Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы перейти к части 1

3. Наночастицы и наномедицина

Использование наноразмерных частиц в медицине, особенно в качестве носителей терапевтических средств, имеет большой потенциал для лечения многих заболеваний благодаря их многочисленным благоприятным свойствам, таким как размер, форма и морфология поверхности [56]. Кроме того, нанотехнология допускает преднамеренные изменения дизайна, предоставляя возможность контролировать их свойства [37]. Эта пластичность наночастиц (НЧ) позволяет присоединять к ним различные биомолекулы, тем самым обеспечивая эффективную и безопасную транспортировку фармакологически активных агентов, таких как гены или лекарства. Транспортные средства для доставки НЧ размером 1–100 нм обладают способностью проникать через значительные физиологические барьеры, такие как те, которые находятся в легких, печени, желудочно-кишечном соке, крови, сосудистой сети опухоли, слизистых оболочках и гематоэнцефалическом барьере [57–59]. . В этом отношении использовались различные NP, каждая из которых изображала свои уникальные характеристики в качестве терапевтического, диагностического или тераностического инструмента. Возможность конъюгировать терапевтические нуклеиновые кислоты и лекарства с NP открыла возможности для специфических мишеней.наномедицина. Помимо медицины, НЧ могут найти применение в косметике, упаковке, электронике и биотехнологии. НПВ можно в целом разделить на органические, углеродсодержащие или неорганические НП.

нейропротекторные эффекты экстракта цистанхе

Биосовместимость зависит от физико-химических свойств НПВ, при этом каждый НП обладает отличительными свойствами. Модификация NP полимерами и нацеливающими лигандами может усилить аффинность связывания с конъюгируемым геном или лекарством [60], в дополнение к клеточно-специфичному поглощению. Благородные металлы, золото (Au), серебро (Ag), платина (Pt) и палладий (Pd) широко используются благодаря их благоприятным физико-химическим, биологическим и оптическим свойствам [58, 61]. Физико-химические свойства AuNP легко настраиваются для клинического применения [62]. Они продемонстрировали многообещающие результаты при различных заболеваниях, включая оспу, рак, сифилис, СПИД и кожные язвы [63], а также использовались для обнаружения индуцированных ионами меди агрегированных А-пептидов [64]. AgNP обладают антимикробными и противовирусными свойствами, которые использовались в качестве предварительной обработки раневых инфекций [65]. Использование немодифицированных AgNP в качестве средств доставки затруднено из-за их склонности к агрегации и увеличению размера [66]. Pd чаще используется в стоматологии, где он входит в состав электрооборудования [61,67]. Биметаллические НПС Au-Pd, модифицированные кверцетином, изучались как возможные индукторы аутофагии уболезнь Альцгеймераболезнь[68]. Pt является хорошим антиоксидантом для снижения количества свободных радикалов [58] и входит в состав противоопухолевых препаратов цисплатина и оксалиплатина, которые обладают некоторой нейротоксичностью [69].

cistanche phelypaes: предотвращаетБолезнь Альцгеймера

Селен (Se), важный микроэлемент, необходим всем организмам для различных биологических функций, при этом добавление Se, как сообщается, снижает частоту сердечно-сосудистых заболеваний, остеоартрита, диабета 2 типа инейродегенеративныйболезнитакие как AD [70,71]. НЧ Se обладают благоприятными свойствами, в том числе противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами Se, проявляя при этом более низкую цитотоксичность, лучшую биодоступность, биосовместимость и биоразлагаемость in vivo [71,72]. Из-за их потенциального синергетического эффекта с терапевтическим геном или лекарством эти NP становятся все более популярными. Применение наночастиц мезопористого кремнезема (MSN) в качестве наносредств доставки получило значительный импульс благодаря их пористой структуре, которая предлагает как внутреннюю, так и внешнюю увеличенную площадь поверхности для терапевтического груза [73,74]. Эта пористая природа MSN допускает возможную комбинированную доставку терапевтических генов и лекарств, что может улучшить биологическую активность [75]. Наночастицы диоксида кремния, инкапсулированные кверцетином, продемонстрировали потенциал против вызванного медью окислительного стресса, наблюдаемого внейродегенеративныйзаболевания [76]

Оксиды железа, обычно называемые магнитными НЧ (МНЧ), включая маггемит, магнетиты и ферриты, широко изучались внаномедицинаблагодаря их низкой цитотоксичности, биоразлагаемости, стабильности, намагничиванию, биосовместимости, низкой чувствительности к окислению и реактивным поверхностям, неканцерогенности, простоте синтеза и модификации [77]. Целенаправленная доставка МНЧ может быть достигнута с помощью процесса магниторецепции, который использует внешнее магнитное поле для управления их доставкой. Их применение было распространено на магнитную гипертермию, магнитно-резонансную томографию (МРТ) и системы доставки [78,79]. Однако немодифицированные МНЧ гидрофобны и могут агрегировать и генерировать активные формы кислорода, что ограничивает их эффективность in vivo [80].

Квантовые точки (КТ) обладают уникальными оптическими свойствами, но из-за своего состава, в который часто входят такие металлы, как кадмий и цинк, они, как правило, токсичны. Этого можно было бы избежать, используя модифицированные КТ ядро-оболочка или КТ с покрытием [75]. Углеродные нанотрубки, как однослойные, так и многослойные, легко проникают в клетки. Однако без внутренней или внешней функционализации они нерастворимы, цитотоксичны, гидрофобны и иммуногенны [81]. Использование полимерных систем доставки развивалось с годами, причем предпочтение отдается катионным полимерам из-за их способности связывать анионные молекулы, такие как нуклеиновые кислоты. Кроме того, выбранные полимеры должны быть биосовместимыми, биоразлагаемыми и стабильными in vivo [75]. Следовательно, такие полимеры, как дендримеры, были популярны из-за большого количества катионных групп. В дальнейшем они использовались в качестве подходящих стабилизаторов металлических НЧ, таких как НЧ Au [82,83]. Поли(молочная-со-гликолевая кислота), полимер, одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), показал хорошие свойства для использования в доставке лекарств в сочетании с Au [84], в то время как его пегилированные производные были исследованы при БА [84]. 85]. Из наночастиц на основе липидов липосомы обычно используются для доставки биологически активных соединений, с некоторыми положительными результатами, отмеченными на животных моделях БА [86,87].

В целом, неорганические НЧ в большинстве случаев обладают преимуществом перед органическими аналогами, особенно в отношении простоты синтеза и подходов к функционализации, размера, стабильности и их тераностического потенциала. Все НП, упомянутые выше, продемонстрировали потенциал внаномедицинаи может распространяться на неврологические расстройства, такие как AD и PD. В целом, чтобы эти наносистемы были подходящими, необходимо учитывать заранее определенные свойства НЧ и расставлять приоритеты [88], как показано на рисунке 3.

Польза для здоровья cistanche: Предотвратитьнейродегенеративныйболезни

3.1. Проблемы, стоящие перед наночастицами

Использование НПВ не обходится без проблем, особенно если рассматривать их использование в качестве терапевтических средств доставки длянейродегенеративныйболезни. Помимо ГЭБ, который создает наибольшее препятствие для терапии, нейротоксичность, связанная с наносистемами доставки, также вызывает опасения по поводу безопасности [89]. Эта нейротоксичность обычно проявляется генерацией окислительного стресса и преимущественно зависит от морфологии, размера, площади поверхности, растворимости, концентрации, продолжительности и способа нанотерапевтического введения [90]. Хотя некоторые металлы играют ключевую роль в организме человека, накопление и агрегация НЧ металлов может вызывать беспокойство. Используя нейронную модель клеток PC12, ранее сообщалось, что НЧ железа вызывают значительную цитотоксичность [91], в то время как НЧ марганца и меди генерируют активные формы кислорода [92]. Использование НЧ оксида цинка индуцировало апоптоз нейральных стволовых клеток [93], в то время как пероральное введение НЧ Ag было токсичным и накапливалось в почках, печени и мозге у крыс Sprague Dawley [94]. Кроме того, введение НЧ оксида железа мышиным моделям вызывало окислительный стресс, нейродегенерацию [95], зависимый от клеточного цикла апоптоз нейронов [96] и нейроповеденческую токсичность [97].

Несмотря на эти проблемы, физико-химические свойства НЧ, как упоминалось ранее, делают их привлекательными кандидатами внаномедицина. Чтобы преодолеть некоторые из этих проблем, составы NP должны включать биосовместимые материалы, которые также являются биоразлагаемыми и легко выводятся из организма [98]. Их способность пересекать ГЭБ более подробно описана в разделе 3.2. Кроме того, наблюдаемая токсичность часто зависит от типа используемого NP, а поверхностная функционализация является шагом вперед в снижении побочных эффектов и взаимодействий. Следовательно, не существует универсального подхода к выбору НП и его применению. Важно определить преимущества и недостатки, связанные с использованием в основном металлических и неметаллических носителей, учитывая, что организму требуется много металлов, как упоминалось ранее. Следовательно, используемая концентрация будет иметь решающее значение для поддержания гомеостатического равновесия. Использование таргетных подходов в лечении БА и БП будет иметь решающее значение, поскольку клеточно-специфическое нацеливание необходимо для лечения поврежденных или мутировавших генов при сохранении целостности нормально функционирующих генов и клеток. Однако ясно, что при разработке терапевтических средств для ЦНС требуется более глубокое исследование НПВ. В настоящее время имеется недостаток информации о нейротоксичности NP, что указывает на острую необходимость дальнейших исследований как in vitro, так и in vivo, чтобы заложить основу, вокруг которой могут быть построены будущие исследования. Использование новых технологий, особенно в исследованиях силиконов, компьютерного и математического моделирования, вместе с более глубокими знаниями в области биоинформатики, может помочь в решении проблем, стоящих переднаномедицинав формулировке идеального НП.

Экстракт цистанхе пустынной

3.2. Преодоление гематоэнцефалического барьера

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) представляет собой динамическую границу, выполняющую самозащитную роль в модуляции транспорта биомолекул из крови в мозг, препятствуя проникновению токсичных химических веществ и более крупных лекарств. Хотя эта роль очень полезна, она служит препятствием для современной терапии. ГЭБ, специализированная часть сосудистой системы, состоит из базальной мембраны, содержащей белки внеклеточного матрикса (ламинин, гепарансульфат или коллаген), вместе с эндотелиальными клетками, перицитами, концами астроцитов и интернейронами [99]. Известно, что сосудистые, нейрональные и глиальные клетки взаимодействуют, образуя клеточную сеть, которую соответствующим образом называют нейроваскулярной единицей, участвующей в поддержании тканевого гомеостаза [100]. ГЭБ является самым большим барьером в ЦНС и имеет площадь поверхности 20 м2. Он считается критическим местом для обмена молекулами между кровью и ЦНС [101]. Поскольку NPS малы (в основном<200 nm)="" molecules,="" they="" have="" the="" advantage="" of="" being="" able="" to="" traverse="" this="" bbb.="" apart="" from="" size,="" properties="" such="" as="" charge,="" especially="" a="" positive="" charge,="" suitable="" surface="" functionalizations,="" the="" addition="" of="" targeting="" ligands="" such="" as="" cell-penetrating="" peptides="" and="" polyethylene="" glycol="" for="" improved="" circulation="" time="" in="" vivo="" imbue="" nps="" with="" the="" capacity="" to="" successfully="" cross="" the="" bbb="" [99].="" it="" has="" been="" observed="" that="" molecules="" penetrate="" the="" brain="" via="" the="" carrier-mediated="" transporter="" (cmt)="" (figure="" 4),="" which="" includes="" the="" glucose="" transporter="" (glut1),="" adenosine="" transporters="" (cnt2),="" large="" neutral="" amino-acid="" transporters="" (lat1),="" and="" monocarboxylic="" acid="" (mct1)="" [8].="" drug="" delivery="" of="" chemo-nanotherapeutics="" in="" the="" treatment="" of="" brain="" diseases="" portrayed="" the="" use="" of="" circulating="" cells,="" such="" as="" exosomes,="" erythrocytes,="" neutrophils,="" and="" leukocytes,="" which="" possess="" the="" ability="" to="" spontaneously="" cross="" the="" bbb="">

Рисунок 4. Общие механизмы прохождения через ГЭБ. (A) транспортер, опосредованный переносчиком, (B) трансцитоз, опосредованный рецептором, и (C) трансцитоз, опосредованный адсорбцией.

Другие способы проникновения можно увидеть в рецептор-опосредованном трансцитозе (РМТ) и адсорбционно-опосредованном трансцитозе (АМТ) (рис. 4) [103]. Первая транспортная система основана на способности NP модифицироваться, чтобы иметь лиганды, позволяющие эффективно связываться с рецепторами, присутствующими в BBB. Лиганды могут быть направлены на такие мишени, как транспортеры GLUT1 или альбумина [104], рецепторы лактоферрина (Lf), LRP1) [105] или рецепторы трансферрина (TfR) (с использованием лиганда трансферрина) [106]. Было установлено, что TfR иногда сверхэкспрессируется в нейронах [107] и клетках глиомы [108]. Однако с возрастом уровни трансферрина в головном мозге снижаются, и наблюдается резкое снижениенейродегенеративныйзаболевания, такие как AD или PD [109]. Тем не менее, TfR предлагает большие перспективы в доставке терапевтических агентов через гематоэнцефалический барьер в мозг [110]. Таким образом, RMT использует роль поверхностно-меченых наноносителей для эффективного проникновения нанокомплексов в мозг. Однако выбор и концентрация присоединяемого лиганда будут ограничивающими факторами, определяющими успех эндоцитоза. Золотые наносферы [111] и золотые нанозвезды, конъюгированные с проникающим в клетку пептидом, продемонстрировали способность пересекать ГЭБ [112].

Однако АМТ демонстрирует несколько иной механизм действия, поскольку использует электростатические взаимодействия между отрицательно заряженным ГЭБ и положительно заряженными НЧ [91]. Сообщалось, что агглютинин зародышей пшеницы, декорированный золотыми наночастицами, поглощался нервными окончаниями и ретроградно транспортировался по аксонам в ЦНС [113]. Все эти транспортеры-носители позволяют ослабить поверхностно-активные вещества ГЭБ, тем самым нарушая соединения эндотелиальных клеток и обеспечивая проникновение НПВ в мозг. Исследования на моделях мышей показали отсутствие повреждения головного мозга [114,115]. Однако было отмечено, что выбор модели заболевания in vivo для проверки способности НЧ проникать через ГЭБ имеет решающее значение, поскольку проницаемость ГЭБ может различаться у грызунов и человека [99]. Обширные исследования транспортных молекул позволяют исследователям создавать терапевтические средства, которые могут использовать естественные физиологические барьеры для безопасной и эффективной доставки фармакологически активных агентов в мозг. Оптимальными параметрами для прохождения нанокомпозита через ГЭБ были предложены низкая молекулярная масса (<400 da),="" a="" suitable="" charge,="" log="" p="" <="" 2,="" non-ionization,="" the="" presence="" of="" hydrogen="" bonds="" (8–10),="" and="" lipophilicity="">

Помимо использования НЧ для доставки лекарств, которое показало некоторую нестабильность in vivo и иммунные реакции из-за внутривенного введения наносистемы, можно рассмотреть применение генной терапии с использованием носителей НЧ.

Экстракт цистанхе трубчатой: против болезни Паркинсона

3.3. Генная терапия

Идея генной терапии восходит к 1960-м годам и представляет собой лечение или профилактику заболеваний или генетических нарушений с помощью терапевтических нуклеиновых кислот [116]. Несмотря на высокие показатели трансфекции, полученные с использованием носителей вирусной доставки, недостатки, связанные с низкой нагрузочной способностью, крупномасштабным производством, размером гена, который он может нести, и факторами безопасности потенциальной онкогенности и иммуногенности побудили к разработке невирусных методов. . Невирусные системы доставки генов имеют большую способность нацеливаться на клетки/ткани, значительно сниженную онкогенность и иммуногенность, повышенную эффективность препарата при низкой стоимости, отсутствие ограничений по размеру генетического груза и возможность структурных манипуляций [117]. ]. Из невирусных носителей доставки наиболее изученными на сегодняшний день являются катионные полимеры и конструкции на основе липидов, особенно катионные липосомы, при этом использование неорганических НЧ в настоящее время набирает обороты.

NPS может преодолевать как внутриклеточные, так и внеклеточные барьеры, препятствующие доставке генов. Эти барьеры включают ядерное поглощение, избегание клиренса ретикулоэндотелиальной системой (RES), эндосомальное и лизосомальное ускользание, защиту генетического груза от деградации, высвобождение нуклеиновых кислот и нацеливание на специфические клетки [118]. Благодаря тому, что неорганические НЧ демонстрируют большее отношение площади поверхности к объему с настраиваемыми магнитными, оптическими и биологическими свойствами, их можно сконструировать для доставки генов с повышенной эффективностью путем изменения формы, химического состава и размера. Идеальный носитель для доставки генов должен обладать такими свойствами, как способность разрушать эндосомальную мембрану, пересекать плазматическую мембрану, связывать, конденсировать и защищать груз нуклеиновой кислоты, обеспечивать адресную доставку, стабильность в циркуляции и быть способным уклоняются от иммунной системы [118,119].

Обширные исследования патогенетических механизмовнейродегенеративныйрасстройств привело к выявлению специфических генетических дефектов, связанных с прогрессированием заболеваний. Генная терапия позволяет доставлять геномный груз, который включает микроРНК (миРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК), направляющую РНК (гРНК) и информационную РНК (мРНК). Исследования продемонстрировали успех стратегий подавления генов с помощью РНК-интерференции (РНКи), в которой используются siRNA, miRNA и piwi-взаимодействующая РНК для снижения синтеза целевых молекул мРНК [120]. При трансфекции синтетических двухцепочечных siРНК (размером 21–25 нуклеотидов) в клетки млекопитающих они с высокой степенью специфичности нацеливаются на специфические последовательности мРНК, что приводит к сайленсингу генов [75]. Революция в области РНК-интерференции открыла новые возможности для терапевтического вмешательства при широком спектре заболеваний, от рака донейродегенеративныйзаболевания [75,121]. В целом, успешное применение siRNA-опосредованного сайленсинга генов в медицине потребует подходящего средства доставки, предпочтительно наноносителя, который обеспечит безопасную и эффективную доставку siRNA. Редактирование генома недавно было введено в генную терапию и предвещает метод, который может напрямую воздействовать на аберрантные генетические изменения в пораженных участках [122].

Потенциальной мишенью в генной терапии является аномальное накопление белков с неправильной укладкой, таких как амилоидные -олигомеры и -синуклеин (Рисунок 1), которые вызывают деградацию, связанную с эндоплазматическим ретикулумом (ER), и стресс ER [123]. Агрегация этих белков в просвете ER последовательно вызывает дестабилизацию кальциевого гомеостаза ER и искажение передачи сигналов развернутого белкового ответа (UPR), что приводит к гибели нейронов посредством проапоптотических ответов [124,125]. Это можно преодолеть, нацелив передачу сигналов UPR на усиление сворачивания белка, как это было видно, когда БП лечили, нацеливаясь на снижение апоптоза дофаминергических нейронов и улучшая двигательную активность, тем самым задерживая прогрессирование заболевания. Это было разрешено с помощью генной терапии, которая включала нацеливание на сверхэкспрессию гена BiP (белок, регулируемый глюкозой 78), который связан со снижением реакции развернутого белка [126]. Следовательно, стратегии подавления генов могут быть успешными в таких случаях.

Кроме того, митохондриальная дыхательная дисфункция была отмечена при таких заболеваниях, как болезнь Хантингтона (БХ), БА, БП и БАС, что приводит к ограниченной регуляции качества митохондрий, истощению НАД+, окислительному повреждению, агрегации белков, нарушению синтеза АТФ и несбалансированному митохондриальному метаболизму. кальциевый гомеостаз [127–129]. Было замечено, что генная терапия преодолевает это явление путем либо ингибирования митохондриального повреждения, либо стимулирования митохондриального биогенеза. В качестве альтернативы нейротоксичность при экспериментальных БХ и БП может регулироваться сверхэкспрессией регуляторов митохондриального окислительного стресса и динамики, включая PGC-1, HSP70, TFEB [130, 131].

Другие механизмы патогенеза наблюдаются в аномальной передаче сигналов рапамицином (mTOR) при БП, БА и БХ, наряду с эпигенетической дисрегуляцией, аутофагией и дисфункцией микроглии и астроцитов [132]. Каждый механизм демонстрирует уникальные способы дисфункции из-за прогрессирования заболевания, и поэтому важно понять, какой механизм задействован у пациента с этими заболеваниями, чтобы назначить соответствующее лечение с максимальной эффективностью. Кроме того, генная терапия доказала свою эффективность при различных других заболеваниях. Поэтому он является отличным претендентом нанейродегенеративныйтерапии после исследований генетических аберраций у пациентов с БП и БА.

В таблице 3 показаны некоторые из NP, использовавшихся для генной терапии ЦНС с 2017 по 2020 год. Успех таких экспериментов расширил знания онаномедицинавнейродегенеративныйрасстройств, помогая в специфическом нацеливании на вызывающие гены или агрегированные белки. Стратегии генной терапии с использованием векторов наночастиц представляют собой привлекательные альтернативы, поскольку они потенциально могут удовлетворить многие требования по безопасной и эффективной доставке через биологические барьеры, особенно через гематоэнцефалический барьер. Помимо преимуществ генной терапии, биологический синтез NP хвастается собственным набором преимуществ в отношении используемых специфических экстрактов [133], которые могут работать синергетически с терапевтическим геном.

3.4. Наномедицина в клинических испытаниях — обновление

Было проведено несколько клинических испытаний с использованием препаратов в качестве ингибиторов секретазы и терапевтических антител при БА, лишь немногие из них были завершены, а большинство прекращено [8]. Интересно, что с 2003 г. в мире отсутствует разработка новых препаратов для лечения БА [138]. Это также было очевидно при недавнем поиске в библиотеке NIH, где только два исследования были связаны с доставкой NP. Одна озаглавлена ​​«Оценка безопасности, переносимости и эффективности интраназальных наночастиц APH-1105, нового модулятора альфа-секретазы при когнитивных нарушениях от легкой до умеренной степени, вызванныхболезнь Альцгеймераболезнь» должно начаться только в 2023 году. Второе испытание, «Фаза 2, пилотное открытое, последовательная группа, слепое исследование исследователем магнитно-резонансной спектроскопии (31P-MRS) для оценки эффектов CNM-Au8 для биоэнергетического улучшения нарушения окислительно-восстановительного состояния нейронов вболезнь Паркинсонаболезнь", началось в декабре 2019 г. и должно было быть завершено в июле 2021 г. [139]. В этом исследовании использовались нанокристаллы золота. Хотя нанокристаллы золота недавно были одобрены для лечения рассеянного склероза [140], ожидаются обновления текущего исследования. результаты могут только способствовать использованию NP в будущих исследованиях.

цистанхе трубчатая

4. Выводы

Наномедицинастановится высокоэффективным инструментом для преодоления барьеров, которые все еще бросают вызов традиционной медицине. Сочетаниенаномедицинаи генная терапия может быть использована для большего терапевтического эффекта. В этом обзоре были выделены некоторые гены, участвующие в прогрессировании болезни Паркинсона и АтД, которые могут открыть перспективы исследований генной терапии. Более глубокое понимание причин генетических аберраций и того, как они приводят к нейродегенерации, может привести к разработке индивидуальной терапии в ответ на конкретный тип мутации, представленный индивидуумом. Хотя излечение не может быть немедленным, такие научные исследования создают ступеньки для создания стратегии лечения, которая в один прекрасный день уничтожит болезни, связанные с повреждением нейронов, и поможет миллионам пациентов во всем мире жить нормальной и здоровой жизнью. Сочетаниенаномедицинаи неврология потенциально может предоставить новые решения для многих расстройств, связанных с ЦНС, включая AD и PD. Набор наночастиц, доступных в настоящее время, должен пройти строгие испытания на токсичность и стабильность и должен быть оптимизирован для доставки генов или лекарств в ЦНС.

Вклад автора:Концептуализация, KJ и MS; программное обеспечение, КЖ и МС; валидация, МС; ресурсы, мс; курирование данных, KJ; написание – черновая подготовка, KJ; написание-обзор и редактирование, MS; надзор, МС; администрирование проекта, MS; финансирование приобретения, MS Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование:Исследования в этой области финансировались Национальным исследовательским фондом Южной Африки, номера грантов 120455 и 129263.

Заявление Институционального контрольного совета:Непригодный.

Заявление об информированном согласии:Непригодный.

Заявление о доступности данных:Непригодный.

Конфликт интересов:Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.