Часть 1. Профилактическое действие фенилэтанолгликозидов из Cistanche Tubulosa на фиброз печени, вызванный альбумином бычьей сыворотки, у крыс

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Абстрактный

Фон:Цистанхе трубчатая это традиционное китайское растительное лекарственное средство, которое широко используется для регулирования иммунитета.Фенилэтанолгликозиды из цистанхе(CPhG) из этого растения являются в первую очередь эффективными материалами. Цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить профилактические и терапевтические эффекты CPhG на BSA-индуцированный фиброз печени у крыс и связанные молекулярные механизмы с участием звездчатых клеток печени. Biejiarangan (BJRG), другое традиционное китайское растительное лекарственное средство, использовали в качестве положительного контроля. Методы: в экспериментах in vivo 75 крыс SD были случайным образом разделены на 6 групп: нормальные (обработанные дистиллированной водой), модельные (обработанные БСА), положительные препараты (обработанные БСА плюс BJRG 60{{29} } мг/кг/день) и группы, получавшие БСА плюс CPhG (125, 250 и 500 мг/кг/день). Показатели печени и селезенки, сывороточные уровни аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), гексадеценовой кислоты (ГК), ламинина (ЛН), проколлагена III типа (ПКIII), коллагена IV типа (IV-C), гидроксипролина ( Hyp) и трансформирующий фактор роста 1 (TGF- 1) измеряли в печени крыс. Гистопатологические степени фиброза печени оценивали для каждой группы с использованием окраски H&E и трихромом по Массону. Экспрессию TGF- 1, коллагена I (Col-I) и коллагена III (Col-III) определяли методом иммуногистохимического окрашивания. Эти эффекты были дополнительно оценены in vitro путем определения уровней экспрессии NF-κB p65 и Col-I с помощью количественного анализа ПЦР в реальном времени. Экспрессию белка Col-I также исследовали вестерн-блоттингом. Результаты: все группы доз (125, 250 и 500 мг/кг/день) CPhG значительно снижали индексы печени и селезенки, снижали уровни АЛТ, АСТ, ГК, ЛН, PCIII, IV-C в сыворотке крови, Содержание TGF- 1 (P <0,01, p=""><0,01 и="" p=""><0,01) и="" содержание="" hyp.="" cphg="" также="" заметно="" уменьшали="" отек="" клеток="" печени="" и="" эффективно="" предотвращали="" некроз="" гепатоцитов="" и="" инфильтрацию="" воспалительных="" клеток.="" иммуногистохимические="" результаты="" показали,="" что="" cphg="" значительно="" снижали="" экспрессию="" tgf-="" 1="" (p=""><0,01, p=""><0,01 и="" p=""><0,01), col-i="" и="" col-iii.="" влияние="" cphg="" (100,="" 75,="" 50="" и="" 25="" мкг/мл)="" на="" hsc-t6="" in="" vitro="" показало,="" что="" cphg="" значительно="" снижают="" экспрессию="" мрнк="" nf-kb="" p65="" и="" col-i,="" а="" cphg="" также="" подавляют="" экспрессию="" белка="" col-i.="" выводы:="" кфг="" обладают="" выраженным="" антифиброзным="" действием="" и="" могут="" быть="" использованы="" в="" качестве="" гепатопротекторных="" средств="" для="" лечения="" фиброза="">

Ключевые слова: фиброз печени, Cistanche tubulosa, фенилэтанолгликозид, хемокин БСА, профилактика и терапия.

Фон

Фиброз печени представляет собой реакцию заживления ран на тяжелое поражение печени, возникающее в патогенезе хронического гепатита, индуцированного различными факторами. Этими факторами являются вирусная инфекция, злоупотребление алкоголем, холестаз, метаболические и аутоиммунные заболевания [1–3]. Прогрессирующее накопление внеклеточного матрикса (ECM) и снижение ремоделирования нарушают нормальную архитектуру печени, что приводит к фиброзу печени [4]. Фиброз печени имеет решающее значение при хроническом заболевании печени и часто приводит к необратимому циррозу и канцерогенезу. В настоящее время не существует методов и эффективных препаратов для лечения фиброза печени. Поэтому необходимо срочно найти препарат против фиброза печени, который ослабит прогрессирование повреждения печени до фиброза и рака.Цистанхе трубчатаяW (семейство Orobanchaceae) — растение-паразит, широко распространенное в южной части Синьцзяна в Китае [5]. Люди обычно используют его для укрепления почек, питания крови, расслабления кишечника и замедления старения. Он официально внесен в Китайскую фармакопею [6]. C. Tubulosa содержит множество активных компонентов. Это включаетФенилэтанолгликозиды из цистанхе(CPhG), иридоиды и полисахариды. В качестве одного из многих активных компонентов вС. тубулозаCPhG продемонстрировали убедительные антиоксидантные, антиусталостные, нейропротекторные и противовоспалительные эффекты как в исследованиях in vivo, так и in vitro [7]. В последние годы сообщалось, что CPhG (Фенилэтанолгликозиды из цистанхе) обладают гепатопротекторным действием. Потенциальные механизмы, лежащие в основе этих эффектов, включают удаление свободных радикалов, защиту печеночных мембран, иммунорегуляцию, ингибирование апоптоза, ингибирование экспрессии HBsAg и HBeAg, ингибирование репликации ДНК HBV и другие [8–11]. Тем не менее, несколько исследований в литературе посвящены эффекту графики против фиброза печени. Таким образом, это исследование было направлено на изучение эффекта GPhC против фиброза печени с использованием модели фиброза печени, вызванного бычьим сывороточным альбумином (BSA) у крыс. Родственные молекулярные механизмы были исследованы в клетках HSC-T6.

Методы

Химикаты и реагенты

Набор Hydroxyproline (щелочной гидролиз) (лот: 20140616) был приобретен в Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Китай). Наборы для сэндвич-ИФА TGF- 1 для крыс (лот: 238240615) были приобретены у Lianke Biotech Co., Ltd. (Китай). Кроличье антитело против коллагена I (лот: 140619), кроличье антитело против коллагена III (лот: 980788 W) и кроличье антитело против TGF- 1 (лот: 140619) были предоставлены компанией Beijing Biosynchronous Biotechnology Co., ООО (Китай). В комплекте с нормальной овечьей сывороткой (рабочая жидкость) (лот: WP141214), PV-6000 (лот: WK141225) и набором DAB (лот: K136621D) были приобретены у компании Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Китай). . Обнаружение первичных антител проводили с использованием 2. раствора антител (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) и 2. раствора антител (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (партия: 272387), приобретенных у Invitrogen Company (США). ). Альбумин бычьей сыворотки (БСА) (лот: SLBG8239V) был приобретен у Sigma (США). Перед применением БСА готовили в концентрации 18 г/л в физиологическом растворе, бактерии удаляли фильтрованием и БСА хранили при 4°С. Неполный адъювант Фрейнда, содержащий 1 г липидов из овечьей шерсти (лот: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Китай), смешивали с 2 г жидкого парафина (лот: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Китай), стерилизовали в паровом автоклаве и хранили при 4°С. Положительный препарат BJRG был получен в виде таблеток Biejiarangan от Inner Монголии Furui Medical Science Co., Ltd. (Китай). Запасы препаратов BJRG готовили путем растворения Таблетки BJRG в дистиллированной воде в концентрации 600 мг/кг.

Растительные материалы

С. тубулоза(семейство Orobanchaceae) был приобретен в районе Минфэн в Синьцзяне, Китай. Материал был подтвержден исследователем Цзюнь Чжао из Ключевой лаборатории уйгурской медицины Института лекарственных веществ Синьцзяна. Образцы ваучеров были депонированы в Институте Материа Медика Синьцзяна.

Подготовка CPhG(Фенилэтанолгликозиды из цистанхе)

Сушеные и нарезанные корневищаС. тубулоза(6,0 кг) трижды последовательно экстрагировали с обратным холодильником 70% этанолом, растворитель удаляли с получением этанольного экстракта. Экстракты этанола очищали с использованием смолы AB-8 для получения гликозидов фенилэтанола (CPhG). Исходные растворы CPhG, используемые для различных дозовых групп в исследованиях на животных (500 мг/кг, 250 мг/кг и 125 мг/кг соответственно), растворяли в 0,5% (5 г/л) карбоксиметилцеллюлозы (натриевая соль).

Количественная оценка CPhG(Фенилэтанолгликозиды из цистанхе)

Содержание двух компонентов (эхинакозида и актеозида) в CPhG определяли с помощью ВЭЖХ с использованием ранее описанного метода (Zhang et al. 2004) [12]. ВЭЖХ выполняли с использованием ВЭЖХ Shimadzu LC-10A, оснащенного УФ-детектором. Колонка для ВЭЖХ представляла собой колонку Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 мм, 5 мкм). Изократическая подвижная фаза состояла из смеси метанол-ацетонитрил-1% уксусной кислоты (15:10:75, об./об./об.). Элюирование проводили в течение 40 мин, скорость потока поддерживали на уровне 0,6 мл/мин. Температуру колонки поддерживали постоянной на уровне 30 градусов. УФ-детектирование проводили при 334 нм.

Животные и клеточная линия HSC-T6

[Класс SPF] здоровые взрослые самцы крыс Sprague-Dawley (SD) (180–220 г) были приобретены в Центре животных Синьцзянского медицинского университета, лицензия №: SCXK (новая) 2011–0004. Крыс кормили кормом, не содержащим специфических патогенов (SPF). Все процедуры, связанные с экспериментами на животных, были одобрены Комитетом по этике животных Первой дочерней больницы Синьцзянского медицинского университета. Крыс содержали в клетках в контролируемых условиях окружающей среды (25 градусов и 12-часовой цикл свет/темнота) и имели свободный доступ к стандартному гранулированному корму для крыс и водопроводной воде. Крыс акклиматизировали перед лечением. Иммортализованную линию звездчатых клеток печени крысы, HSC-T6, получали от Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Ухань, Китай). Клетки HSC-T6 культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (с высоким содержанием глюкозы) (DMEM, Пекин, Китай) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco, Южная Америка), 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Пекин). , Китай) во влажном инкубаторе при 37 градусах с 5-процентным содержанием СО2.

BSA-индуцированное повреждение печени и лечение

Семьдесят пять крыс SD были случайным образом разделены на шесть групп: нормальные (обработанные дистиллированной водой), модельные (обработанные БСА), положительные на препарат (обработанные БСА плюс BJRG 600 мг/кг/день) и обработанные БСА плюс CPhG.(Фенилэтанолгликозиды из цистанхе)(125, 250, 5{{20}}0 мг/кг/день). В группах, получавших БСА плюс CPhG (125, 250, 5 00 мг/кг/день), было по 13 крыс в каждой группе, а в другой группе - по 12 крыс в каждой группе. Модель повреждения печени, вызванного БСА, делится на первичную сенсибилизацию, за которой следует иммунологическая атака) [13]. За исключением нормальной группы, другим группам вводили многократные подкожные инъекции 0,5 мл (9 мг/мл) неполного адъюванта Фрейнда BSA на 1-й, 15-й, 22-й, 29-й и 36-й день для первичной сенсибилизации. Через семь дней после пятой инъекции кровь брали через венозное сплетение сетчатки крысы и тестировали на антитела к сывороточному альбумину. Антитела к БСА в сыворотке крови крыс выявляли методом двойной диффузии в агар. Инъекцию атаки осуществляли путем введения 0,4 мл BSA в физиологическом растворе через хвостовую вену BSA-позитивным антителам крысам два раза в неделю по десять раз. Концентрации и время инъекций: 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 и 10.00. г/л на 46-й, 50-й, 53-й, 57-й, 60-й, 64-й, 67-й, 71-й, 74-й и 78-й день соответственно. В нормальной группе для иммунологических первичных (сенсибилизация) и вторичных (приступ) инъекций вместо BSA использовали физиологический раствор, а другие условия были такими же, как и в модельной группе. Нормальной группе перорально вводили дистиллированную воду в дозе 10 мл/кг/день. Модельной группе перорально вводили 10 мл/кг/день 0,5% раствора CMC-Na. Группе с положительным результатом лечения перорально вводили 600 мг/кг/день BJRG. Обработанные БСА плюс CPhG (125,

250 и 500 мг/кг/день) группам перорально вводили 125, 250 и 500 мг/кг/день CPhG.(Фенилэтанолгликозиды из цистанхе), соответственно. Ежедневное дозирование крыс продолжали в течение двух недель после последней инъекции. После экспериментального периода крыс не кормили в течение 12 часов до введения 10-процентного хлоралгидрата, а затем немедленно усыпляли. Образцы сыворотки собирали у каждой крысы и немедленно использовали. Печень собирали для двух целей: (1) сохранение в жидком азоте для наборов Hyp и (2) фиксация в 10-процентном формальдегиде для гистологических и иммуногистохимических исследований. Общая продолжительность исследований на животных составила 93 дня.

Показатели печени и селезенки

Печень и селезенку вырезали лапаротомией и промывали физиологическим раствором 4 степени. После поглощения избытка воды фильтровальной бумагой печень и селезенку взвешивали для расчета соответствующих показателей: относительная масса органа=масса органа (г)/индивидуальная масса тела (г) × 100 процентов [14].

Клеточные эксперименты

Клетки HSC-T6 высевали в 96-луночный планшет. Первоначально клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, в течение 48 часов. Затем среду заменяли на DMEM без FBS, чтобы голодать клетки в течение 12 часов. Затем клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 5,0 нг/мл TGF- 1 (без FBS), в течение 24 часов. Наконец, различные концентрации CPhGs(Фенилэтанолгликозиды из цистанхе)(100 мкг/мл, 50 мкг/мл и 25 мкг/мл), актеозид (6 мкг/мл, 3 мкг/мл и 1,5 мкг/мл) и эхинакозид (500 мкг/мл, 250 мкг/мл и 125 мкг/мл) проводили в планшете в четырехкратной повторности лунок и инкубировали в течение 48 часов.

ПЦР-анализ в реальном времени

Уровень экспрессии мРНК NF-κB, p65 и коллагена I определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Для определения экспрессии мРНК в клетках HSC-T6 клетки (4 × 105 клеток) высевали в шестилуночные планшеты с 3 мл DMEM с 10% FBS и инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% CO2, после чего среду для культивирования клеток были заменены на бессывороточную DMEM. Далее, CPhG(Фенилэтанолгликозиды из цистанхе)(100 мкг/мл, 50 мкг/мл и 25 мкг/мл), актеозид (6 мкг/мл, 3 мкг/мл и 1,5 мкг/мл) и эхинакозид (500 мкг/мл). , 250 мкг/мл и 125 мкг/мл) добавляли в лунки. После 48 ч инкубации с ЦФГ или мономерными композициями тотальную РНК выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, США) и энергично перемешивали с хлороформом в течение 15 с. После выдерживания при комнатной температуре в течение 3 минут лизат центрифугировали при 12,000 × g в течение 15 минут при 4 градусах. РНК в водной фазе осаждали изопропанолом, а верхнюю водную фазу переносили в новую микроцентрифужную пробирку. РНК осаждали добавлением 0,75% этанола, после чего микроцентрифужную пробирку центрифугировали при 12,000×g при 4 градусах не более 5 мин. Супернатант удаляли, РНК высушивали при комнатной температуре в течение 5–10 мин. Конкретные наборы праймеров (Сангон, Шанхай, Китай), которые использовали для амплификации крысиного -актина [GenBank: NM_031144.3], коллагена I [GenBank: NM_ 053304.1] и NF Гены -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] были сконструированы с использованием Batch Primer 3. Прямые (fw) и обратные (rv) праймеры были следующими: Коллаген I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -актин (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, рв: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Результаты были нормализованы к мРНК гена домашнего хозяйства -актина в качестве внутреннего контроля и представлены в виде относительных уровней мРНК. Реакции проводили с 8 мкл iQ SYBR Green Supermix, 1 мкл пары праймеров 10 пМ, 8,5 мкл дистиллированной воды и 2,5 мкл кДНК. Каждую полимеразную цепную реакцию проводили при следующих условиях: 95° в течение 3 мин, затем 40 циклов по 10 с при 95°, 30 с при 55° и 10 с при 55° – 95° для удлинения с последующим однократным измерением флуоресценции. . Окончательные результаты описывались относительными значениями (2-ΔΔCt). Расчет и анализ проводили с помощью системы обнаружения ПЦР в реальном времени iQ5.

Вестерн-блот анализ

Уровни экспрессии белка коллагена I (Abcam, Кембридж, Великобритания, арт. №: ab34710) определяли вестерн-блоттингом [с -актином (партия: 60008-1-lg; Proteintech, Китай) в качестве домашнего контроля. Экстракты целых клеток готовили с использованием буфера для радиоиммунопреципитации (RIPA) (Thermo Scientific, США) с 1% коктейлем ингибиторов протеазы Halt (Thermo Scientific, США) и 1% коктейлем ингибиторов фосфатазы Halt (Thermo Scientific, США). Концентрацию белка измеряли и определяли количественно по методу Брэдфорда [18]. Белок (10–50 мкг) разделяли на 10%-ном геле SDS-PAGE и переносили на мембраны PVDF (Millipore, США). Мембраны блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью 5% БСА и первичные антитела (антитела к коллагену gen I, разведение 1:200 или мышиные mAb β-актина, разведение 1:5000) инкубировали при 4 градусах в течение ночи. Соответствующий Alk-Phos. конъюгированные вторичные антитела инкубировали при комнатной температуре. Наконец, мембраны трижды промывали солевым раствором 1×Tris-HCl с 0,1% Tween 20, а сигналы сканировали и визуализировали с помощью системы визуализации GEL DOC XR (Bio-Rad). Денситометрический анализ представляющих интерес белков был нормализован по -актину с помощью программного обеспечения GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). -актин использовали в качестве внутреннего контроля.

статистический анализ

Критерий нормальности Шапиро-Уилка и критерий однородности дисперсии Левена были применены для проверки нормальности, и You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Страница 4 из 13гомогенность дисперсии. Дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки использовали для выявления статистических различий в неоднородных, нормально распределенных данных. Непараметрический критерий Крускала-Уоллиса использовался для анализа данных, которые не являются нормально распределенными или однородными. Результаты выражали как среднее значение ± стандартное отклонение. Значимость была установлена ​​на уровне P < 0,05.="" все="" данные="" были="" проанализированы="" с="" помощью="" программного="" обеспечения="" spss="" 16.0="" (синьцзянский="" медицинский="">

Полученные результаты

Количественное определение CPhG

ЦФГ в C. Tubulosa содержат два гликозида фенилэтилового спирта, эхинакозид и актеозид, и их содержание в ЦФГ было определено с помощью анализа ВЭЖХ (рис. 1) и составило 42,71 ± 0,42 процента и 14,27 ± {{7 }},18% соответственно.

Показатели печени и селезенки

Как показано в Таблице 1, показатели печени и селезенки в модельной группе были значительно повышены [P < 0.01,="" p=""><0,05]. показатели="" печени="" и="" селезенки="" положительных="" препаратов="" bjrg="" и="" cphg="" в="" группах="" с="" разными="" дозами="" были="" значительно="" снижены="" по="" сравнению="" с="" модельной="" группой="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0." 004,="" pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070" соответственно].="" показатели="" печени="" и="" селезенки="" были="" ниже,="" чем="" у="" модельной="">

Влияние КФГ на активность АЛТ, АСТ и маркеры фиброза печени

В настоящем исследовании сывороточные уровни печеночных ферментов АСТ и АЛТ были значительно повышены в экспериментальной группе, что отражает гепатоцеллюлярное повреждение у крыс с BSA-индуцированным фиброзом печени. Однако эксперименты.

показали, что лечение BJRG (600 мг/кг) и CPhG (125, 250 и 5{{10}}0 мг/кг) значительно снижал АСТ [PAST < 0.0{{6{0}}1,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001="" соответственно]="" и="" уровни="" алт="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255" соответственно]="" у="" крыс="" с="" фиброзом="" печени.="" .="" (таблица="" 2).="" уровни="" ha,="" ln,="" pc="" и="" iv-c="" у="" модельных="" крыс="" были="" значительно="" повышены="" [pha=""><0,001, pln=""><0,001, ppciii="0,002," piv-c=""><0,001 соответственно].="" по="" сравнению="" с="" модельной="" группой="" уровни="" гк="" [pha="0,009," pha="0,007," pha="0,009," pha="0,023" соответственно],="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069" соответственно],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296" соответственно]="" и="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001="" соответственно]="" у="" крыс="" были="" заметно="" снижены="" при="" применении="" bjrg="" (600="" мг/кг)="" и="" cphg="" в="" различных="" дозовых="" группах="" (125,="" 250="" и="" 500="" мг/кг)="" (таблица="" 3).="" содержание="" hyp="" и="" tgf-="" 1="" содержание="" коллагена="" также="" определяли="" путем="" измерения="" уровней="" hyp="" в="" ткани="" печени.="" как="" показано="" в="" таблице="" 4,="" среднее="" значение="">уровень в модельной группе был значительно выше, чем в нормальной группе, но он был заметно снижен в группе BJRG и группах с различными дозами CPhG. Концентрация TGF в печени {{0}} в модельной группе крыс была значительно повышена [P < 0.001].="" по="" сравнению="" с="" контрольной="" группой="" уровни="" tgf-="" 1="" в="" группах="" с="" положительным="" лекарственным="" препаратом="" и="" в="" группах="" с="" различными="" дозами="" cphg="" были="" заметно="" снижены="" [p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1=""><0,001, p="" tgf-="" 1=""><0,001, ptgf-="" 1=""><0,001 соответственно].="" результаты="" обобщены="" в="" таблице="">

Гистопатологическое исследование

Наблюдения за нормальными срезами ткани печени, окрашенными H&E и трихромом Массона, показывают отчетливые печеночные дольки и печеночные синусоиды. Структура ткани печени у модельных крыс была нарушена, ткань печени и печеночные синусоиды замещены большим количеством соединительной ткани. Однако в экспериментальной группе было обнаружено более нормальную цитоархитектонику и меньшее количество соединительной ткани, чем в экспериментальной группе.

Окрашивание H&E

В нормальной группе наблюдалась структурная целостность печеночной дольки без аномальных портальных зон и печеночных синусоидов. Печеночные тяжи расположены упорядоченно, ядро ​​круглое и ясное. Ядра расположены в центре клетки, с обильной цитоплазмой. Только в портальной области имеется небольшое количество фиброзной ткани (рис. 2а). В модельной группе сильно повреждена дольковая структура. Клетки печени показали умеренную водянистую дегенерацию, в основном баллонную дегенерацию и/или жировую дистрофию. Также наблюдали формирование воспалительно-клеточной инфильтрации, обширную гиперплазию фиброзной ткани, образование большого количества фиброзных перегородок, расщепленных долек, значительную пролиферацию клеток печени. Эти наблюдения подтвердили успех создания модели фиброза печени у животных с иммунным повреждением у крыс (рис. 2b). По сравнению с модельной группой наблюдалось снижение воспалительной клеточной инфильтрации в различных CPhG. Также наблюдалось меньше некроза и жировой дистрофии клеток печени, а также облегчение фиброза. CPhG значительно смягчали патологию BSA-индуцированного фиброза печени у крыс, облегчали набухание клеток печени и эффективно предотвращали некроз гепатоцитов и инфильтрацию воспалительных клеток, что позволяет предположить, что CPhG оказывают защитное действие на BSA-индуцированный фиброз печени крыс. (рис. 2в–е). Окраска трихромом по Массону В группе здоровых пациентов ткань печени была нормальной. В области ворот печени было обнаружено небольшое количество голубых коллагеновых волокон, ткань печени имела нормальную структуру (рис. 3а). По сравнению с тканью печени нормальной группы фиброзная ткань пролиферировала за счет центральной створки и распространялась в паренхиму печени. Коллагеновые волокна расширены и связаны и

окутывает всю дольку и окружает центральную вену. Эти эффекты, наряду с фиброзом гепатоцитов, дольковым структурным повреждением, перипортальным фиброзом и образованием псевдодольки (рис. 3b), свидетельствовали о том, что модель была установлена. По сравнению с модельной группой коллагеновые волокна в группе положительного контроля препарата были слегка вытянуты наружу от периферической области ворот (рис. 3с). По сравнению с модельной группой количество коллагеновых волокон в группах, получавших разные дозы ХФГ, было значительно уменьшено, пролиферация волокон ингибировалась, а пролиферация фиброзной ткани в паренхиме печени значительно уменьшилась. Эти результаты свидетельствуют о том, что CPhG защищают крыс от BSA-индуцированного фиброза печени (Fig. 3d-f).

Иммуногистохимическое окрашивание

Важно отметить, что экспрессия коллагена типа I и коллагена типа III играет существенную роль в развитии фиброза печени, а их образование и отложение в ткани печени может служить важным фактором, определяющим эффективность против фиброза печени. Результаты приведены в таблице 5.

Коллаген типа I

В нормальной группе коллаген типа I экспрессировался главным образом в кровеносных сосудах и портальной области. Модельная группа имеет выраженный коллагеновый фиброз I типа в портальных зонах. В пространстве Диссе окрашивание коллагена I типа наблюдалось полосами или в виде очагового распределения. Коллаген покрывает фиброзные перегородки, образуя псевдодольки. В этих экспериментах меньшее количество фиброзных перегородок формировалось для BJRJ (600 мг/кг) и различных дозовых групп CPhGs (125, 250 и 500 мг/кг) [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023 и P Col I=0.044 соответственно]. Полуколичественные результаты показали, что экспрессия их коллагена I типа была значительно ниже по сравнению с модельной группой (рис. 4).

Коллаген III типа

Коллаген типа III был слабо выражен в нормальной группе, а периферические области, окружающие воротную и печеночную вены, имели небольшое количество тонких желтых волокон вместо непрерывных волокон (рис. 5а). В модельной группе коллагеновые волокна имели широкие и толстые тяжи, что указывало на сильную экспрессию, в основном локализованную в области портальной и фиброзной ткани (рис. 5б). Коллагеновые волокна BJRJ (600 мг/кг) и разных дозовых групп CPhG (125, 250 и 500 мг/кг) были нитевидными и располагались вокруг центральной вены и портальных областей. По сравнению с модельной группой коллагеновые волокна были значительно уменьшены, окрашивание было бледным и тонким, а иммуногистохимическое окрашивание было слабо положительным (рис. 5c–f). Эти полуколичественные результаты показывают, что положительно экспрессированные клетки в группах с положительной и различной дозой [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010 и P Col III=0.037 соответственно] отличались от таковых в модельной группе.

ТГФ- 1

В нормальных клетках печени крыс экспрессия TGIF{{0}} была незначительной. Экспрессия была ограничена небольшим количеством интерстициальных клеток (рис. 6а). В модельной группе экспрессия TGF- 1 была широко распространена в портальной области, фиброзных пространствах, звездчатых клетках печени, воспалительных клетках, синусоидальной стенке и цитоплазме. Конкретная портальная область демонстрировала сильно положительную экспрессию с коричневато-желтым окрашиванием (рис. 6b). В портальной области и фиброзных перегородках наблюдалась небольшая экспрессия BJRJ (600 мг/кг) и различных дозовых групп CPhG (125, 250 и 500 мг/кг). Степень положительного окрашивания в этих группах была значительно снижена по сравнению с модельной группой. Окрашивание интерстициальных клеток в фиброзных перегородках и цитоплазме воспалительных клеток было снижено (рис. 6c-f). Полуколичественные результаты показали, что BJRJ и различные дозовые группы CPhG [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 <0,001, p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" 0,004="" соответственно]="" были="" значимыми="" по="" сравнению="" с="" модельной="" группой.="" как="" упоминалось="" ранее="" в="" статье,="" tgf-="" 1="" является="" важным="" цитокином="" в="" патофизиологии="">

фиброз, стимулирующий выработку внеклеточного матрикса [19]. Мы показали, что уровень TGF- 1 увеличивался в модельной группе в соответствии с тяжестью фиброза печени. Уровни экспрессии TGF- 1 в печени соответствовали уровням TGF- 1 в сыворотке. Это указывает на то, что CPhG могут значительно уменьшить фиброз печени благодаря экспрессии TGF- 1, участвуя в синтезе и деградации ECM. Экспрессия коллагена типа I, коллагена типа III и TGF- 1 может выявить патологический процесс фиброза печени. Уровни их экспрессии в группах лечения были значительно снижены, что свидетельствует о том, что CPhG могут повышать активность коллагеназы, поддерживая динамическое равновесие синтеза и деградации внеклеточного матрикса печени, тем самым задерживая и предотвращая образование фиброза печени.