Часть 1: Создание параллельной экспериментальной модели остеопороза в сочетании с болезнью Альцгеймера у крыс и двойного действия эхинакозида и актеозида из Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
И Чен, Ин-Ци Ли, Цзя-И Фанг, Пинг Ли, Фей Ли
АННОТАЦИЯ
Этнофармакологическая значимость: Цистанхе трубчатаяэто драгоценная традиционная китайская медицина, которая широко используется в лечении остеопороза иБолезнь Альцгеймера. Эхинакозиди актеозид являются основными активными компонентами Cistanche tubulosa, обладающими фармакологической активностью, имеющей научное значение. Сообщалось, что эхинакозид иактеозидможет улучшить способность к обучению и памяти, способствовать пролиферации и дифференциации остеобластов. Цель исследования: Эхинакозид и актеозид изЦистанхе трубчатаяпродемонстрировали значительную активность против остеопороза и болезни Альцгеймера, хотя эти эффекты не изучались одновременно на крысиной модели. Целью данного исследования было создание и верификация модели остеопороза в сочетании сБолезнь Альцгеймерана крысах и исследовать двойное действиеэхинакозиди актеозид на этой параллельной модели.
Материалы и методы:Одновременно были созданы три модельные группы овариэктомии (OVX), ложной операции с D-галактозой и AlCl3 (D), овариэктомии с D-галактозой и AlCl3 (OVX плюс D). Крысам в группах медикаментозного лечения проводили овариэктомию. При проведении внутрибрюшинного введения D-галактозы и внутрижелудочного введения AlCl3 крысам групп медикаментозного лечения крысам перорально вводилиэхинакозид(90 мг/кг/сут),актеозид(90 мг/кг/сут) и препараты положительного контроля эстрадиола валерата (0,6 мг/кг/сут), донепезил HCl (0,8 мг/кг/сут) соответственно. После медикаментозного лечения в течение 8 недель сначала был проведен тест водного лабиринта Морриса (MWM) в течение 6 дней. Затем крыс умерщвляли для сбора крови, маток, бедер, голеней и тканей мозга. Сыворотку использовали для биохимических тестов. Матки использовали для гистоморфометрии. Правые бедра использовались для микро-КТи гистоморфометрии соответственно. Правая большеберцовая кость использовалась для биомеханического теста. Гиппокамп, собранный в холодильнике, использовали для биохимических тестов. Мозг 41, собранный путем перфузии, использовали для гистоморфометрии.
Полученные результаты:По сравнению с группой Sham группа OVX плюс D могла значительно снизить способность к обучению и памяти, вызывая окислительные повреждения, повреждая нейроны в гиппокампе и влияя на гидролиз и синтез ацетилхолина. Между тем активность BALP и TRAP в группе OVX плюс D значительно увеличилась (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">эхинакозида такжеактеозидтипичные патологические признаки остеопороза иБолезнь Альцгеймерабыли улучшены.
Выводы:Модель остеопороза в сочетании сБолезнь Альцгеймерау крыс было осуществимо и успешно установлено.Эхинакозиди актеозид также продемонстрировали значительное влияние на эту параллельную модель, и они могут быть потенциальными 56 кандидатами изЦистанхе трубчатаяс двойным эффектом для дальнейшего изучения.
Ключевые слова:остеопороз; Болезнь Альцгеймера; двойные эффекты; эхинакозид; актеозид; Цистанхе трубчатая
CТравы Istanche Lost Empire улучшают состояние при болезни Альцгеймера
1. Введение
Остеопороз — это дегенеративное заболевание костей, характеризующееся прогрессирующей потерей костной массы и разрушением микроархитектоники, что может повышать риск переломов при малой ломкости (Rachner et al., 2011).Болезнь Альцгеймера(AD) является распространенным нейродегенеративным заболеванием у пожилых людей, которое характеризуется непрерывным снижением умственных способностей, когнитивными нарушениями и потерей способности к самостоятельной жизни в клинических условиях (Reitz 76 et al., 2011). Образование сенильных бляшек, индуцированное отложением -амилоида, нейрофибриллярные клубки, вызванные гиперфосфорилированием тау, и дегенерация нейронов в головном мозге являются типичными патологическими признаками AD (Serrano-Pozo et al., 2011). Внешне ОП и АД представляют собой совершенно самостоятельные заболевания с различной патологией и клиническими особенностями. Однако в клинической практике часто наблюдается совместное развитие ОП и АД (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). Распространенность обоих заболеваний увеличивалась с возрастом, особенно у женщин в постменопаузе (Li et al., 2017; Stern, 2012). Все больше и больше данных указывают на то, что люди с диагнозом БА имеют повышенный риск ОП (Zhou et al., 2014).
Необходимо изучить и уточнить взаимосвязь между остеопорозом иБолезнь Альцгеймераin vitro и in vivo. Перед проведением исследований in vivo важно выбрать подходящие животные модели остеопороза или болезни Альцгеймера. Модель остеопороза может быть создана с помощью нескольких методов, таких как внутрижелудочное введение ретиноевой кислоты, хирургическая овариэктомия и внутримышечная инъекция глюкокортикоидов (Wei et al., 2007; Komori, 2015). В частности, модель постменопаузального остеопороза, индуцированная овариэктомией у крыс, была классической ишироко использовался в большинстве исследований (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).Спорадическая болезнь Альцгеймера является основным типом болезни Альцгеймера. Животноемодели спорадическихБолезнь Альцгеймерамогут быть вызваны различными методами, такими каквведение D-галактозы или -амилоид, внутрижелудочное введение AlCl3,и так далее(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). В дополнениеконъюнктивная модель болезни Альцгеймера, индуцированная длительным внутрибрюшинныминъекция D-галактозы в сочетании с овариэктомией также широко изучалась (Liuи др., 2010; Чжао и др., 2012). С целью выявления актуальности остеопороза иболезни Альцгеймера необходимо создание модели комбинированного остеопорозас болезнью Альцгеймера для изучения общих механизмов действия лекарств наостеопороз иболезнь Альцгеймераасе.
Цистанхе трубчатая(Schenk) Wight — паразитическое растение, которое в основном распространено в пустынях Северо-Западного Китая. Высушенные сочные стеблиЦистанхе трубчатая(CT) используются в качестве известного тонизирующего лекарства под названием Cistanches Herba с китайским названием Roucongrong в Китайской фармакопее (2015). Он был отмечен как «женьшень пустыни» и широко используется для лечения болей в пояснице и коленях, женского бесплодия и запоров в традиционной китайской медицине (Jiang and Tu, 2009). Основными активными компонентами ХТ являются фенилэтаноидные гликозиды (ФГ), эхинакозид (ЭХГ) иактеозид(ACT) являются репрезентативными соединениями в PhG (Morikawa et al., 2014). В частности, ЭХГ и АКТ обычно выбирают в качестве маркеров для контроля качества при КТ из-за их высокого содержания и различной фармакологической активности, такой как эффекты нейропротекции, защиты костей,
антиоксиданты, омолаживающие и улучшающие способность к обучению и памяти (Wang et al.,2012 г.; Ли и др., 2016). Однако влияние ЭХГ и АКТ на остеопорозв сочетании сБолезнь Альцгеймераеще не изучались вместе на крысиной модели.Таким образом, целью данного исследования было создание крысиной модели комбинированного остеопороза.с болезнью Альцгеймера и изучить влияниеэхинакозиди актеозид на этомпараллельной модели, чтобы предоставить экспериментальные данные для дальнейшего изучениямолекулярный механизм действия эхинакозида или актеозида в следующих исследованиях.
цистанхе фарма специальныйзаОБЪЯВЛЕНИЕ
2. Материалы и методы
2.1. Животные
Самки крыс Wistar в возрасте восьмидесяти 8-недель (номер сертификата: SCXK 2018-0006) весом 180–200 г были приобретены в китайско-британской лаборатории SIPPR/BK. Animal Ltd (Шанхай, Китай) и вырос в Экспериментальном центре фармацевтических животных Китайского фармацевтического университета.
2.2. Химикаты и реагенты
Хлоралгидрат, пенициллин G натрия, D-галактоза, гексагидрат хлорида алюминия, эстрадиола валерат, донепезил HCl были приобретены у Aladdin Industrial Corporation (Шанхай, Китай).Эхинакозид(ВЭЖХ 94%) получали от Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Чэнду, Китай).актеозид(ВЭЖХ 98%) приобретали у Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Баоцзи, Китай). Наборы для твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на костно-специфическую щелочную фосфатазу (BALP), тартрат-резистентную кислую фосфатазу (TRAP), супероксиддисмутазу (SOD), малональдегид (MDA), ацетилхолинэстеразу (AChE) и холин-ацетилтрансферазу (ChAT) приобретен у Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Универсальный фиксатор тканей был получен изChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Чэнду, Китай).
эхинакозид
2.3. Модели животных и лечение
Все эксперименты на животных были разрешены и контролировались Комитетом по этике животных Китайского фармацевтического университета. Крыс содержали при 12-часовом цикле свет/темнота в помещении с регулируемой температурой (22±2 градуса) и кормили стандартным гранулированным кормом и водопроводной водой.
После адаптации в течение одной недели модель остеопороза была получена путем проведения операции по удалению яичников (French et al., 2008). После завершения операции пенициллин G натрий однократно присыпали раневым швом для предотвращения инфекции. Затем крыс кормили обычным образом в течение трех недель. Согласно ссылке (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), модельБолезнь Альцгеймераможет быть индуцирован длительным внутрибрюшинным введением D-галактозы в сочетании с овариэктомией или длительным внутрижелудочным введением AlCl3. Изучить осуществимость модели остеопороза в сочетании с болезнью Альцгеймера, трех модельных групп овариэктомии (группа OVX), ложной операции с внутрибрюшинным введением 150 мг/кг/сут D-галактозы и внутрижелудочным введением 30 мг/кг/сут AlCl3. (группа D), в этом исследовании была проведена овариэктомия с внутрибрюшинным введением 150 мг/кг/сут D-галактозы и внутрижелудочным введением 30 мг/кг/сут AlCl3 (группа OVX плюс D).
Поэтому крыс случайным образом разделили на восемь групп (n{{0}} для каждой группы) через 3 недели и перорально лечили лекарствами в течение 8 недель: группа имитации; группа ОВКС; группа Д; OVX плюс группа D; группа лечения эстрадиола валератом (группа EV, OVX плюс D плюс 0,6 мг/кг/день эстрадиола валерата); группа лечения донепезилом HCl (группа DPZ, OVX плюс D плюс 0,8 мг/кг/день донепезила HCl);эхинакозидгруппа лечения (группа ECH, OVX плюс D плюс 90 мг/кг/день эхинакозида);актеозидгруппа лечения (группа ACT, OVX плюс D плюс 90 мг/кг/день актеозида). В соответствии с принципом преобразования эквивалентной дозы человека-крысы и дозой из соответствующей ссылки (Li et al., 2013; Gao et al., 2014) были приняты дозы для групп лекарственного лечения в этом исследовании.
Каждую неделю измеряли массу тела каждой крысы. После полного курса лечения препаратами в течение 8 недель впервые был проведен тест «Водный лабиринт Морриса» (МВМ) в течение 6 дней. После этого для сбора материалов забивали по 6 крыс из каждой группы. Крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 3,0 мл/кг 10-процентного хлоралгидрата и собирали кровь из брюшной аорты. Кровь помещали при комнатной температуре для свертывания и центрифугировали при 3500 об/мин в течение 10 мин. Сыворотку собирали в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл (NEST Biotechnology) и хранили при температуре -80 до использования для биохимических тестов. Затем собирали ткани матки, бедра, голени и головного мозга. Матки использовали для гистоморфометрии. Правые бедра были использованы для микро-КТ и гистоморфометрии соответственно. Правая большеберцовая кость использовалась для биомеханического теста. Гиппокамп, собранный в холодильнике, использовали для биохимических тестов. После этого другим трем крысам из каждой группы перфузировали из сердца физиологический раствор и универсальный фиксатор тканей для забора головного мозга для гистоморфометрии.
2.4. Тест водного лабиринта Морриса (MWM)
Крыс подвергали обучению пространственным ориентирам и тестированию памяти в тесте MWM через 8 недель вмешательства. Тест MWM был проведен в соответствии с методами, о которых сообщалось ранее (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Вкратце, 5 дней подряд с четырьмя испытаниями в день крыс обучали использовать различные визуальные сигналы, расположенные на стенке бассейна, для нахождения скрытой погруженной платформы (диаметр 11 см, высота 29 см) в круглом бассейне (диаметр 130 см, высота 29 см). высота 50 см) наполнен нетоксичными угольными чернилами, подкрашенными водой. Бассейн мысленно был разделен на четыре квадранта, а на пересечении квадрантов располагались четыре стартовые позиции. Платформа располагалась в центре одного из квадрантов и во время испытаний ее положение было постоянным. В каждом испытании крыс размещали случайным образом в выбранных местах, лицом к стенке бассейна. Каждое испытание прекращали, когда крыса достигала платформы или через 60 с, и прошедшее время регистрировали как латентный период избегания. Крыс, не достигших платформы, направляли на нее. После каждого испытания со скрытой платформой крыса оставалась на платформе в течение 10 с. По результатам обучения рассчитывали среднее латентное время четырех попыток в день. На 6-й день всех крыс подвергали пробному испытанию, в ходе которого они плавали в течение 60 с в бассейне без платформы. В качестве окончательных результатов были записаны времена пересечения в месте расположения платформы и время в пути в целевом квадранте. За крысами наблюдали с помощью камеры, установленной на потолке прямо над бассейном, и все испытания регистрировались и анализировались с использованием программы MORRIS MAZE, предоставленной компанией Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Пекин, Китай).
2.5. Биохимический тест ИФА
В соответствии с инструкциями производителя наборов ELISA, активность костно-специфической щелочной фосфатазы (BALP), активность тартрат-резистентной кислой фосфатазы (TRAP), активность супероксиддисмутазы (SOD) и содержание малонового диальдегида (MDA) в сыворотке были протестированы компанией BioTek Synergy. 2 многорежимный микропланшет-ридер (BioTek, США). Ткани гиппокампа из каждой группы промывали PBS ({4}},01 М, рН 7,4) для удаления крови или примесей, оставшихся на поверхности ткани. Ткани гиппокампа с одной стороны взвешивали, а затем разрезали на кусочки как можно меньшего размера. Ткани гиппокампа гомогенизировали в соотношении 1:9 (масса ткани: объем PBS). Гомогенат центрифугировали при 4 градусах, 3000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант собирали и разбавляли для измерения концентрации белка методом ВСА. Затем методами ИФА определяли активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ), активность холин-ацетилтрансферазы (ХАТ), активность супероксиддисмутазы (СОД) и содержание малонового диальдегида (МДА) в ткани гиппокампа.
2.6. Гистоморфометрия гиппокампа
Ткани головного мозга (n=3/группа) фиксировали в универсальном фиксаторе тканей. Затем образцы мозговой ткани промывали, обезвоживали этанолом в градиенте, заливали парафином и нарезали на коронарные срезы размером 5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (ГЭ). После этого коронарные срезы тканей головного мозга фотографировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Nikon, Япония). Особенно наблюдались морфологические изменения СА1, СА2, СА3 и ДГ в гиппокампе.
2.7. Маточная гистоморфометрия и морфометрия
Отобранные матки (n{{0}}/группа) фиксировали универсальным фиксатором тканей. Затем образцы ткани матки промывали, обезвоживали градиентным этанолом, заливали парафином и нарезали на поперечные срезы толщиной 5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (ГЭ). Поперечные срезы матки осматривали и фотографировали. Произвольно выбирали пять полей зрения, затем измеряли диаметр поперечного среза матки и толщину эпителия слизистой оболочки матки с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus 6.0. Также подсчитывали количество маточных желез в собственной пластинке матки.
2.8. Микро-КТ
Отобранные правые бедра (n=3/группа) сканировались в положении с расстоянием от объекта до источника 121 мм и расстоянием от камеры до источника 171 мм с использованием SkyScan 1176 micro X- лучевая компьютерная томография (микро-КТ) сканер (Bruker, Германия). В качестве эталонной поверхности была выбрана дистальная пластинка роста. На расстоянии 1 мм ниже эталонной поверхности в качестве интересующего объема была выбрана область толщиной 1,8 мм (VOI, 100 слоев). Полученные изображения в градациях серого имели размер пикселя 17,76 мкм из реконструкции кости (65 кВ, 385 мкА). Для выделения трабекул из кортикальной кости использовали полуавтоматический метод контурирования. Для оценки процента объема кости (BV/TV), поверхностной плотности кости (BS/TV), трабекулярного разделения (Tb. Sp), трабекулярного числа (Tb. N), трабекулярной толщины (Tb. Th) использовались методы прямого 3D-измерения. , индекс структурной модели (SMI), фактор трабекулярного паттерна (Tb. Pd) и среднюю минеральную плотность кости (среднее значение BMD) для одного и того же VOI с использованиемКТПрограмма-анализатор (Bruker, Германия). 3D-визуализацию VOI с использованием алгоритма адаптивного рендеринга выполняли с помощью программного обеспечения CTvol (Bruker, Германия).
экстракт растения цистанхе
2.9. Костная гистоморфометрия
Отобранные правые бедра (n=3/группа) были зафиксированы в универсальном фиксаторе тканей, а затем декальцинированы в растворе 10% ЭДТА-2Na в течение 3 недель. Декальцинированные образцы промывали, обезвоживали градиентным этанолом, заливали парафином и разрезали на продольные срезы толщиной 5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (ГЭ). Продольные срезы бедер фотографировали. Наблюдались структуры костной ткани каждой группы, особенно трабекулярные структуры кости.
2.10. Биомеханический тест
Правые голени (n=4/группа), выбранные случайным образом, оценивали для теста на трехточечный изгиб с использованием универсальной испытательной машины (SHIMADZU, Япония). Диаметры этих образцов измерялись штангенциркулем в диапазоне 2,16-2,38 мм (г). Затем образец помещали на две опорные перекладины с расстоянием 25 мм (L) между двумя перекладинами, при этом физиологическая кривизна образца была направлена вверх. Нагружающий стержень груза располагался в центре образца и падал с постоянной скоростью 1,5 мм/мин до разрушения образца. Данные о силе (F) и смещении автоматически записывались в компьютер, который был подключен к испытательной машине, и одновременно строилась кривая нагрузка-деформация. Значения максимальной нагрузки (Н) и поглощения энергии (мДж) регистрировались с помощью программного обеспечения для испытаний материалов TRAPEZIUM X одновременно. Значения максимального напряжения (МПа) рассчитывали по следующей формуле: Напряжение (σ)=изгибающий момент (М) / коэффициент сечения (Z)=(8×L×F) / ( π×d3 )
2.11. статистический анализ
Результаты модельных групп сравнивали с имитационной группой, а результаты групп, получавших лекарственное средство, сравнивали с группой, получавшей OVX плюс D. Данные были проанализированы с использованием одностороннего дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Бонферрони с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism 5.0. Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение, а значения P менее 0,05 считались статистически значимыми.
мирицетина такжецистанхе
