Часть 2: эхинакозид вызывает апоптозную гибель раковых клеток путем ингибирования дезинфицирующего фермента MTh1 пула нуклеотидов

эхинакозид индуцирует апоптотическую гибель раковых клеток путем ингибирования дезинфицирующего пула нуклеотидов фермента MTh1.

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com

Цистанхе эхинакозидимеетпротивораковыйа такжеантиапоптотическийпоследствия

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы перейти к части 3

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы перейти к части 1

Полученные результаты

Идентификация эхинакозида как ингибитора MTh 1

Для поиска природных соединений, способных ингибировать МТГ1, мы использовали ферментативную реакцию, катализируемую МТГ1-, в качестве высокопроизводительного скринингового анализа в лабораторных условиях. Помимо окисленных пуриновых нуклеотидов, MTH1 также может гидролизовать нормальный дезоксигуанозинтрифосфат с образованием дезоксигуанозинмонофосфата и пирофосфата. В присутствии избытка неорганической пирофосфатазы все пирофосфаты превращаются в неорганические фосфаты, которые можно количественно определить с помощью анализа поглощения на основе малахитового зеленого41, что позволяет косвенно измерить активность MTH1.32 Чтобы протестировать систему анализа, мы сначала измерили эффект (S)-кризотиниба, соединения с доказанной эффективностью в качестве ингибитора МТГ1.33 Результат показал, что (S)-кризотиниб действительно сильно ингибирует МТГ1 (рис. 1А) с IC50 500 нМ, что в семь раз выше, чем у Huber. et al (72 нМ).33 Вероятно, это было связано с различиями в методах обнаружения или источниках химических веществ и ферментов. Мы использовали менее чувствительный хромогенный подход, в то время как Хубер и др. использовали высокочувствительный биолюминесцентный метод.33 Помня об этом, мы провели скрининг 12 коммерчески доступных природных соединений (таблица S1), каждое из которых является основным ингредиентом традиционных трав с потенциальным противоопухолевым действием. Мероприятия.Эхинакозид, соединение, очищенное от паразитарного лекарственного растения Cistanche salsa (рис. 1C), значительно ингибировало реакцию (рис. 1B) с IC50 7,01 ± 2,13 мкМ (рис. 1D). Добавление в 50 раз большего количества пирофосфатазы не повлияло на результат, в то время как добавление в пять раз большего количества белка MTH1 значительно снизило степень ингибирования, предполагая, чтоЭхинакозидспецифически ингибировал активность MTH1 в ферментативном анализе in vitro.

Эхинакозид ингибировал клеточный MTh 1, увеличивая внутриклеточный 8-oxog

Далее мы спросили,Эхинакозидможет ингибировать внутриклеточную активность MTH1. Ингибирование клеточного MTH1 приведет к увеличению внутриклеточного 8-oxoG. Было показано, что авидин связывается с 8-oxoG с высокой специфичностью; 42 поэтому мы использовали иммунофлуоресцентное окрашивание Cy3-конъюгированным авидином для сравнения внутриклеточных уровней 8-oxoG в различных линиях раковых клеток до и послеЭхинакозидлечение. Клетки MG{{0}} человека, гепатокарциномы SK-HEP-1, рака молочной железы MCF-7 и колоректального рака SW480 обрабатывали 0 мкМ, 15 мкМ, 30 мкМ, 60 мкМ или 80 мкМ эхинакозида в течение 5 часов, 12 часов или 24 часов. Окрашивание Cy3-конъюгированным авидином показало, что обработка 60 мкМ эхинакозида в течение 24 часов отчетливо и значительно повышала уровень клеточного 8-oxoG (Cy3-реактивное вещество авидина) в этих раковых клетках ( Рисунок 2А и Б). Более высокая концентрация (80 мкМ)Эхинакозидпривело к более сильному окрашиванию клеток 8-oxoG (рис. 2B), что свидетельствует о зависимости доза-реакция. Аналогичные результаты были получены

методом иммунофлуоресцентного окрашивания мышиным моноклональным антителом против -8-oxoG (рис. S1A).43 КонцентрацияЭхинакозид(60 мкМ), необходимая для значительного увеличения клеточного 8-oxoG, была намного выше, чем IC50 (7,01 мкМ) в анализе in vitro. Вероятно, это было связано с разницей в чувствительности двух анализов. Иммунофлуоресцентное окрашивание гораздо менее чувствительно, чем ферментативный анализ in vitro; кроме того, количество молекул-ингибиторов, которые могут достигать и взаимодействовать с клеточным MTH1, зависит от сложных биологических процессов; кроме того, в анализе in vitro в качестве субстрата используется менее предпочтительный dGTP, и, следовательно, может быть легче (принимать меньше ингибиторов) ингибировать МТГ1, что приводит к более низкому значению IC50 в анализе in vitro.

противораковыйа такжеантиоксидантпоследствияэхинакозидизЦистанхепустыня

Клеточный 8-oxoG вырабатывается АФК, которым противодействуют антиоксиданты. Таким образом, увеличение клеточных АФК или подавление активности антиоксидантов также приведет к увеличению клеточного уровня 8-oxoG.Эхинакозидсам по себе является мощным антиоксидантом44,45 и, таким образом, должен усиливать, а не подавлять активность антиоксидантов. Чтобы проверить, изменился ли уровень клеточных АФКЭхинакозидлечение, те же раковые клетки обрабатывали 0 мкМ, 15 мкМ, 30 мкМ, 60 мкМ или 80 мкМ эхинакозида в течение 5 часов, 12 часов или 24 часов, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии после окрашивания флуоресцентным зонд 2',7'-диацетат дихлорфлуоресцеина. Результаты показали, что ни одно из этих обработок не изменило уровень клеточных АФК (рис. 2C и D). Таким образом, повышенный уровень клеточного 8-oxoG, скорее всего, является результатом ингибирования МТГ1 эхинакозидом.

эхинакозидвызвал обширные повреждения ДНК, особенно в раковых клетках. Включение 8-oxoG в ДНК будет стимулировать BER и MMR, которые генерируют одноцепочечные разрывы ДНК (SSB) и пробелы.16,17 Обычно эти разрывы и пробелы закрываются механизмы репарации, включающие заполнение промежутков и лигирование ДНК-полимеразами и лигазами. 46,47 Однако быстрое увеличение клеточных SSB может насыщать клеточную способность репарации, приводя к образованию многочисленных двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) 18 и передачи сигналов DDR. Чтобы проверить, еслиЭхинакозид-индуцированное увеличение клеточного 8-oxoG, вызывающее повреждения ДНК, мы исследовали один из ранних маркеров повреждения ДНК, 53BP1, который связывается с сайтами DSB как самый ранний клеточный ответ на DSB.48 MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 и SW480 раковые клеточные линии и нераковые клеточные линии нормальная печень человека L-O2,49 эмбриональная почка человека HEK 293 и фибробласты мыши NIH/ 3T3 обрабатывали 0 мкМ, 15 мкМ, 30 мкМ, 60 мкМ или 80 мкМ эхинакозида в течение 5 часов, 12 часов или 24 часов. Флуоресцентное иммуноокрашивание показало, что обработка 60 мкМ эхинакозида в течение 24 часов специфически увеличивала количество клеток с пятью или более сильно окрашенными ядерными очагами 53BP1 во всех раковых, но не в каких-либо нераковых клеточных линиях (рис. 2E и F). Значительное увеличение количества клеток 53BP1 plus наблюдалось уже через 5 часов после начала лечения эхинакозидом (рис. 2F). Более высокая концентрация (80 мкМ) эхинакозида или более длительное время обработки (12 часов и 24 часа) приводили к большему увеличению как количества клеток 53BP1 plus (рис. 2F), так и количества клеточных очагов 53BP1. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что ингибирование MTH1 эхинакозидом вызывает накопление 8-oxoG и обширные повреждения ДНК в раковых, но не в нераковых клетках.

эхинакозид подавлял пролиферацию раковых клеток

В циклических клетках нерепарированные разрывы цепей ДНК вызовут коллапс вилок репликации ДНК, что затем приведет к блокированию клеточной пролиферации путем индукции остановки клеточного цикла и апоптоза.50 Чтобы проверить эффектыЭхинакозидЧто касается роста и пролиферации клеток, мы сначала проанализировали рост обработанных эхинакозидом раковых клеток MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 и SW480 с помощью анализа образования колоний. Результаты показали, что раковые клетки, обработанные 60 мкМ или 80 мкМЭхинакозидсформировали гораздо меньше колоний, а образовавшиеся колонии были намного меньше (рис. 3А и В), что указывает на сильное подавление потенциала роста. Затем мы проанализировали пролиферацию этих раковых клеток вместе с нераковыми клетками L-O2, HEK 293 и NIH/3T3 с помощью анализа МТТ. Результаты показали, что эхинакозид дозозависимо ингибировал пролиферацию раковых, но не нераковых клеток (рис. 3С). Исследование раковых клеток, обработанных 60 мкМ эхинакозида во времени, показало, что через 5 часов не было существенной разницы между группами, не получавшими лечения, и группами, получавшими лечение, но через 12 часов пролиферация раковых клеток значительно ингибировалась 60 мкМ.Эхинакозид(Рисунок 3D).

стадиях клеточного цикла с помощью проточной цитометрии установлено, чтоЭхинакозидлечение в зависимости от дозы снижало процент клеток как в фазах S, так и в фазах G2/M, в то время как процент клеток в фазе G1 увеличивался (рис. 4C и D). После обработки клеток MG-63 80 мкМ эхинакозида в течение 24 часов количество клеток в фазе G2/M уменьшилось с 15 до почти нуля, а количество клеток в фазе S уменьшилось с 37 до 17 процентов. , в то время как количество клеток в фазе G0/1 увеличилось с 43 до 80 процентов (рис. 4E). Эти результаты свидетельствуют о том, что лечение с помощьюЭхинакозидвызывал остановку клеточного цикла и блокировал раковые клетки в фазе G1.

Эхинакозид индуцирует апоптоз в раковых клетках

В соответствии с наблюдениями за пролиферацией клеток вестерн-блоттинг показал, что обработка 60 мкМ и 80 мкМЭхинакозидв течение 24 часов повышали уровни активной каспазы -3 и белков расщепленной поли (АДФ-рибозы) полимеразы в раковых клетках (рис. 5А и В), что свидетельствует об индукции каспазозависимого апоптоза. Затем мы исследовали несколько клеточных маркеров апоптоза. Во-первых, ядерная морфологияЭхинакозидОбработанные раковые клетки выявляли путем окрашивания ДНК-красителем DAPI, которое показало, что 24-часовая обработка 60 мкМ и 80 мкМЭхинакозидувеличилось количество признаков апоптоза, включая пикноз и конденсированный хроматин (более яркие ядра) (рис. 5С). Во-вторых, ДНК, извлеченная из обработанных аналогичным образом раковых клеток, была проанализирована с помощью электрофореза на агарозном геле, который выявил типичную структуру апоптотической лестницы (рис. S1B). Наконец, клеточная активная каспаза-3 была обнаружена с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, которое выявило сильные сигналы активированной каспазы-3 вЭхинакозид-обработанные раковые клетки (рис. S1C).

Затем процент апоптотических клеток измеряли с помощью аннексина V-FITC и двойного окрашивания PI и проточной цитометрии. Анализ клеток, обработанных 0 мкМ, 15 мкМ, 30 мкМ, 60 мкМ, 80 мкМ или 160 мкМЭхинакозидв течение 2 часов, 5 часов, 12 часов или 24 часов показали, что 60 мкМ или более высокие концентрацииЭхинакозидиндуцировали значительный апоптоз в раковых клетках MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 и SW480 (рис. 6А), но не в нераковых клетках L-O2, HEK 293 и Клетки NIH/3T3 (рис. S2). После обработки клеток MG-63 60 мкМ, 80 мкМ или 160 мкМЭхинакозидв течение 24 часов процент апоптотических клеток увеличился с 8,89% до 33,72%, 39,01% и 48,12% соответственно (фиг. 6А). Исследование с течением времени показало, что через 5 часов не было существенной разницы между группами, не получавшими лечения, и группами, получавшими лечение, но значительный апоптоз наблюдался после лечения эхинакозидом в концентрации 60 мкМ или выше в течение 12 часов (рис. 6B и S3).

Наконец, измерение потенциала митохондриальной мембраны с помощью флуоресцентного красителя JC-1 ясно показало заметную потерю потенциала митохондриальной мембраны после обработки 60 мкМЭхинакозидв течение 12 часов (рис. 6C), но не через 5 часов, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза после повреждений ДНК, вызванных повышенным содержанием 8-oxodG.

противораковыйи противовоспалительное действиецистанхе эхинакозид

Обсуждение

Эхинакозидэто природное соединение, выделенное из лекарственных растений цистанхе и эхинацеи.51,52 Было показано, что оно обладает разносторонними свойствами, способствующими укреплению здоровья и профилактике заболеваний, включая защиту нервной системы, гепатозащиту, противовоспалительное, антиусталостное, омолаживающее, антидиабетическое и противоопухолевое действия. 53–58 Наиболее известная и признанная биоактивностьЭхинакозидявляется его антиоксидантное действие и удаление АФК;44,45 однако было также показано, что он вызывает окислительные повреждения ДНК в раковых клетках, при этом основные механизмы остаются неясными.58 В настоящем исследовании с использованием высокопроизводительного скрининга in vitro анализ, мы обнаружили, чтоЭхинакозидэффективно ингибировал ферментативную реакцию, катализируемую МТГ1-. Увеличение количества фермента МТН1 уменьшало степень ингибирования, в то время как увеличение количества неорганической пирофосфатазы не влияло на ингибирование, что указывает на то, что эхинакозид специфически ингибирует активность МТН1 в анализе in vitro. Лечение различных линий раковых клеток человека эхинакозидом вызывало значительное повышение клеточного уровня 8-oxoG без изменения клеточного уровня АФК. Учитывая, что эхинакозид сам по себе является мощным антиоксидантом, эти результаты позволяют предположить, что повышенный внутриклеточный уровень 8-oxoG, вероятно, был результатом ингибирования клеточного MTH1 эхинакозидом.

Лечение сЭхинакозидвызывали обширные повреждения ДНК и значительную активацию блокатора G1/S-CDK р21, за которыми следовала заметная апоптотическая гибель клеток и подавление клеточной пролиферации, особенно в раковых, но не в нераковых клетках. Кроме того, заметная потеря потенциала митохондриальной мембраны после

Эхинакозидлечение указывало на активацию внутреннего пути апоптоза.Эхинакозид-Индуцированные повреждения ДНК и активация p21 наблюдались в течение 5 часов после начала лечения, в то время как апоптоз раковых клеток, нарушение потенциала митохондриальной мембраны и ингибирование роста наблюдались через 12 часов после начала лечения. Эти данные подтверждают, что апоптоз раковых клеток и ингибирование роста были результатом обширных повреждений ДНК, вызванных ингибированием MTH1. Недавние исследования показали, что уменьшение размера клеточного пула dNTP также может вызывать стресс репликации ДНК и повреждения ДНК. возможность уменьшения размера пула dNTP, и Bcl2, белок, который уменьшает размер пула dNTP,60 был значительно уменьшен в раковых клетках SW480, обработанных эхинакозидом;58 кроме того, наши данные ясно показали, что эхинакозид непосредственно ингибирует MTH1, что может быть частично ответственен за повреждения ДНК и клеточные эффекты, вызванные эхинакозидом.

Пул dNTP является важной мишенью для АФК, а окисленные dNTP являются важными источниками окислительных повреждений ДНК.3,10 SSB и DSB, связанные с репарацией ДНК, могут приводить к клеточному старению и апоптозу, которые связаны со старением и высокой степенью внутриопухолевого поражения. гетерогенность и высокая частота мутаций в раковых клетках. Напротив, ингибирование MTH1 нацелено на фенотип, который отличает большинство раковых клеток от нормальных клеток и, следовательно, представляет собой новую противораковую стратегию, не ограниченную генетическими адаптациями. Интересно, что низкомолекулярные антагонисты антиапоптозного белка Bcl266,67 и агонисты проапоптозного белка Bax68 были разработаны и продемонстрировали перспективность новых противоопухолевых средств. Учитывая их взаимодополняющие механизмы действия, объединение ингибиторов MTH1 и химических веществ, стимулирующих апоптоз, позволит создать захватывающее новое поколение противоопухолевых препаратов.

Впервые мы продемонстрировали новую функцию эхинакозида как противоракового природного соединения. В анализе in vitro эхинакозид ингибировал MTH1 с IC50 7,01 мкМ. Это значение IC50 выше, чем у ингибиторов MTH1, о которых сообщалось до сих пор.32,33,69 Используя (S)-кризотиниб в качестве положительного контроля, мы показали, что наш анализ в семь раз менее чувствителен, чем тот, который использовали Huber et al.33. Таким образом, , фактическая IC50 эхинакозида, вероятно, будет ниже. Тем не менее, чтобы разработать его в качестве терапевтического средства, вероятно, потребуется повысить эффективность природной молекулы эхинакозида. Как натуральный продукт, который долгое время использовался в качестве растительного лекарственного средства, эхинакозид может служить хорошим химическим каркасом для разработки эффективных и, возможно, безопасных ингибиторов MTH1.37,70 Учитывая, что натуральные продукты являются богатым источником новых химических каркасов. для разработки лекарств на основе рациональной структуры70 подходы, подобные тем, которые мы использовали здесь,

вместе с огромным интересом к натуральным продуктам для открытия лекарств, будет полезно в поиске целевых, эффективных и безопасных новых лекарств.

Цистанхеэхинакозидимеетпротивораковыйи иммуностимулирующий эффект