Часть 1: Эхинакозид ингибирует высвобождение глутамата, подавляя вход Са2 плюс, зависящий от напряжения, и протеинкиназу С в окончаниях цереброкортикальных нервов крысы.

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Ченг Вей Лу 1,2, Цзы Ю Линь 1,2, Шу Куэй Хуан 1 и Су Джейн Ван 3,*

Абстрактный:

Глутаматергическая система может быть вовлечена в эффекты нейропротекторной терапии.Эхинакозид, фенилэтаноидный гликозид, извлеченный из лекарственного китайского растенияХерба Цистанхе, оказывает нейропротекторное действие. В этом исследовании изучалось влияниеэхинакозидна 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата в нервных окончаниях (синаптосомах) головного мозга крысы. Эхинакозид ингибировал Са2+-зависимое, но не Са2+-независимое 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата зависимым от концентрации образом. Эхинакозид также снижал вызванное 4-аминопиридином увеличение концентрации цитоплазматического свободного Са2 плюс, но не изменял потенциал синаптосомной мембраны. Ингибирующее действие эхинакозида на 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата предотвращалось с помощью о-конотоксина MVIIC, блокатора широкого спектра действия каналов Cav2.2 (N-тип) и Cav2.1 (P/Q-тип). , но был нечувствителен к внутриклеточным ингибиторам высвобождения Ca2+ дантролену и 7-хлор-5-(2-хлорфенил)-1,5-дигидро-4 ,1-бензодиазепин-2(3H)-он (CGP37157). Кроме того, эхинакозид уменьшал 4-индуцированное аминопиридином фосфорилирование протеинкиназы С, а ингибиторы протеинкиназы С устраняли эффект эхинакозида на высвобождение глутамата. В соответствии с этими результатами мы предполагаем, что ингибирующее действие эхинакозида на вызванное высвобождение глутамата связано с уменьшением входа Ca2 plus, зависящего от напряжения, и последующим подавлением активности протеинкиназы C.

Ключевые слова:эхинакозид; высвобождение глутамата; цереброкортикальные нервные окончания; потенциалзависимые каналы Ca2 Plus; протеинкиназа С

1. Введение

Эхинакозидявляется основным фенилэтаноидным гликозидом, присутствующим вХербаЦистанхе, хорошо известная традиционная китайская медицина, используемая для лечения забывчивости, импотенции и хронических запоров [1].Эхинакозидобладает различной биологической активностью, такой как антиоксидантная, противовоспалительная, противораковая, гепатозащитная и иммуномодулирующая [2–4]. Примечательно, что эхинакозид обладает нейропротекторным действием; например, он может защищать от нейротоксичности, вызванной окислительным стрессом или нейротоксином, в первичных нейронах коры головного мозга крыс, клетках нейробластомы SH-SY5Y человека и клетках феохромоцитомы (PC12) [5–8]. Кроме того, эхинакозид ослабляет повреждение головного мозга и улучшает когнитивные функции в животных моделях болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и окклюзии средней мозговой артерии [9-12]. Однако механизм, с помощью которогоэхинакозидиндуцирует нейропротекцию, до конца не изучено.

Нейропротекция представляет собой сложный процесс сохранения структуры и функции нейронов при токсических повреждениях. Снижение эксайтотоксичности глутамата считается потенциальным механизмом нейропротекции головного мозга. Глутамат, нейромедиатор возбуждающих аминокислот, играет решающую роль в нескольких функциях мозга [13]. Однако чрезмерная активация глутаматных рецепторов при высоких концентрациях глутамата вызывает внутриклеточную перегрузку Ca2 плюс, митохондриальную дисфункцию, образование свободных радикалов и гибель нейронов [14,15]. Этот патологический процесс связан с многочисленными нарушениями головного мозга, включая церебральную ишемию, черепно-мозговую травму, эпилепсию и нейродегенеративные заболевания [16,17]. Следовательно, ингибиторы, блокирующие патофизиологическую глутаматергическую передачу, считаются потенциальными нейропротекторными препаратами. Яркими примерами из них являются антагонисты глутаматных рецепторов [18,19]; однако клинические испытания этих препаратов потерпели неудачу из-за меньшей эффективности и нежелательных или даже цитотоксических побочных эффектов [20,21]. В дополнение к прямой блокаде рецепторов глутамата ингибирование высвобождения глутамата может быть эффективной стратегией нейропротекции. Некоторые нейропротекторы (например, мемантин и рилузол) могут снижать высвобождение глутамата в тканях мозга крыс [22–24].

Принимая во внимание роль глутамата в эксайтотоксичности и нейропротекторный профиль эхинакозида, в настоящем исследовании использовали изолированные нервные окончания (синаптосомы), очищенные от коры головного мозга крыс, для изучения влияния эхинакозида на высвобождение глутамата и дальнейшего изучения потенциальных механизмов. Препарат изолированного нервного окончания является хорошо зарекомендовавшей себя моделью для изучения пресинаптической регуляции высвобождения нейротрансмиттеров лекарственными препаратами в отсутствие каких-либо постсинаптических эффектов [25]. Используя эту модель, мы оценили влияние эхинакозида на высвобождение глутамата, мембранный потенциал, пресинаптический приток Са2+ и активность протеинкиназы С. Согласно нашему обзору литературы, это первое сообщение, документирующее механизм, посредством которого эхинакозид ингибирует высвобождение эндогенного глутамата на пресинаптическом уровне.

2. Результаты

2.1. ЭхинакозидИнгибирует 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата из окончаний цереброкортикального нерва крысы путем уменьшения везикулярного экзоцитоза

Рисунок 1 иллюстрирует зависящее от концентрации действие эхинакозида на 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата из очищенных синаптосом головного мозга крысы. В синаптосомах, инкубированных с 1 мМ CaCl2, 1 мМ 4-аминопиридин вызывал высвобождение глутамата 7,4 ± {{1{{2{0}}}}},1 нмоль/мг/5 мин, которое снижалось. 1, 5, 10, 30 и 50 мкМ эхинакозида до 6,5 ± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,

4,1 ± 0,1 или 2,3 ± 0,4 нмоль/мг/5 мин соответственно (F(5,24)=67,1, p=0. 000). Значение IC50 для опосредованного эхинакозидом ингибирования 4-вызванного аминопиридином высвобождения глутамата, полученное по кривой доза-реакция, составляло 24 мкМ. Кроме того, высвобождение глутамата, вызванное 1 мМ 4-аминопиридином во внеклеточном растворе, не содержащем Ca2 plus, содержащем 300 мкМ этиленгликоль-бис(-аминоэтилового эфира)-N,N,N/,N/-тетрауксусной кислоты (EGTA) составил 2,1 0,2 нмоль/мг/5 мин (F(2,12)=310,65, p=0.000),

и этот Са2-плюс-независимый компонент высвобождения глутамата, вызванного 4-аминопиридином, не подвергался влиянию 20 мкМ эхинакозида (1,8 ± 0,2 нмоль/мг/5 мин; p {{1 0}}.58; рис. 1). В синаптосомах, обработанных 0,1 мкМ бафиломицина А1, ингибитора везикулярного транспортера [26], 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата значительно снижалось (2,2 ± 0,2 нмоль/мг/мг). 5 мин; F (2,12)=249.518, p=0.000). В присутствии бафиломицина А1 20 мкМ эхинакозида не вызывали значительного ингибирования высвобождения глутамата (2,1 ± 0,2 нмоль/мг/5 мин; p=0,94; рис. 1). Напротив, 10 мкМ DL-трео-бета-бензилоксиаспартата (DL-TBOA, ингибитор обратного захвата глутамата) [27] увеличивали 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата до 11,8 ± 0,4 нмоль/мг/5 мин. т(8)=-11.31, р=0.000). Даже в присутствии DL-TBOA 20 мкМ эхинакозида значительно ингибировали 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата (7,7 ± 0,2 нмоль/мг/5 мин; F(2,12)=87.23, p=0.000; рис. 1).

2.2 Эхинакозид снижает концентрацию цитозольного Са2 плюс, но не изменяет потенциал синаптосомной мембраны

Деполяризация синаптосом, вызванная 1 мМ 4-аминопиридином, увеличивала концентрацию Са2 плюс (p=0.000; таблица 1). Применение 20 мкМ эхинакозида существенно не влияло на базальную концентрацию Са2 плюс (t(8)=0,06, p=0,95), но значительно снижало 4-индуцированное аминопиридином увеличение Са2 плюс концентрация (t(10)=6.16, p=0.000). Кроме того, 1 мМ 4-аминопиридин увеличивал флуоресценцию 3',3',3'-дипропилтиадикарбоцианина иодида [DiSC3(5)] (p=0.000). Добавление 20 мкМ эхинакозида не изменяет мембранный потенциал покоя (t(8)=0,976, p=0,36) и существенно не изменяет 4-аминопиридин-опосредованное увеличение DiSC3. (5) флуоресценция (t(8)=-0,014, p=0,99; табл. 1).

2.3 Снижение поступления Са2 плюс приток через каналы Cav2.2 (N-тип) и Cav2.1 (P/Q-тип) может быть связано с ингибированием 4-вызванного аминопиридином высвобождения глутамата эхинакозидом

На рис. 2 показано, что 2 мкМ о-конотоксина MVIIC, блокатора Са2 плюс каналов N- и P/Q-типа, снижали 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата с 7,4 ± {{10}}. от 2 до 2.0 ± 0.1 нмоль/мг/5 мин (t(9)=25.35, p=0.000). В присутствии о-конотоксина MVIIC влияние 20 мкМ эхинакозида на 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата было незначительным (1,8 2± плюс 0,2 нмоль/мг/5 мин; t(8)=1.06,стр=0.32). Дантролен (10 мкМ), ингибитор высвобождения внутриклеточного кальция из эндоплазматического

reticulum [28], сниженное 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата (5,6 ± 0,3 нмоль/мг/5 мин; F(2,14) {{10}}}. 95, стр=0.000). Однако в присутствии дантролена 20 мкМ эхинакозида все еще могут значительно ингибировать высвобождение глутамата (3,3 ± 0,2 нмоль/мг/5 мин; p=0.000). Аналогичные результаты были получены при использовании 100 мкМ 7-хлор-5-(2-хлорофен)-1,5-дигидро-4,1-бензотиазепина. -2(3H)-он (CGP37157), мембранопроницаемый блокатор митохондриального обмена Na+/Ca2+. В пяти исследованных синаптосомных препаратах 20 мкМ эхинакозида в сочетании со 100 мкМ CGP37157 снижали 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата на 48,3% ± 5,2% (F(2,13) ​​= 136.79, p {{ 49}}.000), подобно ингибированию только эхинакозидом (46,2% ± 2,3%; p=0,89; рис. 2).

2.4 ЭхинакозидИнгибирует 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата путем передачи сигнала через протеинкиназу C

Как показано на рисунке 3, 10 мкМ 2-[1-(3-диметиламинопропил)индол-3-ил]-3-(индол-3-ил)малеимид (GF109203X), общий ингибитор протеинкиназы C [29], снижает 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата (F(2,13) ​​= 19.46, p=0.{{17 }}). В синаптосомах, обработанных GF109203X, 20 мкМ эхинакозида снижали 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата только на 5,5% ± 1,8% (p=0,89), меньше, чем при применении только эхинакозида (42,4% ± 2,3%). процентов ; p=0.000). Аналогичные результаты были получены с 5,6,7,13-тетрагидро-13-метил-5-оксо-12H-индоло[2,3-a]пирроло[3]. ,4-c]карбазол-12-пропаннитрил (Go6976), селективный в отношении изоформ Ca2 plus-зависимой протеинкиназы C ( , I, II, y) [29]. В присутствии 3 мкМ Go6976 20 мкМ эхинакозида снижали высвобождение глутамата на 11,9% ± 2,9% (p=0.59), что свидетельствует о значительном снижении по сравнению с одним только эхинакозидом (42,4% 2,3%; p {{ 65}}.000; рис. 3). Напротив, 3 мкМ роттлерина, Са2+-независимого ингибитора протеинкиназы С6 [30], не влиял существенно на высвобождение глутамата, вызванное 4-аминопиридином (1 мМ) (p=0.45). Тем не менее, в присутствии роттлерина 20 мкМ эхинакозида эффективно вызывали ингибирование высвобождения в среднем на 37,1% ± 5,6% (F(2,13) ​​= 19.72, p=0.{{88 }}), как и при применении только эхинакозида (стр=0.41; рис. 3). Кроме того, ингибитор митоген-активируемой протеинкиназы 2-(2-амино-3-метоксифенил)-4H-1-бензопиран-4-он) (PD98059 ) (50 мкМ) и ингибитор протеинкиназы А N-[2-(п-бромциннамино)этил]-5-изохинолинсульфонамид (H89) (100 мкМ) снижают 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата (стр=0.000). Даже в присутствии PD98059 или H89 20 мкМ эхинакозида эффективно снижали высвобождение (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000; рис. 3).

На рис. 4 показано, что 1 мМ 4-аминопиридин увеличивает фосфорилирование протеинкиназы С в синаптосомах (t(4)=-6,871, p=0,002). Когда синаптосомы были предварительно обработаны 20 мкМ эхинакозида в течение 10 минут перед добавлением 4-аминопиридина, 4-аминопиридин-индуцированное фосфорилирование протеинкиназы С значительно уменьшилось (F(2,6)=29.202 , стр=0.001).

2.5 Опосредованное эхинакозидом ингибирование высвобождения глутамата не затрагивает рецептор гамма-аминомасляной кислоты типа А (ГАМКА)

На рисунке 5 сравнивалось влияние эхинакозида на 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата в отсутствие или в присутствии SR95531 (антагониста рецептора ГАМК). Кроме того, 100 мкМ SR95531 не оказывали существенного влияния на высвобождение глутамата, вызванное 4-аминопиридином (1 мМ). В синаптосомах, обработанных SR 95531-, применение 20 мкМ эхинакозида привело к 43-процентному ингибированию 4-вызванного аминопиридином высвобождения глутамата (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), что существенно не отличалось от ингибирования, вызываемого одним эхинакозидом (40 процентов; p=0.000). Аналогичный результат был получен с другим антагонистом ГАМКА-рецепторов, бикукуллином (50 мкМ). Высвобождение, измеренное в присутствии бикукуллина и эхинакозида, значительно отличалось от полученного в присутствии одного бикукуллина (p=0. 000).

3. Обсуждение

В этом исследовании,эхинакозид, активное соединение в HerbaЦистанхеингибировал 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата в нервных окончаниях коры головного мозга крыс. Возможные основные механизмыэхинакозидопосредованное ингибирование высвобождения глутамата дополнительно исследуется и обсуждается здесь.

3.1 Механизмы, лежащие в основе опосредованного эхинакозидом ингибирования высвобождения глутамата

Высвобождение глутамата, вызванное 4-аминопиридином, состоит из двух компонентов: физиологически релевантного Ca2+-зависимого компонента, который образуется в результате экзоцитоза синаптических пузырьков, содержащих глутамат; и Са2+-независимый компонент, который возникает в результате длительной деполяризации, вызывающей опосредованный мембранным потенциалом сдвиг стационарного состояния переносчика глутамата в направлении наружу, таким образом влияя на цитозольный отток глутамата [31]. Здесь мы наблюдали, что эхинакозид не ингибировал значительно 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата в присутствии среды, не содержащей Ca2+ (Ca2+-независимое высвобождение). Кроме того, наблюдаемое эхинакозид-опосредованное ингибирование 4-вызванного аминопиридином высвобождения глутамата было эффективно предотвращено бафиломицином А1 (который истощает содержание глутамата в синаптических везикулах), но не DL-TBOA (который неселективно ингибирует все возбуждающие аминокислоты). транспортные подтипы). Эти результаты свидетельствуют о том, что эхинакозид влияет на Са2+-зависимый экзоцитоз высвобождения глутамата, не влияя на Са2+-независимый цитозольный выброс глутамата посредством инверсии транспортера глутамата плазматической мембраны нервных окончаний. В синаптических окончаниях ингибирование Na плюс каналов или активация K плюс каналов стабилизирует возбудимость мембраны и, следовательно, уменьшает вызванное вход Ca2 plus и высвобождение нейротрансмиттера [32,33]. Следовательно, потенциальный механизм, лежащий в основе ингибирования высвобождения глутамата, опосредованного эхинакозидом, включает снижение синаптосомной возбудимости. Однако эта возможность несостоятельна на основании двух наблюдений: (1) 4-вызванная аминопиридином деполяризация мембранного потенциала, измеренная с помощью чувствительного к мембранному потенциалу красителя DiSC3(5), не влияла на добавление эхинакозида; и (2) эхинакозид не влиял на 4-вызванное аминопиридином высвобождение Са2 плюс -независимое глутамата, компонент высвобождения, который зависит только от мембранного потенциала [31]. Если эффект не обусловлен подавлением синаптосомной возбудимости, то он может проявляться снижением активности Cav2.2 (N-типа) и Cav2.1 (P/Q-типа) Са2-плюс-каналов в сочетании с глутаматным экзоцитозом в нервные окончания [34–36]. Используя фура-2, мы продемонстрировали, что эхинакозид значительно снижает 4-вызванное аминопиридином повышение концентрации Са2+. Кроме того, наши данные показывают, что ингибирующее действие эхинакозида на 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата снизилось с 42,4 % 2,3 % до 12,1 % 3,9 % после воздействия блокатора Cav2.2 (N-типа) и Cav2. .1 (P/Q-тип) Ca2 плюс каналы. Кроме того, мы наблюдали, что эхинакозид продолжал значительно ингибировать 4-вызванное аминопиридином высвобождение глутамата в присутствии внутриклеточных ингибиторов высвобождения Са2. Эти результаты показывают, что одновременное подавление активности Cav2.2 (N-типа) и Cav2.1 (P/Q-типа) Ca2 plus канала является потенциальным механизмом, лежащим в основе ингибирования высвобождения глутамата, опосредованного эхинакозидом. Однако комбинированная активация Cav2.2 (N-типа) и Cav2.1 (P/Q-типа) Ca2 плюс активность канала не могла полностью блокировать действие эхинакозида. Следовательно, в торможение могут быть вовлечены другие неустановленные типы каналов Са2+ или другие пресинаптические пути. Например, ГАМК-рецепторы присутствуют на пресинаптическом уровне, и было показано, что их активация ингибирует приток Са2+ и высвобождение глутамата [37]. В настоящем исследовании антагонисты ГАМКА-рецепторов SR95531 и бикукулин не блокировали опосредованное эхинакозидом ингибирование высвобождения глутамата, что свидетельствует о том, что ГАМКА-рецепторы не участвуют в снижении потенциал-зависимой активности Са2+-каналов и в последующем ингибировании высвобождения глутамата. Проникновение Ca2 plus через потенциал-зависимые каналы Ca2 plus активирует несколько протеинкиназ, связанных с высвобождением глутамата в нервных окончаниях, включая митоген-активируемую протеинкиназу, протеинкиназу C и протеинкиназу A. Здесь мы демонстрируем, что ингибиторы протеинкиназы C эффективно противодействовали эхинакозиду. -опосредованное ингибирование высвобождения глутамата; тем не менее, ингибитор митоген-активируемой протеинкиназы PD98059 или ингибитор протеинкиназы А Н89 оказались неэффективными. Кроме того, 4-индуцированное аминопиридином фосфорилирование протеинкиназы С уменьшалось в синаптосомах после предварительной обработки эхинакозидом в концентрации, эффективной для ингибирования высвобождения глутамата. Следовательно, сигнальный путь ингибирования высвобождения глутамата, опосредованного эхинакозидом, может включать протеинкиназу С. Протеинкиназа С является важной внутриклеточной сигнальной системой, которая присутствует на пресинаптическом уровне и играет решающую роль в экзоцитозе нейромедиаторов. Напр., некоторые синаптические белки, участвующие в перевозке или рекрутировании синаптических пузырьков и экзоцитозе, такие как миристоилированный богатый аланином субстрат киназы С, фосфорилируются протеинкиназой С [38,39]. Этот процесс фосфорилирования может быть усилен деполяризационно-стимулированным входом Ca2 plus, что способствует высвобождению глутамата [40]. Следовательно, мы можем разумно предположить, что наблюдаемый здесь ингибирующий эффект эхинакозида на вход Ca2 plus может снизить активность протеинкиназы C и, следовательно, высвобождение глутамата.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы перейти к части 2