ЧАСТЬ 1 Эхинакозид индуцирует вазорелаксацию легочных артерий крыс, открывая каналы NO-cGMP-PKG-BKCa и снижая внутриклеточные уровни Ca2 plus

Как эхинакозид вызывает венозную релаксацию?

Сян-Юн ГАИ1, 2, 3, Ю-хай ВЭЙ4, Вэй ЧЖАН2, Та-на ВУРЕН2, Я-пин ВАН2, Чжан-Цян ЛИ2, Шоу ЛИУ2, Лань МА2, Дянь-Сян ЛУ2, Йи ЧЖОУ1, 2, Ри- li GE1, 2, * 1 Кафедра фармакологии, Школа биологических наук и биофармацевтики, Шэньянский фармацевтический университет, Шэньян 110016, Китай; 2 Научно-исследовательский центр высокогорной медицины Медицинского колледжа Цинхайского университета, Синин 810001, Китай; 3 Факультет фармации, Цинхайский университет национальностей, Синин 810007, Китай; 4 Бюро инспекции въезда-выезда и карантина Цинхай, Синин 810001, Китай

Цель:Устойчивая легочная вазоконстрикция, возникающая на большой высоте, может привести к легочной гипертензии (ЛГ). Основная цель данного исследования - изучить сосудорасширяющее действиеэхинакозид(ECH), фенилэтаноидный гликозид из тибетской травы Lagotis brevituba Maxim иЦистанхе трубчатая, на легочную артерию и ее потенциальный механизм.

Методы:Кольца легочных артерий, полученные от самцов крыс Wistar, подвешивали в камерах органов, заполненных раствором Кребса-Хенселейта, и измеряли изометрическое натяжение с помощью датчика силы. Уровни внутриклеточного Ca2 plus измеряли в культивируемых гладкомышечных клетках легочных артерий крысы (PASMC) с использованием Fluo 4-AM.

Полученные результаты: ЭХ(30–300 мкмоль/л) расслабляли легочные артерии крыс, предварительно сокращенные норадреналином (НЭ) в зависимости от концентрации, и этот эффект можно было наблюдать как в интактном эндотелии, так и в кольцах без эндотелия, но со значительно более низким максимальным ответом и более высокая EC50 в кольцах без эндотелия. Этот эффект значительно блокировался L-NAME, TEA и BaCl2. Однако IMT, 4-AP и Gli не ингибировалиЭХиндуцированная релаксация. В условиях отсутствия внеклеточного Са2+ максимальное сокращение было снижено до 24,54% ± 2,97% и 10,60% ± 2,07% в кольцах, обработанных 100 и 300 мкмоль/л ЭХГ соответственно. В условиях притока внеклеточного кальция максимальное сокращение было снижено до 112,42% ± 7,30%, 100,29% ± 8,66% и 74,74% ± 4,95% в кольцах, обработанных 30, 100 и 300 мкмоль/л ЭХГ соответственно. После того, как клетки были загружены Fluo 4-AM, средняя интенсивность флуоресценции была ниже в клетках, обработанныхЭХ(100 мкмоль/л), чем при НЭ.

Вывод: ЭХподавляет NE-индуцированное сокращение легочной артерии крысы за счет снижения внутриклеточного уровня Ca2 plus и индуцирует его расслабление через путь NO-cGMP и открытие каналов K plus (BKCa и KIR).

Ключевые слова:тибетская трава;эхинакозид; легочная гипертензия; большая высота; вазорелаксация; НЕТ; БКСа; КИР; кольцо артерии; гладкомышечные клетки легочных артерий.

Для получения более подробной информации, пожалуйста, свяжитесь с:Joanna.jia@wecistanche.com

Цистанхе пустынная имеет много эффектов, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Введение

Устойчивая легочная вазоконстрикция, возникающая на большой высоте, может привести к легочной гипертензии (ЛГ) и медиальной гипертрофии [1], которые были определены как основная причина гипертрофии правого желудочка и сердечной недостаточности [2]. У людей, временно или постоянно проживающих на большой высоте, может наблюдаться легочная гипертензия от легкой до умеренной степени, а у лиц с повышенной чувствительностью к гипоксии может наблюдаться преувеличенная легочная вазоконстрикция, приводящая к различным высотным заболеваниям, которые связаны со значительной заболеваемостью и смертностью, такими как высотный отек легких и болезни сердца[3].Эхинакозид(ECH) (рис. 1) представляет собойфенилэтаноидный гликозидсодержится в различных китайских травах, таких как тибетская трава Lagotis brevituba Maxim иЦистанхе трубчатая[4, 5]. Lagos brevituba Maxim — вид Lagotis spp, относящийся к семейству Scrophulariaceae и широко произрастающий на высоте более 3000 метров на Цинхай-Тибетском нагорье.ЭХобладает различными желательными фармакологическими характеристиками, такими как антиоксидантные, противовоспалительные, нейропротекторные, гепатопротекторные свойства и способность удалять радикалы оксида азота (NO) [6]. Он также может вызывать эндотелий-зависимую релаксацию в кольцах грудной аорты крыс и лечить сердечно-сосудистые заболевания [7]. Однако, насколько нам известно, исследований по изучению его влияния на тонус сосудов в легочных артериях не проводилось. Цели этого исследования заключаются в следующем: (1) изучить, вызывает ли ЭХГ in vitro вазорелаксацию в легочных артериях крыс, предварительно сжатых норадреналином (НЭ), и является ли этот эффект, если таковой имеется, эндотелий-зависимым или действует непосредственно на гладкие мышцы сосудов. ; (2) исследовать влияние ЭХГ на приток внеклеточного кальция и высвобождение внутриклеточного кальция в гладкомышечных клетках легочных артерий крысы (PASMC); и (3) идентифицировать возможные пути и K плюс каналы, участвующие в релаксации, индуцированной ЭХГ.

материалы и методы

Реагенты

ECH был любезно предоставлен доктором Peng-fei TU из Пекинского университета (Пекин, Китай) с чистотой более 98 процентов, определенной высокоэффективной жидкостной хроматографией. Диметилсульфоксид (ДМСО) был приобретен у Solar Science & Technology Co, Ltd (Пекин, Китай); NE, ацетилхолин (ACh, более или равный 99 процентам), индометацин (IMT), гидрохлорид метилового эфира Nω-нитро-L-аргинина (L-NAME), хлорид тетраэтиламмония (TEA), хлорид бария (BaCl2), {{ 9}}аминопиридин ({{10}}AP) и глибенкламид (Gli) от Sigma Chemical Co (Сент-Луис, Миссури, США); модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, эмбриональная телячья сыворотка (FBS) и трипсин от Gibco BRL Co, Ltd (Гейтерсберг, Мэриленд, США); мышиное антитело к первичному актину гладких мышц крысы (-SMA) и козье антимышиное вторичное антитело от Boshide Biotech Co, Ltd (Ухань, Китай); Флуокальциевые индикаторы (Fluo 4-AM) от Invitrogen Corp (Карлсбад, Калифорния, США); и все неорганические соли от Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Пекин, Китай). IMT растворяли в ДМСО, а 5% NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM и ECH растворяли в ДМСО, а все остальные реагенты растворяли в растворе Кребса-Хенселейта (КН) или PBS. Предварительные эксперименты показали, что ДМСО в концентрации менее 0,1% (об./об.) не влиял на развитие напряжения изолированных колец легочной артерии.

Экспериментальные животные

Все процедуры и протоколы были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Медицинского колледжа Цинхайского университета. Самцов крыс линии Вистар в возрасте 6–8 недель с массой тела 250–300 г приобретали в Центре животных Ланьчжоуского университета (Ланьчжоу, Китай) и содержали на стандартной лабораторной диете и водопроводной воде вволю при температуре окружающей среды 22°С. 2 градуса и относительной влажности 45-55 процентов на протяжении всех экспериментов.

Перфузия легочной артерии in vitro

Подготовка колец легочной артерии крысы

Крыс массой 250–300 г анестезировали внутрибрюшинным введением пентобарбитала натрия (40 мг/кг), затем извлекали их сердце и легкие и немедленно погружали в ледяной раствор КН, содержащий (в ммоль/л) : 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4·7H2O, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 и 11,1 глюкозы (pH 7,4). Внутрилегочные артерии (диаметром 0,7–1,5 мм) рассекали, освобождая от окружающей соединительной ткани и адвентиции, а затем разрезали на кольца длиной примерно 2–3 мм. Кольца были подвешены в камерах для органов, заполненных 10 мл раствора KH при 37 градусах и газированных 95-процентным O2-5-процентным CO2 [8], а изометрическое натяжение измерялось с помощью датчика силы (JH-2, Space Medico -Инженерный институт, Пекин, Китай)

Оценка активности сосудистых колец и оценка функции эндотелия

Кольцам сосудов давали уравновеситься в течение 2 ч при базальном напряжении 400 мг, в течение этого времени раствор KH меняли каждые 15 мин; затем в камеру добавляли 1 мкмоль/л NE для оценки активности каждого кольца путем определения процента сокращения. До и после экспериментального протокола измеряли процент сокращения (рис. 2А и 2В). В некоторых кольцах удаляли эндотелий путем осторожного растирания поверхности интимы тонкой стальной проволокой, а целостность оценивали качественно по степени релаксации, вызванной АХ (10 мкмоль/л), в процентах сократительного тонуса, индуцированного НЭ (1 мкмоль/л). Если релаксация с АХ превышала 80%, эндотелий оставался в хорошем состоянии; если релаксация была менее 30 процентов, эндотелий разрушался (рис. 2А и 2В) [9].

Выделение и культивирование крысиных PASMC

Из легочных долей крыс выделяли дистальные легочные артерии и осторожно удаляли эндотелий и адвентицию. После измельчения тканей на кусочки размером {{0}} мм их сразу же помещали в колбы, выдерживали при температуре 37°С и 5% СО2 во влажном инкубаторе в течение примерно четырех часов, а затем культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы. с добавлением 20% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина в течение примерно пяти дней. Половину культуральной среды заменяли свежей средой при появлении клеток. Когда клетки достигли 80-процентного слияния, их собирали с 0,125-процентным трипсином и высевали в колбы (соотношение 1:2), содержащие DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненную 10-процентным FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина. . Для всех экспериментов использовали клетки с количеством пассажей от трех до восьми.

Идентификация PASMC с помощью иммуногистохимии

PASMC были положительными при иммунохимическом окрашивании, когда наблюдались типичные признаки «холма и долины». Клетки высевали в 6-луночные планшеты со стеклянными покровными стеклами. Когда клетки достигли 80-процентного слияния, их фиксировали в 4-процентном параформальдегиде, блокировали 3-процентным раствором перекиси водорода в течение 15 минут, а затем инкубировали с мышиным первичным антителом против крысиного SMA в течение ночи при 4°С. После трехкратной промывки в PBS в течение 10 мин клетки инкубировали с козьими антимышиными вторичными антителами при комнатной температуре в течение 45 мин, снова трижды промывали в PBS в течение 10 мин и визуализировали диаминобензидином.

Определение концентрации внутриклеточного кальция в PASMC крысы

PASMC высевали в {{0}}луночные планшеты со стеклянными покровными стеклами. Когда клетки достигли 80 процента слияния, культуральную среду заменяли бессывороточной DMEM. Через 24 часа клетки нагружали 7 мкмоль/л Fluo 4-AM при 37 градусах в течение 30 минут во влажной атмосфере с 5% CO2. Остаточный краситель промывали раствором сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS), содержащим следующее (в ммоль/л): 1,26 CaCl2, 0,49 MgCl2·6H2O, 0,41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 и 5,56 D-глюкозы, без фенолового красного. Клетки, нагруженные Fluo 4-AM, подвергались воздействию одного из трех условий обработки: (1) контрольная группа (con-группа), в которой клетки инкубировали с DMEM без сыворотки; (2) группа NE, в которой клетки инкубировали с бессывороточной DMEM с добавлением 1 мкмоль/л NE в течение 10 мин; и (3) группа НЭ плюс ЭХГ (100 мкмоль/л) (группа НЭ плюс ЭХГ100), в которой клетки инкубировали с бессывороточной DMEM с добавлением 1 мкмоль/л НЭ в течение 10 мин и 100 мкмоль/л ЭХГ. в течение 20 мин. Интенсивность флуоресценции наблюдали и фотографировали с помощью флуоресцентной микроскопии (IX71, Olympus, Токио, Япония) [11]. Для каждого образца собирали шесть полей зрения (200×). Концентрацию внутриклеточного кальция количественно определяли путем измерения средней интенсивности флуоресценции с использованием программного обеспечения Image Pro-Plus 6.0.

статистический анализ

Данные выражали как среднее ± стандартное отклонение. При необходимости значимое различие оценивали с помощью критерия Даннета или критерия Стьюдента-Ньюмена-Кеулса для множественных сравнений после однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Уровень вероятности P<0.05 was="" considered="">

Результаты Вазорелаксантные эффекты ЭХГ на изолированную легочную артерию

В начале эксперимента кумулятивное добавление ЭХГ от 30 до 300 мкмоль/л не оказывало существенного влияния на базальное давление легочной артерии. После того, как сужение сосудов, вызванное НЭ, достигло плато, ЭХГ кумулятивно добавляли (30–300 мкмоль/л) к интактному эндотелию (Е плюс, рис. 2С) или кольцам без эндотелия (Е–, рис. 2С). В интактных эндотелиальных кольцах кумулятивное добавление ЭХГ расширяло сосуды в зависимости от концентрации, с максимальным

процент релаксации мамы 89,22% ±0,32% при 300 мкмоль/л и EC50 51,60±0,57 мкмоль/л (рис. 2А и 2С). Точно так же в кольцах без эндотелия ЭХГ также расширял сосуды в зависимости от концентрации, но со значительно более низким максимальным ответом 67,72% ± 1,69% (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Влияние ЭХГ на высвобождение внутриклеточного кальция и приток внеклеточного кальция

Обнаженные эндотелием кольца подвергались воздействию 1 мкмоль/л NE до тех пор, пока не было достигнуто максимальное сокращение. В условиях внеклеточного отсутствия Ca2 plus кольца уравновешивали в растворе KH, не содержащем Ca2 plus, содержащем 0,2 ммоль/л EGTA перед началом экспериментов. После трех промывок раствором КН, не содержащим Ca2 plus и EGTA, кольца предварительно инкубировали с ЭХГ (30, 100 и 300 мкмоль/л) в течение 20 мин, а затем повторно подвергали воздействию 1 мкмоль/л НЭ. Кольца произведены

неустойчивые сокращения, которые быстро вернулись к исходному уровню, по сравнению с начальными сокращениями, вызванными НЭ, которые служили в качестве эталона. Максимальное сокращение в контроле составило 33,27% ± 2,94% (рис. 3А и 3Е), но оно было значительно снижено до 24,54% ± 2,97% и 10,60% ± 2,07% в кольцах, предварительно обработанных 100 и 300 мкмоль/л ЭХГ соответственно (P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Роль различных ингибиторов в релаксации сосудов легочной артерии, вызванной ЭХГ у крыс

ЭХГ-индуцированную вазорелаксацию легочных артерий крыс исследовали в присутствии или в отсутствие следующих ингибиторов: L-NAME (ингибитор eNOS), IMT (ингибитор циклооксигеназы), TEA (ингибитор Ca2+-активированного K+-канала большой проводимости), BaCl2 ( внутренний выпрямитель K плюс ингибитор канала), 4-AP (зависимый от напряжения ингибитор K плюс канала) и Gli (АТФ-чувствительный ингибитор K плюс канала). Кольца максимально сокращались при 1 мкмоль/л НЭ, а затем L-NAME (100 мкмоль/л), ИМТ (10 мкмоль/л), ТЭА (1 ммоль/л) , BaCl2 (1 ммоль/л), 4-AP (1 ммоль/л) или Gli (10 мкмоль/л) соответственно. После достижения нового плато добавляли ЭХГ кумулятивно от 30 до 300 мкмоль/л. Кривые «концентрация-реакция» в присутствии различных ингибиторов показаны на рис. 4. Вазорелаксантный эффект ЭХГ на кольца легочных артерий, сокращенных 1 мкмоль/л НЭ, в значительной степени блокировался L-NAME (100 мкмоль/л), ТЭА ( 1 ммоль/л) и BaCl2 (1 ммоль/л) с максимальной релаксацией 64,41 % ± 3,20 %, 84,38 % ± 0,70 % и 75,27 % ± 0,93 % соответственно (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Идентификация крысиных PASMC

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 процентов) (рис. 6А). Миофиламенты, окрашенные в коричневый цвет, четко наблюдались в цитоплазме при большом увеличении (рис. 6В).

Цистанхеэхинакозидможет сопротивлятьсяапоптоз

Влияние ЭХГ на внутриклеточную концентрацию кальция в PASMC крысы

НЭ (1 мкмоль/л) значительно увеличивал концентрацию внутриклеточного кальция (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">