Часть 2. Обнаружение лекарственных средств Cistanches Herba (Rou Cong Rong) с использованием сигнатур видоспецифичных нуклеотидов

Путем поиска сигнатур нуклеотидов, полученных в этом исследовании, мы обнаружили, что 15 из 31 китайского патентованного лекарства, помеченного как содержащиеЦистанх Хербавместо этого содержались примеси, в том числе восемь поддельных ингредиентов и семь примесей (таблица 2). Например, шесть партий были заменены на Cy. songaricum, включая три партии пилюль Shihu Yeguang, одну партию пилюль Kangguzhi Zengsheng, одну партию капсул Sanbao и одну партию частиц Wenweishu.

Более того, разные партии одного и того же производителя давали несколько разные результаты. Например, из трех партий одного производителя (ZCY16, ZCY69 и ZCY71) одна партия содержала смесь Ci.пустыняи Сай. songaricum, одна партия состояла из смесиКи. пустыняа такжеКи. трубчатыйи одна партия содержала толькоКи. трубчатый. Две партии другого производителя (ZCY44 и ZCY70) также различались: одна партия содержала Cy. songaricum, тогда как другая партия содержалаКи. пустыняа такжеКи. трубчатый.

Цистанх Хербабыл обнаружен в 23 из 31 протестированного китайского патентованного лекарства (таблица 2), и только 16 образцов были подлинными, например, без примесей или поддельных ингредиентов.Ки. трубчатыйбыл обнаружен в 16 партиях китайских патентованных лекарств, а Ci. Deserticola была обнаружена в 10 партиях. Ни в одном из продуктов O. coerulescens не обнаружен (табл. 2).

Цистанхе пустынная имеет много эффектов, нажмите здесь, чтобы узнать больше

ОБСУЖДЕНИЕ

Необходимость разработки нового метода мониторинга имеющихся в продаже лекарственных средств, содержащихЦистанхиХерба

Цистанх Хербаэто тоник, который широко используется в общеукрепляющих китайских патентованных лекарствах и других лекарственных средствах. Однако контроль качества китайских патентованных лекарств представляет собой серьезную проблему из-за разнообразия и сложности ингредиентов. Из-за отсутствия регулирующего надзора существует значительная вероятность фальсификации или подделки продукции. Кроме того, все продукты должны обрабатываться в соответствии с фармакопеей или другими стандартами; фальсификация или подделка не допускается во время обработки. Таким образом, были установлены разновидности методов контроля качества, такие как двумерная жидкостная хроматография с несколькими сердцевинами (Yao et al., 2015), спектроскопия отражения в ближней инфракрасной области (Zhang and Su, 2014; Zhang et al., 2015). ) и жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (Wang et al., 2016b). Однако методы аналитической химии, используемые в настоящее время Китайской фармакопеейной комиссией (2015 г.), не могут быть использованы для проверки подлинности всех ингредиентов в китайских патентованных лекарствах или для обнаружения присутствия посторонних ингредиентов. Кроме того, исследования показали, что целевые метаболиты в растениях изменяются во время обработки продукта, что приводит к значительной изменчивости результатов испытаний или полному отказу методов испытаний (Ananingsih et al., 2013). Таким образом, молекулярные инструменты, такие как видоспецифичные нуклеотидные сигнатуры, готовы усилить системы контроля качества против риска мошеннической замены и фальсификации продуктов, а также включения немаркированных ингредиентов.

Хотя ITS/ITS2 считается высокоэффективным инструментом для идентификации растительных лекарственных средств, эти последовательности не могут быть амплифицированы из сильно обработанных образцов (Newmaster et al., 2013; de Boer et al., 2015). Ван и др. сообщили, что ITS2 не может быть амплифицирован из экстракта или отваров Angelicae Sinensis Radix, прокипяченных более 120 минут (Wang et al., 2016a). В соответствии с традиционными технологиями и Комиссией по фармакопее Китая (2015 г.), Cistanches Herba всегда проходит глубокую обработку для повышения его лечебной эффективности; эти процессы включают сушку в духовке, соление и приготовление на пару с вином (Zou et al., 2017), которые приводят к деградации ДНК. Кроме того, при обработке добавляют различные вспомогательные вещества, такие как мед, крахмал и декстрин. Если эти вспомогательные вещества не будут удалены полностью, это повлияет на чистоту ДНК. Например, для получения капсул Sanbao, содержащих Cistanches Herba, используется следующий производственный процесс: «Лекарственные ломтики кипятят дважды в течение 1,5 ч, объединяют отвары и фильтруют смесь. Концентрируют фильтрат до относительной плотности 1,20~1,25 (при 80 ◦C).Добавить другие измельченные порошки и смешать их до получения однородной смеси.Далее высушить смесь при 60 ◦C, а затем измельчить в мелкую

порошок». Однако после описанного выше производственного процесса могут возникнуть трудности при выделении ДНК из китайских патентованных лекарств, и длинные фрагменты могут не амплифицироваться из деградированной ДНК, что помешает идентификации примесей. Таким образом, для обеспечения качества и чистоты ДНК, мы добавили дополнительные этапы перед выделением геномной ДНК, включая промывку буфером для предварительной промывки и элюирование десяти параллельных пробирок в одну пробирку для каждой партии.

Хотя все китайские патентованные лекарства, использованные в настоящем исследовании, содержали от 6 до 25 ингредиентов, разработанные пары праймеров могли специфически амплифицировать последовательности примесей в этих китайских патентованных лекарствах. Прямое секвенирование продуктов ПЦР показало чистые файлы трассировки. Таким образом, этот метод нуклеотидной подписи способен идентифицировать как подлинные ингредиенты, так и примеси, и должен расширить применение инструментов молекулярной диагностики на основе ДНК для надзора за рынком.

повреждение и заболевание почек можно лечить с помощью цистанхе

Сигнатуры нуклеотидов для эффективной идентификации продуктов Cistanches Herba

Молекулярные инструменты, использующие технологию ПЦР, очень перспективны для аутентификации лекарственных средств в рамках систем контроля качества. Успешное применение праймеров для выявления деградировавших ДНК примесей из Cistanches Herba предполагает широкое применение метода обнаружения на основе ПЦР. На китайском рынке фитотерапии цена на подлинные ингредиенты видов Cistanches Herba более чем в пять раз превышает цены на их примеси. Наши результаты показали, что Cy. songaricum является наиболее распространенной примесью Cistanches Herba на рынке, за ней следует Ci. Синенсис. Сай. songaricum был добавлен, потому что эти лекарства имеют схожие морфологические характеристики. Кроме того, химический состав Ci. sinensis похож на Cistanches Herba. В качестве маркеров контроля качества дляЦистанх Хербаэкстракты, эхинакозид и актеозид можно недорого экстрагировать из Ci. китайский Так, некоторые фармацевтические заводы используют Ci. sinensis в качестве заменителя при производстве экстрактов Cistanches Herba. В совокупности результаты этого исследования указывают на то, что на рынке лекарственных средств существует значительное количество случаев мошенничества.

Фальсификация в китайской патентованной медицине похожа на фальсификацию в других странах. Подобные уровни фальсификации были зарегистрированы в Северной Америке (Newmaster et al., 2013), Европе (Raclariu et al., 2017) и Азии (Cheng et al., 2014; Shanmughanandhan et al., 2016; Gao et al. , 2017). В этом исследовании уровень фальсификации китайских патентованных лекарств составил примерно 48,4 процента, при этом только 16 из 31 образца были подлинными Cistanches Herba. Кроме того, мы предположили, что разные результаты, полученные с продуктами одного и того же производителя, могут быть связаны с различиями в качестве разных партий материалов китайской медицины. Поэтому для контроля качества китайских патентованных лекарств сырье должно быть аутентифицировано перед переработкой в ​​продукты.

ФальсификацияЦистанх Хербатрадиционно была связана с вопросами спроса и предложения сырья.Ки. пустыняа такжеКи. трубчатыйдва оригинальных растения, которые в настоящее время используются для приготовленияЦистанх Херба. Однако Си. Deserticola является единственным оригинальным видом традиционных аутентичных Cistanches Herba, перечисленных в Китайской фармакопее (2000 г.), в которой Ci. tubulosa идентифицируется как примесь. Из-за нехватки Ci. ресурсы пустыни,Ки. трубчатыйвключен в качестве дополнения в Китайскую фармакопею с 2005 г. (Jiang and Tu, 2009). До недавнего времени цены на эти травы заметно различались; Ки. tubulosa был намного дешевле, чем Ci. Deserticola, потому что запасы первого гораздо больше. Здесь наши результаты показали, что Ci. Tubulosa более широко используется в коммерчески доступных продуктах Cistanches Herba.

В заключение, сигнатуры нуклеотидов и результаты ПЦР

Методы, разработанные в этом исследовании, могут служить полезными инструментами для производителей лекарственных средств для проверки подлинности ингредиентов и обнаружения примесей в продуктах.ЦистанхиПродукция Herba. В соответствии с результатом чувствительности, даже если доля примеси составляла один к десяти тысячам, ее можно было обнаружить с помощью qRT-PCR. Это означает, что как только нуклеотидная сигнатура обнаружена вЦистанхиФункциональные продукты, содержащие травы, могут быть идентифицированы как примеси или поддельные ингредиенты. Было предложено новое решение для обнаружения поддельных ингредиентов или фальсифицированных Cistanches Herba, которое ранее не было доступно с помощью химических методов обнаружения в Китайской фармакопее. Кроме того, этот метод можно использовать для валидации все большего числа видов лекарств и для расширения применения инструментов молекулярной диагностики на основе ДНК для надзора за рынком.

Чтобы облегчитьхроническийпочкаболезньсцистанхе

АВТОРСКИЙ ВКЛАД

JH задумал исследование и участвовал в его разработке. XW, RX и JC предоставили образцы и провели эксперименты. XW проанализировал данные. XW, JH, ZZ, S-GN, JS и SC составили рукопись. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая [номер гранта 81673552], CAMS Innovation

Фонд медицинских наук [номер гранта 2016-I2 M- 3-016] и Ключевой проект Объединенного фонда Национального фонда естественных наук Китая [номер гранта U1403224].

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы хотели бы поблагодарить наших коллег, которые помогли со сбором образцов, идентификацией, лабораторной работой и подготовкой рукописи, включая Chaokui Sun, Dianyun Hou и Piao Zhang.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/полный#дополнительный материал

Дополнительная фигура S1|Результат выравнивания последовательности ITS2 шести видов.

Дополнительная фигура S2|Электрофорез всех образцов в агарозном геле.

Дополнительная таблица S1|Информация о пробах Cistanches Herba и его примесей.

Дополнительная таблица S2|Информация о последовательности родственных видов, загруженная из GenBank.

Дополнительная таблица S3|Заявленные составы различных образцов китайских патентованных лекарственных средств.

Дополнительный лист данных S1|Все последовательности, полученные в этом исследовании.

ЦистанхеDeserticola имеет много эффектов

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

Ананинсих, В.К., Шарма, А., и Чжоу, В. (2013). Катехины зеленого чая при обработке и хранении пищевых продуктов: обзор стабильности и обнаружения. Еда Рез. Междунар. 50, 469–479. DOI: 10.1016/j.foodres.2011.03.004

Chen, H., Jing, FC, Li, CL, Tu, PF, Zheng, QS, and Wang, ZH (2007). Эхинакозид предотвращает внеклеточные уровни моноамина в полосатом теле.

нейротрансмиттеров от снижения у крыс с поражением 6-гидроксидофамина. Дж. Этнофармакол. 114, 285–289. DOI: 10.1016/j.jep.2007.07.035

Чен С., Яо Х., Хань Дж., Лю С., Сонг Дж., Ши Л. и др. (2010). Проверка области ITS2 в качестве нового штрих-кода ДНК для идентификации видов лекарственных растений. ПЛОС ОДИН 5:e8613. DOI: 10.1371/journal.pone.0008613

Cheng, X., Su, X., Chen, X., Zhao, H., Bo, C., Xu, J., et al. (2014). Анализ биологических ингредиентов препарата традиционной китайской медицины на основе высокопроизводительного секвенирования: история для Лювэй Дихуанг Ван. науч. Реп. 4:5147. DOI: 10.1038/srep05147

Китайская фармакопея. (2000). Фармакопея Китайской Народной Республики. Часть I. Пекин: China Medical Science Press.

Китайская фармакопея. (2015). Фармакопея Китайской Народной Республики. Часть I. Пекин: China Medical Science Press.

де Бур, Х.Дж., Ихим, М.К., и Ньюмастер, С.Г. (2015). ДНК-штрихкодирование и фармаконадзор растительных лекарственных средств. Препарат Саф. 38, 611–620. DOI: 10.1007/с40264-015-0306-8

Дубей, Б., Меганатан, П.Р., и Хак, И. (2011). ДНК-мини-штрихкодирование: подход к судебно-медицинской идентификации некоторых видов индийских змей, находящихся под угрозой исчезновения. судебно-медицинская экспертиза науч. Междунар. Жене. 5, 181–184. DOI: 10.1016/j.fsigen.2010.03.001

Эдгар, RC (2004). MUSCLE: множественное выравнивание последовательностей с высокой точностью и высокой пропускной способностью. Нуклеиновые Кислоты Res. 32, 1792–1797. DOI: 10.1093/var/gkh340

Фу, Л. (1991). Красная книга растений Китая. Часть I. Пекин: Science Press, 502.

Гао З., Лю Ю., Ван Х., Сонг Дж., Чен С., Рагупати С. и др. (2017). Производная технология штрих-кодирования ДНК (метод сигнатуры нуклеотидов и метод двойного пика SNP) выявляет примеси и замены в китайских патентованных лекарствах. науч. Реп. 7:5858. DOI: 10.1038/с41598-017-05892-г

Гу, К.М., Ян, XY, и Хуанг, Л.Ф. (2016). Cistanches Herba: обзор нейрофармакологии. Фронт. Фармакол. 7:289. DOI: 10.3389/fphar.2016.00289

Хаджибабаи, М., Смит, М.А., Янзен, Д.Х., Родригес, Дж.Дж., Уитфилд,

Дж. Б. и Хеберт, ПДН (2006). Минималистичный штрих-код может идентифицировать образец, ДНК которого деградировала. Мол. Экол. Примечания 6, 959–964. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2006.01470.x

Японская фармакопея. (2016). Японская фармакопея, 17-е изд. Токио: Министерство здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии, 1831–1832 гг.

Цзян, Ю., и Ту, П.Ф. (2009). Анализ химических компонентов видов цистанхе. Ж. Хроматогр. 1216, 1970–1979 гг. DOI: 10.1016/j.chroma.2008.07.031

Келлер А., Шлейхер Т., Шульц Дж., Мюллер Т., Дандекар Т. и Вольф М. (2009). Взаимодействие 5.8S-28S рРНК и аннотация ITS2 на основе HMM. Ген 430, 50–57. doi: 10.1016/j.gene.2008.10.012

Лей Л., Ян Ф., Чжан Т., Ту П., Ву Л. и Ито Ю. (2001). Препаративное выделение и очистка актеозида и 2'-ацетилактеозида из Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck с помощью высокоскоростной противоточной хроматографии. Ж. Хроматогр. А 912, 181–185. DOI: 10.1016/S0021-9673(01)00583-0

Ли, З., Лин, Х., Гу, Л., Гао, Дж., и Цзэн, К.М. (2016). Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): один из лучших фармацевтических даров традиционной китайской медицины. Фронт. Фармакол. 7:41. DOI: 10.3389/fphar.2016.00041

Лю, К.М., Ли, Дж., Цзян, Ю., Чжао, М.Б., и Ту, П.Ф. (2013). Химические составляющие Cistanche Sinensis (Orobanchaceae). Биохим. Сист. Экол. 47, 21–24. DOI: 10.1016/j.bse.2012.09.003

Лю Ю., Ван Х., Ван Л., Чен Х., Панг Х. и Хан Дж. (2016). Нуклеотидная подпись для идентификации американского женьшеня и продуктов его переработки. Фронт. Растениевод. 7:319. DOI: 10.3389/fpls.2016.00319

Ло, Ю.Т., Ли, М., и Шоу, ПК (2015). Идентификация трав, входящих в состав отваров женьшеня, с помощью ДНК-маркеров. Подбородок. Мед. 10:1. DOI: 10,1186/с13020-015-0029-x

Мёнье, И., Сингер, Г.А., Ландри, Дж.Ф., Хикки, Д.А., Хеберт, П.Д., и Хаджибабаи, М. (2008). Универсальный мини-штрих-код ДНК для анализа биоразнообразия. Геномика BMC 9:214. DOI: 10.1186/1471-2164-9-214

Ньюмастер, С.Г., Гргурик, М., Шанмуганандхан, Д., Рамалингам, С., и Рагупати, С. (2013). Штрих-кодирование ДНК выявляет загрязнение и замену в североамериканских растительных продуктах. БМК. Мед. 11:222. DOI: 10.1186/1741-7015-11-222

Раклариу, А.С., Мокан, А., Попа, М.О., Власе, Л., Ихим, М.С., Крисан, Г., и соавт. (2017). Аутентификация продукта Veronica officinalis с использованием ДНК-метабаркодирования и ВЭЖХ-МС выявляет широко распространенную фальсификацию Veronica chamaedrys. Фронт. Фармакол. 8:378. DOI: 10.3389/fphar.2017.00378

Шанмуганандхан Д., Рагупати С., Ньюмастер С.Г., Моханасундарам С. и Сатишкумар Р. (2016). Оценка подлинности и фальсификации растительных продуктов в Индии с использованием ваучерной библиотеки биологических эталонных материалов на основе ДНК. Препарат Саф. 39, 1211–1227. DOI: 10.1007/с40264-016- 0459-0

Sun, ZY, Song, JY, Yao, H. и Han, JP (2012). Молекулярная идентификация Cistanches Herba и его примесей на основе последовательности nrITS2. Дж. Мед. Растения Рез. 6, 1041–1045. DOI: 10.5897/JMPR11.1115

Тамура К., Петерсон Д., Петерсон Н., Стечер Г., Ней М. и Кумар С. (2011). MEGA5: молекулярно-эволюционный генетический анализ с использованием методов максимального правдоподобия, эволюционного расстояния и максимальной экономии. Мол. биол. Эвол. 28, 2731–2739. DOI: 10.1093/molbev/msr121

Wang, Q., Song, W., Qiao, X., Ji, S., Kuang, Y., Zhang, ZX, et al. (2016б). Одновременный количественный анализ 50 биоактивных соединений традиционной китайской медицины в отваре Гэгэнь-Циньлянь с использованием сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. Ж. Хроматогр. 1454, 15–25. DOI: 10.1016/j.chroma.2016. 05.056

Ван, Т., Чжан, XY, и Се, WY (2012). Цистанхе пустынная

YC Ma, "Пустынный женьшень": обзор. Являюсь. Дж. Чин. Мед. 40, 1123–1141. DOI: 10.1142/S0192415X12500838

Ван С., Лю Ю., Ван Л., Хан Дж. и Чен С. (2016a). Нуклеотидная сигнатура для идентификации Angelicae Sinensis Radix (Danggui) и ее продуктов. науч. Реп. 6:34940. DOI: 10.1038/srep34940

Yao, CL, Yang, WZ, Wu, WY, Dai, J., Hou, JJ, Zhang, JX,

и другие. (2015). Одновременное количественное определение пяти сапонинов нотоженьшеня Panax с помощью двухмерной жидкостной хроматографии с несколькими сердцевинами: разработка метода и применение для контроля качества восьми китайских патентованных лекарств, содержащих нотоженьшень. Ж. Хроматогр. 1402, 71–81. DOI: 10.1016/j.chroma.2015.05.015

Чжан, К., и Су, Дж. (2014). Применение ближней инфракрасной спектроскопии для анализа и быстрой оценки качества традиционных китайских лекарственных средств. Акта. фарм. Грех. Б 4, 182–192. DOI: 10.1016/j.apsb.2014.04.001

Zhang, W., Qu, Z., Wang, Y., Yao, C., Bai, X., Bian, S., et al. (2015). Спектроскопия отражения в ближней инфракрасной области (NIRS) для быстрого определения гинзенозидов Rg1 и Re в таблетках китайской патентованной медицины Naosaitong. Спектрохим. Акта. Мол. биомол. Спектроск. 139, 184–188. DOI: 10.1016/j.saa.2014.11.111

Цзоу П., Сун Ю., Лей В., Ли Дж., Ту П. и Цзян Ю. (2017). Применение метаболомики на основе ЯМР 1H для различения различных частей и разработки нового рабочего процесса обработки Cistanche Deserticola. Акта. фарм. Грех. Б 7, 647–656. DOI: 10.1016/j.apsb.2017.07.003

Заявление о конфликте интересов: авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Copyright © 2018 Wang, Xu, Chen, Song, Newmaster, Han, Zhang и Chen. Это статья с открытым доступом, распространяемая на условиях лицензии Creative Commons Attribution License (CC BY). Использование, распространение или воспроизведение на других форумах разрешено при условии указания оригинального автора(ов) и владельца(ей) авторских прав и при условии цитирования оригинальной публикации в этом журнале в соответствии с общепринятой академической практикой. Запрещается использование, распространение или воспроизведение без соблюдения этих условий.