Часть Ⅰ Адъювантная ценность Herba Cistanches при использовании в комбинации со статинами в мышиных моделях

Элейн Ват, Чун Фай Нг, Чи Ман Кун, Ченг Чжан, Си Гао, Брайан Томлинсон и Клара Бик Сан Лау

1 Институт китайской медицины Китайского университета Гонконга, Шатин, Новые территории, Гонконг.

2 Государственная ключевая лаборатория фитохимии и растительных ресурсов в Западном Китае, Китайский университет Гонконга, Шатин, Новые территории, Гонконг.

3 Отделение клинической фармакологии, факультет медицины и терапии, Китайский университет Гонконга, Шатин, Новые территории, Гонконг. Элейн Ват и Чун Фай Нг внесли равный вклад в эту работу. Корреспонденцию и запросы на материалы следует направлять в CBSL (электронная почта: claralau@cuhk.edu.hk)

Для получения дополнительной информации: emily.li@wecistanche.com

Нажмите здесь, чтобы получить больше информации о Cistanche

Абстрактный

Хорошо известно, что статины имеют проблемы с мышечной токсичностью.ХербаЦистанхи(HC) — китайская трава, традиционно используемая при болях в пояснице и коленях. Наше предыдущее исследование in vitro показало, что он может защитить от мышечной токсичности, вызванной статинами. Однако его защитный эффект in vivo никогда не исследовался. Цель этого исследования состояла в том, чтобы определить, является ли водный экстрактХербаЦистанхе(HCE) может предотвратить вызванную симвастатином мышечную токсичность у крыс, и может ли Herba Cistanche E также оказывать благотворное влияние на снижение гиперхолестеринемии, вызванной диетой с высоким содержанием жиров, и повышенного уровня холестерина в печени, тем самым снижая дозу симвастатина при использовании в комбинированной терапии. Согласно нашим результатам, Herba Cistanche E значительно восстанавливал вызванное симвастатином снижение мышечной массы и снижал повышенный уровень креатинкиназы в плазме у крыс.ХербаЦистанхеE также улучшил индуцированное симвастатином снижение уровня глутатиона в мышцах, потенциал митохондриальной мембраны мышц и уменьшил индуцированное симвастатином воспаление мышц. Кроме того, HCE может снижать массу печени, общий уровень липидов в печени и уровень липидов в плазме у мышей с высоким содержанием жира. В заключение, наше исследование предоставило in vivo доказательства того, чтоХерба ЦистанхеЕ обладает потенциальным защитным действием в отношении индуцированной симвастатином токсичности в мышцах, а также благотворно влияет на индуцированную диетой неалкогольную жировую дистрофию печени и гиперлипидемию при использовании отдельно или в комбинации с симвастатином в сниженной дозе.

Хорошо задокументировано, что ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы, также известные как статины, полезны для пациентов с гиперхолестеринемией с умеренным и высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний1. Статины, один из самых продаваемых классов рецептурных препаратов в мире, действуют путем ингибирования восстановления ГМГ-КоА до мевалоновой кислоты на ранней стадии пути мевалоната для снижения синтеза эндогенного холестерина2, 3. Хотя статины обычно хорошо переносятся , одним из наиболее важных и хорошо известных клинических побочных эффектов являются аномалии скелетных мышц, которые могут варьироваться от доброкачественной миалгии до тяжелой миопатии4, 5. при лечении статинами сообщалось о мышечных симптомах, из-за которых 30% пациентов с такими симптомами прекратили лечение6. Целевая группа по безопасности статинов Национальной ассоциации липидов предоставила рекомендации по лечению симптомов, связанных с мышцами, у пациентов, проходящих терапию статинами. В целом рекомендуется, чтобы у пациентов с тяжелыми симптомами, такими как повышение уровня креатинкиназы (КК) более чем в 5 раз выше ВГН, прием статинов не проводился до тех пор, пока уровень КК снова не нормализуется5. Из-за возникновения этих побочных эффектов, а также из-за того, что не существует эффективного лечения вызванной статинами мышечной токсичности, существует потребность в поиске новых методов лечения вызванных статинами проблем с мышцами.

В то время как предлагается смесь механизмов, которые могут быть ответственны за побочные эффекты статинов, считается, что митохондриальные механизмы связаны с побочными эффектами мышечной токсичности статинов1. Мевалонат является не только предшественником холестерина, но также предшественником важных соединений, таких как селенопротеины, долихол и убихинон7, 8. Статин может подавлять селенопротеины, такие как глутатионпероксидаза (GPx), снижая плотность антиоксидантов и способствуя его неблагоприятным последствиям. эффекты4. Статины также могут приводить к истощению запасов убихинона, вызывая снижение потребления кислорода и синтеза АТФ9. Кроме того, увеличение количества исследований in vitro и in vivo продемонстрировало, что статины могут также действовать непосредственно на митохондрии тканей, вызывая увеличение количества активных форм кислорода (АФК) и митохондриальный окислительный стресс, приводя к гибели клеток и, следовательно, способствуя повреждению печени и мышц10, 11.

ХербаЦистанхи, целое высушенное растениеЦистанхепустыняYC Ma (семейство Orobanchaceae) — паразитические растения, произрастающие преимущественно в пустынных районах северного и северо-восточного Китая12. Согласно теории китайской медицины, Herba Cistanches имеет сладкий, теплый и соленый вкус13. Это китайское тонизирующее растение Ян, которое в основном используется для лечения почечной недостаточности с такими симптомами, как импотенция, бесплодие, преждевременная эякуляция. Это также китайское растение, которое традиционно назначают пациентам при болях в пояснице и коленях и обычно используют в китайских рецептах для лечения проблем с мышцами12, 14. Интересно, что это также согласуется с современными научными исследованиями, которые продемонстрировали - Усталостная активность экстракта Herba Cistanches, богатого полисахаридами и фенилэтаноидами, у крыс после тренировки за счет уменьшения повреждения мышц и улучшения накопления АТФ15. Кроме того, недавняя работа показала, что метанольный экстракт Herba Cistanches может усиливать выработку митохондриального АТФ16.ХербаЦистанхитакже было доказано, что он является сильным антиоксидантом и поглотителем свободных радикалов в различных органах, снижая окислительный стресс и активность АФК в исследованиях in vivo17, 18. В недавнем исследовании, проведенном нашей лабораторией, мы продемонстрировали, что нашХербаЦистанхиводный экстракт значительно предотвращал индуцированную симвастатином токсичность в клетках скелетных мышц L6, а также дозозависимое восстановление индуцированного симвастатином снижения продукции АТФ в клетках L6, что свидетельствует о потенциалеХербаЦистанхиводный экстракт для защиты от мышечной токсичности, вызванной статинами19. Тем не менее, доказательства in vivo отсутствуют.

Следовательно, мы предположили, чтоХербаЦистанхиводный экстракт (HCE) может оказывать благотворное влияние на индуцированную симвастатином мышечную токсичность. Таким образом, это исследование было направлено на определение того, может ли использование ГХЭ снизить индуцированную симвастатином мышечную токсичность с использованием модели животных in vivo, и, кроме того, может ли ГХЭ также оказывать благотворное влияние на снижение гиперхолестеринемии, вызванной диетой с высоким содержанием жиров, и повышенного уровня холестерина в печени. , тем самым уменьшая дозу используемого симвастатина.

Материалы и методы

Аутентификация и экстракция растительных материалов.

Сырье растительного происхожденияХербаЦистанхи(Cistanche Deserticola из Внутренней Монголии) был приобретен у Zi Xin, известного поставщика в Гуанчжоу, Китай. Herba Cistanches была химически аутентифицирована с использованием тонкослойной хроматографии и сверхэффективной жидкостной хроматографии в соответствии с Китайской фармакопеей 201013, как описано ранее19, свербаскозида такжеэхинакозид(приобретены у Национального института контроля фармацевтических и биологических продуктов, Китай) в качестве химических маркеров. После химической аутентификации образец гербарного ваучераХербаЦистанхибыл депонирован в Музее Института китайской медицины Китайского университета Гонконга с номером ваучера 2014-3434.

ХербаЦистанхиводный экстракт готовили, как описано ранее19. Вкратце, 1 кг сырой травы замачивали в течение 1 часа, после чего дважды экстрагировали путем нагревания в течение 1 часа с обратным холодильником при 100 градусах с использованием 10-кратной дистиллированной воды. Водные экстракты (HCE) затем объединяли и фильтровали, а фильтрат концентрировали при пониженном давлении при 60°С. Концентрированный экстракт лиофилизировали досуха. Процент выхода составлял 50,1% масс./масс. Весь извлеченный порошок был упакован под вакуумом и хранился до использования.

Экспериментальные животные.

Симвастатин был приобретен у SR Pharmasolutions Ltd. Самцы крыс Sprague Dawley (180–200 г) и самцы мышей C57Bl/6J (8-недельного возраста) были предоставлены Центром обслуживания лабораторных животных Китайского университета Гонконга. Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Китайского университета Гонконга (Ref no. 12/074/MIS). Все экспериментальные методы проводились в соответствии с утвержденными правилами, установленными Комитетом по этике экспериментов на животных Китайского университета Гонконга. Все крысы (по 3 особи в клетке) и мыши (по 5 особей в клетке) содержались в обычных стандартных клетках при постоянной температуре 21 градус с циклом свет-темнота 12- ч. Каждый стандартный садок содержал осину в качестве подстилки. Всем животным был предоставлен свободный доступ к пище и воде.

Изучение мышечной токсичности, вызванной статинами, у крыс.

Все крысы были случайным образом разделены на 5 групп (n=5–10). Все животные находились на обычном питании. Им также ежедневно давали дистиллированную воду или симвастатин, а также внутрижелудочно с лечением HCE или без него. Животным, которым необходимо было давать как симвастатин, так и HCE, HCE давали через 3 часа после введения симвастатина, чтобы предотвратить любое прямое химическое взаимодействие травы с лекарственными средствами. Травяной экстракт или симвастатин растворяли в 0,5% метилцеллюлозе в дистиллированной воде известной концентрации. Предварительно рассчитанный объем вводили внутрижелудочно каждому животному в соответствии с его весом, так что рассчитанный объем содержал количество предполагаемой требуемой дозы. Детали этих групп следующие:

Группа а) Обычная диета плюс дистиллированная вода (нормальная контрольная группа)

Группа б) Обычная диета плюс симвастатин (640 мг/кг)

Группа c) Обычный рацион плюс симвастатин (640 мг/кг) плюс низкая доза ГХЭ (1,1 г/кг животного)

Группа d) Обычный рацион плюс симвастатин (640 мг/кг) плюс высокая доза ГХЭ (2,2 г/кг животного)

Группа д) Обычный рацион плюс высокая доза ГХЭ (2,2 г/кг животного)

Потребление пищи регистрировали ежедневно, а массу тела измеряли два раза в неделю. Лечение было назначено на 4 недели. После этого животных анестезировали смесью кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) внутрибрюшинно. Кровь брали путем пункции сердца и давали свернуться. Затем плазму отделяли центрифугированием (3,000 об/мин в течение 10 минут). Различные мышцы (четырехглавую, икроножную, камбаловидную, переднюю большеберцовую и длинный разгибатель пальцев) вырезали и хранили при -80° до анализа.

Измерение креатинкиназы плазмы. Активность креатинкиназы (КК) плазмы определяли с помощью набора Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Stanbio Laboratory, США) в соответствии с инструкциями производителя.

Измерение глутатионпероксидазы в мышцах. Мышечная глутатионпероксидаза (GPx) измерялась с использованием имеющегося в продаже набора (703102, Cayman Chemical, США) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, мышечные ткани промывали PBS при pH 7,4 для удаления любых эритроцитов и гомогенизировали в 5-10 мл буфера для холодного лизиса, после чего гомогенат центрифугировали при 10{6}} g в течение 15 минут при 4°С. Затем супернатант удаляли и анализировали на активность GPx с использованием коммерческого набора.

Подготовка митохондриальной и цитозольной фракций мышц. Митохондриальные и цитозольные фракции из образцов мышц готовили с использованием набора для выделения митохондрий (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, США) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, свежие образцы мышц предварительно обрабатывали экстракционным маслом, разрезали на мелкие кусочки и гомогенизировали в экстракционном буфере. Затем гомогенаты тканей центрифугировали. Супернатант собирали и сохраняли для анализа цитозольной фракции. Затем осадки митохондрий промывали и снова центрифугировали и использовали для анализа митохондриальной фракции.

Измерение митохондриальных активных форм кислорода (АФК) в мышцах. АФК измеряли по протоколу, модифицированному по сравнению с предыдущей литературой20. Вкратце, АФК измеряли в митохондриальной фракции (50 мкг белка/мл) с использованием раствора DCFDA (C6827, Invitrogen, США). Смесь инкубировали при 37°С в течение 10 мин в темноте, после чего инкубировали с раствором субстрата (10 мМ пируват, 15 мМ малат) для фотоактивации. Интенсивность флуоресценции измеряли каждые 5 минут в течение 60 минут с помощью устройства для считывания флуоресцентных микропланшетов BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG при возбуждении на длине волны 485 нм и эмиссии на длине волны 520 нм. Интенсивность флуоресценции рассчитывали для измерения образования АФК.

Потенциал митохондриальной мембраны мышц. Потенциал митохондриальной мембраны митохондриальной фракции из образцов мышц определяли в соответствии с протоколом производителя (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, США). Эта процедура представляет собой анализ с фиксированной точкой, измеряющий поглощение JC-1 с образованием J-агрегатов. Вкратце, митохондриальную суспензию разводили, чтобы она содержала 20 мкг белка, и инкубировали с красителем JC-1 в течение 7 минут при комнатной температуре. Эта 7-минута является временем, оптимизированным и подтвержденным производителем с использованием различных соединений (как указано в протоколе производителя), поскольку наблюдаемая флуоресценция раствора поднимается до плато через 5–10 минут, после чего следует резкое снижение флуоресценция JC-1 из-за выравнивания концентраций JC-1 внутри и снаружи митохондриального матрикса. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью устройства для считывания флуоресцентных микропланшетов BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG при возбуждении на длине волны 490 нм и испускании на длине волны 590 нм. Интенсивность флуоресценции рассчитывали для измерения градиентов потенциала.

Гистология мышц и оценка воспаления. Иммуногистохимию воспалительных клеток в мышцах оценивали по окрашиванию CD68 и CD163, как описано ранее21–23. Нарезали парафиновые срезы толщиной 5 мкм, приклеивали на предметные стекла Superfrost™ Plus (Menzel-Gläser, Германия). На срезы наносили первичные мышиные антикрысиные антитела к CD68, ED1 и CD163, ED2 (Bio-Rad, США) в разведении 1:100. Специфическое окрашивание выявляли с помощью EnVision™ Systems (Dako, Дания) с использованием вторичного антитела, конъюгированного с полимером EnVision-HRP антимышиного IgG в разведении 1:200, и выявляли с помощью раствора DAB (Dako, Дания) с последующим при контрастном окрашивании гематоксилином. Затем срезы монтировали в дибутилфталат в гистоне (DPX). Наличие нейтрофилов в мышцах определяли с помощью количественной иммуногистохимии с использованием программного обеспечения ImageJ.

Анализ экспрессии мышечных генов. ПЦР-анализ, который профилирует гены, связанные с окислительным стрессом, проводили с использованием ПЦР-чипов Rat Oxidative Stress and Antioxidant Defense (PARN-065Z, SABiosciences, Frederick, USA). Массив ПЦР выполняли в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, общую РНК выделяли путем селективного связывания с мембраной на основе силикагеля после лизиса и гомогенизации образцов мышц в денатурирующем гуанидинтиоцианатном буфере (набор RNeasy, Qiagen). РНК обратно транскрибировали в кДНК с использованием набора RT2 First Strand Kit (SABiosciences, Фредерик, США). Затем эту кДНК добавляли к основной смеси RT2 SYBR Green qPCR Master Mix (SABiosciences, Фредерик, США). Затем каждый образец разделяли на аликвоты на ПЦР-матрицах Rat Oxidative Stress and Antioxidant Defense (SABiosciences, Frederick, USA). Все шаги были выполнены в соответствии с протоколом производителя.

Изучение гиперлипидемии и стеатоза печени, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, у мышей.

Все мыши были случайным образом разделены на 5 групп (n=8–10) и получали следующее: Группа а) обычная диета (таблица 1); Группы от b до e) Диета с высоким содержанием жиров (содержит 21 процент жира и 0,15 процента холестерина) (таблица 2). Для индукции ожирения животным давали диеты на 8 недель. Через 8 недель всем группам с высоким содержанием жиров давали дистиллированную воду или симвастатин ежедневно и/или лечение HCE внутрижелудочно через 3 часа после введения симвастатина. Травяной экстракт или симвастатин растворяли в 0,5% метилцеллюлозе (Sigma-Aldrich Corporation, США) в дистиллированной воде известной концентрации. Предварительно рассчитанный объем вводили внутрижелудочно каждому животному в соответствии с его весом, так что рассчитанный объем содержал количество предполагаемой требуемой дозы. Детали этих групп следующие:

Группа а) Обычный рацион плюс дистиллированная вода.

Группа б) Диета с высоким содержанием жиров плюс дистиллированная вода

Группа в) Диета с высоким содержанием жиров плюс симвастатин (50 мг/кг)

Группа d) Диета с высоким содержанием жиров плюс ГХЭ (4,4 г/кг)

Группа д) Диета с высоким содержанием жиров плюс симвастатин (25 мг/кг) плюс ГХЭ (4,4 г/кг)

Потребление пищи регистрировали ежедневно, а массу тела измеряли два раза в неделю. В конце 16-недель исследования все мыши были умерщвлены после 16-часового ночного голодания. Животных анестезировали смесью кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) внутрибрюшинно. Кровь брали путем пункции сердца и давали свернуться. Плазму отделяли центрифугированием (3,000 об/мин в течение 10 минут). Печень вырезали и хранили при температуре -80 градусов до анализа.

Измерение липидов в плазме и печени.

Концентрации триглицеридов в плазме, холестерина (11488872216 и 11489232216, Roche Diagnostics, Швейцария), холестерина липопротеинов высокой и низкой плотности (ЛПВП-Х L-типа и L-типа ЛПНП, Wako Pure Chemicals Industries, Япония) измеряли с помощью ферментативными методами с использованием имеющегося в продаже набора в соответствии с инструкциями производителя. Активность креатинкиназы (КК) плазмы определяли с помощью набора Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Stanbio Laboratory, США). Общие липиды печени определяли гравиметрически после экстракции по методу Блая и Дайера24. Отдельные печеночные липиды количественно определяли ферментативно (как описано выше) после солюбилизации в изопропаноле (Sigma-Aldrich, США)25.

Гистопатология печени и оценка воспаления. Окраска гематоксилином и эозином (окрашивание H&E). Клещевые срезы (5 мкм) ткани, залитой в парафин, делали на микротоме и помещали на предметные стекла SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, США). Срезы подвергали окрашиванию H&E по методу Harris et al. 26 и смонтированы с дибутилфталатом в гистоне (DPX) (Sigma-Aldrich, США) 25.

Окрашивание по Mac-3 и количественный анализ. Толстые срезы (5 мкм) ткани, залитой в парафин, вырезали с помощью микротома и помещали на предметные стекла микроскопа SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, США). Выполняли поиск антигена с последующей блокировкой с помощью Peroxidase Block (Dako Cytomation, Дания). На срезы наносили первично очищенные антимышиные антитела Mac-3 (BD Pharmingen, США) в разведении 1:50. Специфическое окрашивание выявляли с использованием систем EnVision™ (Dako, Дания). Предметные стекла инкубировали со вторичным антителом, конъюгированным с полимером EnVision-HRP, анти-кроличьим IgG в разведении 1:200. Mac-3 был обнаружен с использованием раствора DAB (Dako, Дания) и докрашен гематоксилином. Затем секции были смонтированы в DPX. Наличие макрофагов в печени определяли с помощью количественной иммуногистохимии с использованием программного обеспечения ImageJ.

Статистический анализ. Различия между экспериментальной и контрольной группами были проверены с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом множественных сравнений Бонферрони. Все статистические анализы проводились с использованием GraphPad Prism Version 6.0 (GraphPad, США). Вероятность p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

Полученные результаты

ЭффектХербаЦистанхеE о симвастатин-индуцированной мышечной токсичности у крыс. Измерение мышечной массы и креатинкиназы плазмы. Пять различных типов мышц (четырехглавая, икроножная, камбаловидная, передняя большеберцовая мышца и длинный разгибатель пальцев) были выделены у всех обработанных крыс. Влияние различных видов лечения на мышечную массу показано на рис. 1а. Симвастатин (640 мг/кг) индуцировал значительное снижение веса четырехглавой, икроножной и передней большеберцовой мышц у крыс, в то время как это снижение значительно восстанавливалось с помощью HCE в четырехглавой и икроножной мышцах дозозависимым образом. Несмотря на то чтоХербаЦистанхеE проявлял тенденцию к восстановлению веса передней большеберцовой мышцы у крыс, получавших симвастатин, ни одна из этих групп лечения не достигла статистической значимости. Не наблюдалось значительного влияния лечения только HCE на мышечную массу по сравнению с контрольными крысами (рис. 1а).

На рисунке 1b показано влияние различных видов лечения на уровни креатинкиназы (СК) в плазме у крыс. Симвастатин индуцировал значительное повышение активности креатинкиназы у крыс, которая значительно снижалась при совместном лечении HCE в обеих дозах. Также не было значительного влияния лечения только HCE на уровни CK по сравнению с контрольной группой. Поскольку икроножная мышца чувствительна к лечению симвастатином и является самой крупной мышцей, выделенной по массе, мы выбрали эту мышцу для дальнейшего анализа, включая измерение глутатионпероксидазы в мышцах (GPx), измерение митохондриальной MMP и ROS, а также гистологию мышц и оценку воспаления. .

Измерение мышечной глутатионпероксидазы (GPx). Уровни глутатионпероксидазы в мышцах были измерены и показаны на рис. 2а. Введение симвастатина вызывало тенденцию к снижению уровня глутатионпероксидазы (GPx) в мышцах у крыс. Тем не менее, HCE проявлял тенденцию к улучшению индуцированного симвастатином снижения GPx в мышцах при обеих дозах 1,1 г/кг и 2,2 г/кг. Также не было значительного влияния лечения только HCE на уровни GPx в мышцах по сравнению с нормальными контрольными крысами.

Митохондриальный мембранный потенциал (ММП) и измерение АФК. Лечение симвастатином (640 мг/кг) вызывало значительное снижение ММР в мышцах (рис. 2б). Это снижение было дозозависимым улучшением у крыс, получавших совместное лечение HCE и симвастатином (рис. 2b). С другой стороны, интересно, что в группе, получавшей только симвастатин, уровни АФК в митохондриях мышц значительно снизились по сравнению с контрольной группой (рис. 2с). Однако лечение HCE у крыс, получавших симвастатин, проявляло дозозависимую тенденцию к восстановлению уровня митохондриальных АФК в мышцах до нормального уровня. Также не было значительного эффекта лечения только HCE у крыс по сравнению с нормальной контрольной группой как для измерения митохондриальной MMP, так и для измерения ROS.

Гистология мышц и оценка воспаления. Икроножные мышцы крыс, получавших различные виды лечения, были дополнительно проанализированы гистологически, и репрезентативные окрашенные срезы показаны на рис. 3а. Животным контрольной группы демонстрировали гистологические срезы нормальных мышц. Напротив, срезы H&E у животных, получавших симвастатин, выявили инфильтрацию воспалительных маркеров (желтые стрелки), которая была значительно снижена в этих срезах мышц крыс, получавших комбинацию симвастатина и HCE. Также был проведен иммуногистохимический анализ на наличие макрофагов CD68 и CD163 на фиг. 4а и 5а, соответственно, с количественным определением соответствующих макрофагов, показанным на фиг. 4b и 5b. Иммуногистохимический анализ мышечных срезов выявил наличие макрофагов (CD68) у крыс, получавших симвастатин (коричневая окраска), которое было значительно снижено у крыс, получавших совместное лечение HCE в обеих дозах (рис. 4b). Также не наблюдалось значительного воспаления у животных, получавших только HCE. Аналогичным образом, иммуногистохимический анализ срезов мышц выявил наличие CD163-положительных макрофагов у крыс, получавших симвастатин (коричневая окраска), которое было значительно снижено у крыс, получавших совместное лечение HCE в дозе 2,2 г/кг (рис. 5b). ). Также не наблюдалось значительного воспаления у животных, получавших только HCE.

Анализ экспрессии мышечных генов. Чтобы определить влияние симвастатина и HCE на гены, связанные с окислительным стрессом в мышцах, был проведен ПЦР-анализ, который профилирует гены, связанные с окислительным стрессом, с использованием ПЦР-чипов Rat Oxidative Stress and Antioxidant Defense. Гены, на которые значительно повлияло лечение симвастатином, были проанализированы и представлены на рис. 6. Что касается профиля экспрессии генов, регулирующих антиоксиданты, у крыс, получавших симвастатин (640 мг/кг), увеличивалась экспрессия генов, регулирующих антиоксиданты. Tese включает глутатионпероксидазы (GPx) GPx1 и GPx7 и другие пероксидазы, включая Serpinb1b и club (рис. 6а). ГХЭ в обеих дозах (1,1 или 2,2 г/кг) снижал это вызванное симвастатином увеличение GPxs и других пероксидаз до нормального уровня. С другой стороны, лечение HCE само по себе значительно повышало уровни экспрессии GPx1. Что касается экспрессии генов, регулирующих метаболизм АФК, симвастатин значительно индуцировал экспрессию других генов метаболизма супероксидов, включая Cyba, Ncf1, Ncf2, Scd1 и Ucp2. Точно так же HCE в обеих дозах значительно уменьшал это увеличение (рис. 6b). Кроме того, симвастатин индуцировал экспрессию генов, чувствительных к окислительному стрессу, включая Apoe, Ccl5 и Txn1, в то время как эти экспрессии были значительно снижены у животных, получавших одновременно HCE при обеих дозах (рис. 6c). С другой стороны, симвастатин вызывал значительное снижение экспрессии гена Txnip. Не было значительного влияния HCE на индуцированное симвастатином снижение экспрессии гена Txnip (рис. 6c). Симвастатин также вызывал значительное увеличение экспрессии генов, регулирующих переносчики кислорода, включая Slc38a1 и Vim. Совместное лечение HCE снижало экспрессию этих генов при обеих дозах (рис. 6d).

Влияние комбинированного применения симвастатина и ГХЭ на потребление пищи и массу тела у мышей. На рис. 7а показано ежедневное потребление пищи мышами для всех групп лечения. Диета с высоким содержанием жиров вызывала значительное увеличение ежедневного потребления пищи животными по сравнению с животными, которых кормили едой (p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

Еженедельное измерение массы тела. После 16 недель кормления с высоким содержанием жира животные, которых кормили HF, значительно прибавляли в весе, чем животные, которых кормили обычным кормом (рис. 7b). Однако между мышами, получавшими ВЧ-кормление, и всеми группами, получавшими лечение ВЧ-кормлением, не наблюдалось значительного эффекта. Также не было существенной разницы между мышами, получавшими ВЧ-кормление, получающими совместное лечение симвастатином и HCE, и мышами, получавшими ВЧ-кормление, получающими лечение только HCE или симвастатином (рис. 7b).

Влияние комбинированного применения симвастатина и ГХЭ на гиперлипидемию и стеатоз печени у мышей. Измерение липидов плазмы и активности креатинкиназы. Уровни липидов в плазме у всех мышей показаны на рис. 8. По сравнению с мышами, получавшими обычный корм, у мышей, получавших HF, были значительно повышенные уровни общего холестерина (TC) в плазме, которые были значительно снижены во всех группах лечения (рис. 8a). . У мышей с HF, получавших симвастатин и HCE, был значительно более низкий уровень TC в плазме по сравнению с животными с HF, получавшими только симвастатин, или с животными с HF, получавшими только HCE (p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

более низкий уровень ТГ в плазме по сравнению с мышами, получавшими ВЧ-кормление, при лечении только симвастатином (p<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">измерение липидов в воде.

Влияние различных групп лечения на гепатомегалию, вызванную СН (увеличение печени), было связано со значительным снижением общего содержания липидов в печени, выраженного в миллиграммах липидов на печень (рис. 9а). Общее содержание липидов в печени было значительно выше у мышей, получавших HF, по сравнению с мышами, получавшими обычный корм (в 3,0- раза выше, p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

Как показано на рис. 9b и c, измерение общего холестерина (ОХ) и триглицеридов в печени (ТГ) показало, что у мышей, получавших HF, были повышенные уровни обоих липидов по сравнению с мышами, получавшими обычный корм (т.е. 3.{{4} }кратное увеличение ТС, р<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

Оценка воспаления печени. Иммуногистохимическое окрашивание проводили для выявления присутствия макрофагов (Mac-3) (рис. 10а). Иммуногистохимический анализ срезов печени выявил наличие Mac-3 как у мышей с высоким содержанием жира, так и у мышей, получавших обычный корм (коричневая окраска). Это воспаление еще больше усиливалось у животных, получавших симвастатин, хотя такое увеличение не достигало статистической значимости. Интересно, что лечение HCE в сочетании с симвастатином или без него значительно уменьшало воспаление у мышей с высоким содержанием жира. При сравнении всех лечебных групп лечение HCE с сопутствующей терапией симвастатином или без нее также вызывало значительно меньшее воспаление по сравнению с группой лечения симвастатином (p<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

Продолжить чтение ...