисфункции, вызванной севофлураном, путем активации передачи сигналов PPAR.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

цистанхе, послеоперационная когнитивная дисфункция (ПОКД), PPAR-, севофлуран

ЦистанхеБАДы повышают иммунитет

1|ВВЕДЕНИЕ

Послеоперационная когнитивная дисфункция (ПОКД) является разрушительным осложнением с длительными последствиями и определяется как нарушение памяти, внимания, концентрации и обработки информации, возникающее после операции и анестезии. Исследования показали, что около 10 процентов хирургических пациентов и почти 40 процентов пожилых пациентов в возрасте 65 лет и старше будут страдать ПОКД. У пациентов с ПОКД наблюдается поразительно более высокая смертность, сниженное качество жизни и повышенная зависимость от социального обеспечения по сравнению с больными. те, у кого нет ПОКД.2,3 Хотя в последние десятилетия были предприняты многочисленные исследования, патогенез ПОКД остается в значительной степени неизвестным.

Хорошо известно, что нейровоспаление и окислительный стресс в головном мозге играют решающую роль в возникновении и прогрессировании ПОКД.4,5 Хотя вызванное хирургическим вмешательством воспаление или окислительный стресс могут вызывать нейровоспаление и повреждение головного мозга и в конечном итоге способствовать когнитивному расстройству , недавние сообщения предполагают, что анестетики, используемые во время операции, также способны вызывать когнитивные нарушения.3,6,7

Севофлуран обычно используется в клинической анестезии для пациентов всех возрастов из-за его низкого коэффициента распределения газов крови и низкого метаболического распада.8 Однако несколько линий доказательств показали, что севофлуран может вызывать нейровоспаление и нарушать когнитивную функцию. Например, Макарюс сообщил, что севофлуран оказывает нейротоксическое воздействие на развитие головного мозга. Было показано, что снижение связи между возбуждающими нейронами в префронтальной коре коррелирует с когнитивными нарушениями, вызванными севофлюраном. Регуляция нейровоспаления в модели крыс путем подавления активности PPAR в гиппокампе.1 Как только хирургический метод определен, степень травмы и воспалительной реакции не может быть изменена. Таким образом, уменьшение когнитивных нарушений с точки зрения анестезии может стать возможным подходом.цистанхевидов («Rou Cong Rong» на китайском языке) уже много лет используется в качестве тонизирующего средства в Китае. Современные фармакологические исследования показали, что цистанхи обладают широким спектром лечебных функций, особенно в отношении центральной нервной системы (ЦНС), включая антиапоптозную, антиокислительную, антивозрастную, антиусталостную, иммуномодулирующую, противовоспалительную и нейропротективную функцию.{{5 }} Deng et al. обнаружили, что эхинакозид, одно из основных активных соединений цистанхе, оказывает защитное действие на TNF- -индуцированный апоптоз клеток SH-SY5Y. фенольный гидроксил может служить донором водорода для восстановительных радикалов и, таким образом, поглощать их. Существуют два основных потока, по которымцистанхиочищает от свободных радикалов, а именно непосредственно участвует в удалении свободных радикалов или блокирует их продукцию и регулирует антиоксидантные ферменты, связанные с метаболизмом свободных радикалов in vivo, такие как SOD, CAT и GPX.15 Применение цистанхов способствует замедлению старения фенотипы и облегчение снижения когнитивных функций у мух за счет снижения окислительного стресса.16 Например, Zhang et al. исследовали один из экстрактов цистанха и подтвердили его функцию увеличения продолжительности жизни.17 Однако до настоящего времени ни в одном исследовании не изучалось влияние цистанха на когнитивные функции. дисфункции в моделях животных или людей в условиях севофлурана.

На основании вышеизложенного мы предположили, чтоцистанхиможет ослабить когнитивные нарушения, вызванные севофлураном. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали 24-месячных крыс SD, чтобы получить модель когнитивных нарушений путем вдыхания севофлюрана. Впоследствии мы исследовали фармакологическую функциюцистанхиЭкстракт оказывает противовоспалительное, антиоксидантное и нейрозащитное действие. Также был исследован механизм воздействия цистанхов на когнитивные нарушения, вызванные севофлураном.

2|МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1|Приготовление экстракта Cistanches Herba и стандартизация

Добычацистанхибыло в соответствии с предыдущими работами.18,19 Вкратце,ЦистанхиЭкстракт Herba экстрагировали 95-процентным этанолом в воде и лиофилизировали до порошка. Экстракт в концентрации 10 мг/мл применяли для количественного химического анализа эхинакозида методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Стандартное соединение, эхинакозид, было получено от Haoxuanbio (Сиань, Шэньси, Китай).

2.2|Крысиная модель когнитивной дисфункции, вызванной севофлураном, и лечение цистанхе

Самцы крыс Sprague Dawley (SD) в возрасте 3 и 24 месяцев были приобретены у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Крыс выращивали в чистых акриловых клетках со свободным доступом к воде и пище при 12-часовом освещении. /темнота при постоянной температуре 21 градус ± 1 градус и влажности (45 процентов -65 процентов) в течение 1 недели перед экспериментом по размещению. Экспериментальные процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными Седьмой народной больницы Шанхайского университета традиционной китайской медицины. Все поведенческие тесты проводились в помещении с контролируемой температурой (21 градус ± 1 градус) и влажностью (45 процентов -65 процентов).

В первой серии экспериментов in vivo использовались самцы крыс SD 3- и 24- месячного возраста. Шестнадцать 3-месячных крыс массой 200- 250 г и шестнадцать 24-месячных крыс массой 240-300 г были случайным образом назначены для введения севофлюрана (Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. , Ляньюньган, Китай) или газ-носитель (n=8 для каждой группы). Животных в группах анестезии (SEVO) подвергали воздействию севофлурана в концентрации 2,6 %, доставляемого увлажненным 30-процентным газом-носителем O2 в течение 4 ч при скорости потока 2 л/мин с использованием анестезиологического аппарата с мультигазовым монитором (Prisma SP Alpa, Оксон, Великобритания). Крысы контрольной группы подвергались воздействию газа-носителя без севофлурана в течение того же времени.

на 4 часа (n=8 для каждой группы). Поведенческие тесты проводились в 1-й и 3-й день после анестезии. Затем животных забивали сразу после оценки поведения на 3-й день и использовали гиппокамп в головном мозге для молекулярных анализов. В третьей серии экспериментов все анестезированные крысы были случайным образом разделены на четыре группы (n=8 в каждой группе): (а) группа SEVO; (b) группа SEVO plus GW9662 (антагонист PPAR-, 30 нг каждый раз);

(c) СЕВО плюсцистанхегруппа; и (d) СЕВО плюсцистанхеплюс группа GW9662. Последующие эксперименты были аналогичны описанию во второй серии экспериментов.

2.3|Поведенческое тестирование

Тест водного лабиринта Морриса был выполнен, как описано ранее, с небольшими изменениями для оценки пространственной памяти и способности крыс к обучению в настоящем исследовании.8,20 Резервуар был заполнен водой на глубину 40 см и сделан непрозрачным добавлением нетоксичной белой темперной краски. Температуру воды поддерживали на уровне 22 ± 1 градус, чтобы мышь не плавала. Круглая спасательная платформа (радиус 11 см) располагалась на 0,5-1 см ниже поверхности воды в одном из четырех квадрантов. В трех временных точках крыс тестировали на эталонную память после обучения в течение 5 дней, и каждый раздел обучающих испытаний состоял из четырех попыток с интервалом 15 минут. Во второй и третий момент времени платформа удалялась из пула, затем проводились измерения пространственной и рабочей памяти. Время, которое каждая крыса тратила на поиск платформы, регистрировали как задержку побега. После испытаний крыс помещали в обогреваемые клетки, прежде чем они возвращались в свою клетку.

Тест «открытое поле» проводили на 1-й и 3-й день после анестезии, как описано Fricano et al.21. Вкратце, крыс тестировали на квадратной арене размером 27,5 см × 27,5 см. Середина, 66 процентов арены, называлась «центром». Время пребывания в центре регистрировали как параметр для оценки анксиолитического поведения.

Тест условного рефлекса страха был выполнен, как описано ранее, с небольшой модификацией для изучения пространственной памяти и способности крыс к обучению в настоящем исследовании.22,23 Обучение проводилось через один день после анестезии. Каждой крысе давали возможность адаптироваться к камере в течение 120 с, после чего производили звуковой раздражитель (20 с, 80 дБ), а затем электрошок (2 с, 0,75 мА) через 25 с после звукового воздействия. стимул закончился. Экспозиции повторяли дважды с интервалом 60- с между второй и третьей экспозицией. Контекстный тест проводили на вторые и третьи сутки после операции. Каждую мышь помещали в ту же камеру, которая использовалась для обучения, после чего не применяли никаких стимулов и электрошока в течение того же интервала времени, что и при обучении животного. Результаты записывали и собирали процент времени замирания (без движения).

2.4|Коллекция тканей

После поведенческого анализа на 3-й день после анестезии экспериментальных крыс умерщвляли; затем сразу же удаляли ткани головного мозга и осторожно вскрывали гиппокамп. Для анализа белков, РНК и цитокинов гиппокамп сразу же замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С. Для иммуногистохимического анализа ткани фиксировали 4-процентным параформальдегидом в течение 72 часов, а затем переносили в 20-процентный раствор сахарозы еще на 72 часа.

2,5|Иммуноферментный анализ

Все крысы были умерщвлены после проведения поведенческого теста на 3-й день. Ткани гиппокампа сразу рассекали на льду и гомогенизировали ультразвуком в физиологическом растворе. Затем проводили центрифугирование при 10 000 × g при 4 градусах в течение 15 минут. Уровни IL-1, TNF- и IL-6 определяли с помощью наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Пределы обнаружения составили 8,0 пг/мл для IL{{10}}, 8,0 пг/мл для TNF- и 4,0 пг/мл для IL{{16} }. Концентрации IL-1, TNF- и IL-6 в плазме в день 1 и день 3 также измеряли с помощью ELISA.

2,6|Определение нитритов/нитратов и окислительного повреждения липидов и белков

Концентрацию нитритов/нитратов (NO2-) в собранном супернатанте измеряли с помощью реакции Грисса (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США), которая показала наличие оксида азота (NO). Вкратце, 100 мкл реактива Грисса добавляли к 100 мкл супернатанта. Общее содержание белка в супернатанте измеряли с помощью набора реагентов для анализа белка BCA (KeyGEN, Китай) после инкубации при комнатной температуре в течение одного часа, а оптическую плотность измеряли с помощью спектрофотометра при 550 нм. Результаты представлены в нмоль NO - на мг белка.

Уровень малонового диальдегида (МДА) в гиппокампе определяли с помощью набора для анализа МДА (Jiancheng Bioengineering Institute, Нанкин, Китай) после сбора с помощью гомогената и центрифугирования. Окислительное повреждение липидов определяли с помощью анализа реактивных веществ с тиобарбитуровой кислотой (TBARS). Вкратце, образцы супернатантов осаждали 10% трихлоруксусной кислотой. Затем добавляли тиобарбитуровую кислоту (0,67%) и измеряли оптическую плотность при 535 нм. 1,1,3,3-тетраметоксипропан в качестве внешнего стандарта и данные выражали в нмоль эквивалентов малонового диальдегида на мг белка.

2,7|Определение активности антиоксидантных ферментов

Для измерения активности супероксиддисмутазы (СОД) 1{{10}} мкл супернатантов, полученных гомогенизацией тканей и центрифугированием (10 000 × g, 15 минут) при 4 степени, добавляли к 2 00 мкл реакционного раствора (50 мкл тетразолия плюс 19,95 мл буфера для анализа, включая 50 мМ трис-HCl, 0,1 ммоль/л гипоксантинов и 0,1 ммоль/л диэтилентриаминперуксусной кислоты, pH 8,0). Затем к смеси добавляли 20 мкл оксида ксантина для инициирования реакции. После встряхивания и инкубации в течение 20 минут с помощью спектрофотометра регистрировали изменения поглощения при 450 нм. Активность СОД рассчитывали по формуле, прилагаемой к набору для детектирования (Cayman Chemical Company, Анн-Арбор, Мичиган, США).

Активность КАТ в супернатанте ткани гиппокампа определяли спектрофотометрически, рассчитывая скорость разложения перекиси водорода (H2O2) при 240 нм. Вкратце, аликвоту 100 мкл супернатанта (20 мкл) добавляли к смеси субстратов (1000 мкл), содержащей 0,3 мл H2O2 в 50 мл 0,05 моль/л PBS (pH 7.0). Поглощение регистрировали через 1 минуту после начала реакции. Результаты рассчитывали с использованием внешних стандартов и выражали в единицах ед на мг белка.

2,8|Выделение РНК и количественная ПЦР

Ткани гиппокампа гомогенизировали для получения полных РНК с использованием TRIzol (Invitrogen), а затем осуществляли амплификацию транскриптов с использованием набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad). Полученную кДНК амплифицировали с помощью количественной ПЦР с использованием iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) с ген-специфическими праймерами, и относительную экспрессию каждого гена рассчитывали с использованием метода 2-ΔΔCt и нормализовали к контролю GAPDH. Последовательности праймеров представлены в таблице S1.

2.9|Вестерн-блот

Ткани гиппокампа гомогенизировали в буфере для лизиса клеток (50 ммоль/л Трис, pH 7,5, 1 ммоль/л ЭДТА, 150 ммоль/л NaCl, 0,5% Triton X-100 , 0,5% NP-40, 1 ммоль/л фенилметилсульфонилфторида, 5 ммоль/л ванадата натрия, 1 ммоль/л фторида натрия, 1 мкг/мл апротинина, пепстатина и лейпептина). Белки разделяли с помощью гелей SDS-PAGE, а затем белки из гелей переносили на мембраны PVDF (Millipore). Мембраны блокировали 5-процентным молоком, а затем инкубировали со специфическими первичными антителами, включая анти- -АРР (ab76763, разведение 1:1000), анти-BDNF (ab108319, разведение 1:1000), анти-GFAP (ab68428). , разведение 1:1000), анти-Iba-1 (ab178847, разведение 1:1000), анти-PPAR- (ab209350, разведение 1:1000), анти-NF-κB (ab32360, разведение 1:1000) и анти-GAPDH (ab181602, разведение 1:1000). Впоследствии TBST использовали для промывания мембран, а затем инкубировали их с HRP-конъюгированными вторичными антителами (Санта-Круз, Калифорния, США). Наконец, соответствующий белок наблюдали с помощью системы ECL (PerkinElmer) в свете пояснений производителя. И ImageJ был применен для количественного анализа относительной экспрессии белка.

2.10|Анализ флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS)

Для анализа FACS клетки гиппокампа собирали сразу после выделения. Затем клетки промывали ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS) и ресуспендировали в PBS, содержащем 2% FBS. Для каждого анализа 1 × 105 клеток в 100 мкл PBS-FBS окрашивали флуоресцентно конъюгированными антителами против CD11b (BD PharMingen, № по каталогу 554982, 1:250) и CD45 (BD PharMingen, № по каталогу 554878, 1:250) на льду для 2 часа при 4 градусах в темноте. После промывания холодным PBS клетки ресуспендировали в 300 мкл PBS-FBS. Проточный цитометрический анализ выполняли на проточном цитометре FACSAria I (BD Biosciences). Результаты были проанализированы с помощью FlowJo (версия 7.6.1).

2.11|окрашивание по Нисслю

Собранный гиппокамп был помещен в компаунд OCT, а затем нарезан на корональные срезы размером {{0}} мкм с использованием замораживающего микротома (Leica). После оттаивания на заряженных предметных стеклах срезы трижды промывали 0.01 моль/л PBS в течение 15 минут, а затем инкубировали в растворе крезилвиолета (0,5%, содержащем несколько капель ледяной уксусной кислоты). кислоты) в течение 10-15 минут при комнатной температуре. После двукратной промывки дистиллированной водой срезы постепенно обезвоживали в этаноле (70%, 85%, 95% и 100%). После обезвоживания их помещали в ксилол и закрывали покровным стеклом с использованием монтажной среды. Наконец, окрашивание по Нисслю наблюдали под микроскопом (Leica).

2.12|Анализ данных

Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6.0. Данные поведенческих исследований анализировали в разные моменты времени (день 1 или день 3) после анестезии севофлураном с использованием двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с повторными измерениями. Другие данные были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа перед тестом Бонферрони. Все эксперименты были выполнены в трех повторностях, и результаты были выражены как среднее значение ± SEM. P < 0,05="" считалось="" статистически="">

3|ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1|Cistanche предотвращает аномальное нейровоспаление у старых крыс

Чтобы исследовать разницу в когнитивных функциях между взрослыми и стареющими крысами, севофлуран использовали для индуцирования анестезии у 3- и 24-месячных крыс. Затем поведение, зависящее от гиппокампа, оценивали на 1-й и 3-й день (рис. S1A). Как показано на рисунке S1B, не было никакой разницы в латентном периоде избегания для четырех экспериментальных групп в 1-й день. Кроме того, время, проведенное в центре, и процент замирания были аналогичны крысам, которые получали носитель и севофлуран в 1-й день (рис. S1C, Д). Тем не менее, 3- и 24- месячные крысы имели значительные различия в латентном периоде побега, времени, проведенном в центре, и проценте

замирание после индукции севофлураном на 3-й день, что позволяет предположить, что севофлуран значительно изменил когнитивную функцию старых животных (рис. S1B-D). Таким образом, для последующих экспериментов использовали старых крыс.

Чтобы исследовать влияние цистанхе на нейровоспаление у старых крыс, подвергшихся воздействию севофлурана, мы оценили уровни провоспалительного цитокина. Признаки нейровоспаления наблюдались через 24 часа после анестезии севофлураном, о чем свидетельствует высокая концентрация провоспалительных цитокинов IL-1 , IL-6 и TNF- в плазмиде на 1-й и 3-й день. (рис. 1А, 1), а на нейровоспаление указывало повышение уровня мРНК провоспалительных цитокинов в гиппокампе до 3 дней (рис. 1С-Е). Для каждого из провоспалительных факторов лечение цистанхе устраняло различия в индуцированных севофлураном изменениях провоспалительных медиаторов. Цистанхе значительно ослаблял повышенный уровень провоспалительных цитокинов в группе севофлурана.

3.2|Лечение экстрактом Cistanches Herba ослабляло вызванный севофлураном окислительный стресс в гиппокампе старых крыс

Затем мы исследовали влияние цистанхе на окислительный стресс, вызванный севофлураном. Как показано на рисунке 2А, ​​мы обнаружили, что лечение цистанхе предотвращало вызванный севофлураном окислительный стресс, о чем свидетельствует значительное снижение концентрации нитритов/нитратов в гиппокампе. Мы также заметили, что группа SEVO плюс цистанхе показала более низкие уровни эквивалентов MDA, показатель окислительного повреждения липидов, в гиппокампе через три дня после ингаляции севофлурана, по сравнению с группой SEVO.

группа (рис. 2В). Кроме того, у крыс, подвергнутых анестезии севофлураном (группа SEVO), на 3-й день после анестезии в гиппокампе наблюдалось достоверное снижение активности СОД и КАТ. Однако активность этих ферментов в гиппокампе была значительно повышена в группе SEVO плюс цистанхе по сравнению с группой SEVO (рис. 2C, D).

ЦистанхеПищевая добавка снимает антиоксидантный стресс

3.3| Лечение экстрактом Cistanches Herba ослабляет активацию микроглии

Клетки микроглии активируются при лабораторном или индуцированном анестезией воспалении в гиппокампе, что затем способствует патологическому прогрессу. Чтобы выяснить, может ли цистанхе предотвратить активацию микроглии, мы измерили популяцию активированных клеток микроглии и ее относительные маркеры. Покоящаяся микроглия экспрессировала CD11b и низкий уровень экспрессии CD45, в то время как активированная микроглия экспрессировала CD11b и высокий уровень CD45. Как показано на рисунке 3A, результаты анализа проточной цитометрии подтвердили, что процентное содержание CD45 было значительно ниже у крыс, получавших цистанхе, чем у крыс, индуцированных SEVO (0,495 ± 0.{{15} } 51 процент после лечения цистанхе против 1,127 ± 0,032 процента в группе SEVO). Впоследствии мы измерили глиальные маркеры с помощью qRT-PCR. После анестезии севофлюраном мРНК

3.4|Лечение экстрактом Cistanches Herba ослабляет апоптоз нейронов, вызванный севофлураном

Апоптоз нейронов частично обусловлен активированной микроглией и окислительным стрессом, и мы подтвердили, что цистанхе может предотвращать активацию микроглии и окислительный стресс in vivo. Для дальнейшего изучения фармакологических эффектов цистанхе мы проверили апоптоз нейронов с помощью окрашивания TUNEL и расщепленной каспазы 3 и иммуноблота Bax/Bcl-2. Как показано на рисунке 4А, севофлуран усиливал клеточный апоптоз в областях гиппокампа. Введение цистанхе снижало количество клеток TUNEL plus после анестезии севофлураном. Мы также продемонстрировали замечательные высокие уровни каспазы 3 и Bax, в то время как низкие уровни Bcl-2 в гиппокампе анестезированных старых крыс. У крыс, которым вводили цистанхе перед анестезией, было выявлено значительное снижение активности каспазы 3 (рис. 4B), расщепленной каспазы 3 и белка Bax (рис. 4C, D), что согласуется со сниженным апоптозом нейронов, наблюдаемым при окрашивании TUNEL.

3,5|Лечение экстрактом Cistanches Herba облегчало когнитивную дисфункцию и повреждение ткани гиппокампа после анестезии, вызванной севофлураном.

Для дальнейшего изучения роли цистанхе в когнитивной функции крысам вводили перорально 50 мг/кг цистанхе в течение трех дней подряд перед анестезией. В группе, получавшей цистанхе (группа SEVO плюс цистанхе), латентный период избегания был значительно сокращен, время, проведенное в центре, было больше, а процент замирания увеличился на 3-й день после анестезии по сравнению с группой SEVO (рис. 5A-). С). Эти результаты показали, что цистанхе может, по крайней мере, частично восстанавливать когнитивные нарушения. Далее мы оценили степень гибели нейронов в гиппокампе крыс в четырех группах с помощью окрашивания по Нисслю. Изображения показали, что клетки не имели явных аномалий в контрольной группе и контрольной группе плюс цистанхе. Однако количество выживших нейронов в областях СА1 было значительно снижено у крыс, индуцированных SEVO, по сравнению с таковым в контрольной группе на 3-й день. Лечение цистанхе обращало этот эффект SEVO и значительно повышало выживаемость нейронов по сравнению с только индуцированными SEVO. (Рисунок 5D).

3.6|Лечение экстрактом Cistanches Herba снижает выработку провоспалительных цитокинов, индуцированную севофлураном, - -чувствительно к PPAR.

Затем мы исследовали, было ли влияние цистанхе на продукцию цитокинов чувствительным к PPAR- -. Лечение с помощью GW9662 (группа SEVO плюс GW9662) повышало уровни IL-1, IL-6 и TNF- по сравнению с группой SEVO. Однако лечение цистанхе уменьшало продукцию провоспалительных цитокинов, индуцированную SEVO. Отметить,

3,7|Лечение экстрактом Cistanches Herba ингибировало окислительный стресс, вызванный севофлураном, посредством PPAR-рецепторов.

Сообщалось, что севофлуран усугубляет когнитивную дисфункцию в модели крыс с хронической прерывистой гипоксией, вызванной ингибированием экспрессии PPAR в гиппокампе.цистанхепроизошло - -в зависимости от PPAR. С этой целью для дальнейшего изучения был использован GW9662, селективный и необратимый антагонист PPAR-. Обработка GW9662 в дозе 30 нг способствовала окислительному стрессу, о чем свидетельствуют повышенные уровни нитритов/нитратов и МДА. Однако антиоксидантные маркеры SOD и CAT в гиппокампе на 3-й день были повышены по сравнению с крысами, оперированными SEVO. Лечение сцистанхеснижал индуцированное SEVO перепроизводство маркеров окислительного стресса и облегчал активность SOD и CAT (рис. 7A-D). Кроме того, эти эффекты, вызванныецистанхебыли восстановлены с помощью GW9662, о чем свидетельствует увеличение производства нитритов/нитратов (рис. 7А) и МДА (рис. 7В). В дополнение

эффекты цистанхе на активность SOD и CAT также устранялись с помощью GW9662 (фиг. 7C, D), что указывает на участие PPAR-.

3,8|Лечение экстрактом Cistanches Herba ингибировало активацию микроглии и апоптоз нейроцитов, а также улучшало снижение когнитивных функций чувствительным к PPAR - - образом.

Следующим шагом было выяснить, влияют лицистанхена активацию микроглии и апоптоз нейроцитов были чувствительны к PPAR- -. Лечение GW9662 повышало уровни мРНК CD68 (фиг. 8A), GFAP (фиг. 8B) и Iba-1 (фиг. 8C). Примечательно, что эти эффекты, вызванные GW9662, были эффективно устранены с помощьюцистанхе, о чем свидетельствует снижение этих же маркеров (фиг. 8А-С). Более того, экспрессия белков GFAP и Iba-1, продуцируемых GW9662, также реверсировалась под действием цистанхе, что указывает на то, что цистанхе ингибирует активацию микроглии и, по крайней мере, частично зависит от PPAR-. Кроме того, эффект цистанхе на экспрессию белка -APP и BDNF ингибировался GW9662 (рис. 8D, E). Чтобы выяснить, может ли цистанхе ингибировать апоптоз нейроцитов чувствительным к PPAR - - образом, были обнаружены белки, связанные с апоптозом. Как показано на фиг. 8F, G, цистанхе в дозе 50 мг/кг снижал экспрессию проапоптозного белка (расщепленной каспазы 3 и Bax). Однако эти эффекты были в значительной степени спасены GW9662.

Цистанхеэкстракт может облегчить клеточный апоптоз

Поскольку уровни окислительного стресса и воспаления были тесно связаны с когнитивной функцией у крыс после анестезии, мы дополнительно определили, влияет ли эффектцистанхена когнитивную дисфункцию зависело от PPAR- -. Как показано на рисунке 8H-J, по сравнению с крысами