Часть IV Исследование модели 5-Fu/5-Fu+L-OHP-индуцированной супрессии костного мозга у мышей

В настоящее время широко используемые методы построения животных моделей подавления костного мозга включают лучевое моделирование [1,2], моделирование внутрибрюшинного введения циклофосфамида [3-5], 5-фторурацил (5-фторурацил, { {5}}ФУ) моделирование внутрибрюшинной инъекции [6,7], облучение в сочетании схимиотерапевтический препаратмоделирование соединений [8,9], моделирование через зонд противоэпилептического препарата карбамазепина [10] и др. Различные методы моделирования вызывают разные механизмы подавления костного мозга, а влияние на различные клетки крови и их степень различны; разные химиопрепараты в силу разного механизма действия имеют и определенные различия в влиянии на костномозговое кроветворение. Поэтому идеальная животная модель супрессии костного мозга имеет большое значение для изучения влияния химиотерапевтических препаратов на костномозговое кроветворение.

В клинической практикеАдъювантная химиотерапия при колоректальном ракев основном применяется режим 5-FU и режим 5-Fu в сочетании с оксалиплатином (оксалиплатин, L-OHP). Были проведены соответствующие исследования по использованию только 5-Fu для создания животной модели подавления костного мозга. Однако сфера использования 5-Фу относительно широка. Литературные сообщения включают 110 мг/кг, внутрибрюшинную инъекцию (в/б) в день 1 и день 5 для моделирования [7, 150 мг/кг, внутрибрюшинно, день 1 для моделирования 16, 11], 200 мг/кг, внутрибрюшинно, день 1 для моделирования [{{ 15}}] и 250 мг/кг, внутрибрюшинно, 1 день для моделирования [16]. Однако не было сообщений об использовании 5-Fu в сочетании с L-OHP для создания животной модели подавления костного мозга. Ю Линхун и др. [17] использовали 5-Fu в сочетании с L-OHP для создания модели повреждения печени на животных. Ссылаясь на метод введения и дозировку, описанную в литературе, группа провела предварительное исследование дозировки 5-Fu в сочетании с L-OHP, чтобы установить животную модель кости.подавление костного мозгаи сравнили метод моделирования 5-Fu 200 мг/кг, внутрибрюшинно, d1 и метод моделирования 5-Fu 187,5 мг/кг + L-OHP 9 мг/кг, внутрибрюшинно, d1. Результаты показали, что дозировка этих двух моделей была слишком велика. Таким образом, цель данного исследования состоит в том, чтобы продолжить изучение оптимальной дозировки 5-Fu-индуцированной модели подавления костного мозга на животных и дозировки 5-Fu в сочетании с моделированием L-OHP, чтобы обеспечить самая идеальная модель животного дляследующий шаг изучения эффективностиимеханизм рецепта Циту Эржи.

ТРАВА ЦИСТАНЧА ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ПОЧЕК

Служба поддержки Wecistanche

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Телефон:+86 15292862950

Материалы и методы

1 Экспериментальные материалы

1.1 Экспериментальные животные

100 мышей-самцов BALB/c, не содержащих специфических патогенов (SPF), весом 20 г±2 г были приобретены у SBEF (Пекин) Biotechnology Co., Ltd. и помещены в клетки в Центре экспериментальных животных больницы Сиюань Китайской академии китайской медицины. наук (квалификационный аттестат: SYXK (Пекин) № 2015-0011). Все мыши получали адаптивное питание в течение 1 недели и имели свободный доступ к воде и пище в течение периода кормления. Условия кормления: температура в помещении 20-26 градусов, относительная влажность 40%~60%, время света/темноты 12/12 часов. Этот эксперимент строго соответствует соответствующим правилам Комитета по этике содержания экспериментальных животных больницы Сиюань Китайской академии китайских медицинских наук и стандартам этики животных.

1.2 Основные экспериментальные препараты и реагенты

5-Фу (фторурацил для инъекций) Оксалиплатин для инъекций

0.01M фосфатный буфер (буфер PBS) Разбавитель для анализа клеток крови (MEK-640)

Чистящий раствор для анализа клеток крови (МЭК-680) Гемолитический агент для анализа клеток крови (МЕК-680) Чистящий раствор для анализатора клеток крови

Окраска гематоксилином Харриса 0, окраска эозином, 5 %

Нейтральное средство для герметизации десен

Раствор для декальцинации образцов тканей типа минеральной кислоты

1.3 Основные приборы и оборудование

Автоматический счетчик клеток крови (MEK6318) Пробирка для забора капиллярной крови (20 мкл)

Наконечник для пипетки объемом 1000 мкл

Дегидратор биологических тканей Tissue-TEK VIP6 Машина для заливки биологических тканей Tissue-TEK TEC Слайсер Leica RM2235

Устройство для подбора ломтиков Leica HI1210 Машина для выпечки ломтиков Leica HI1220

Автоматический окрасочный аппарат Leica ST5020 Автоматический прибор для заключения срезов Leica CV5030 Микроскоп Olympus Bx53

Система контроля качества и управления данными патологии Path QC

Прочее: пипетка, обычные электронные весы, хирургические ножницы, пинцет, спирт 75%, марля медицинская, стерильные ватные шарики, шприцы и т.п.

1.4 Приготовление химиотерапевтических препаратов

(1) Схема с одним препаратом 5-Fu

Растворите {{0}}Fu (0,25 г/10 мл) в 40 мл 0,9% раствора NaCl, чтобы приготовить раствор с концентрацией 5 мг/мл для резервного использования.

(2) 5-Fu в сочетании с режимом L-OHP

Растворите {{0}}Fu (0,25 г/10 мл) в 40 мл 0,9%-ного раствора NaCl, чтобы приготовить раствор с концентрацией 5 мг/мл для резерва. использовать. Растворите 1 тюбик L-OHP (50 мг) в 5 мл 5% раствора глюкозы и продолжайте разбавлять 5% раствором глюкозы до раствора 0,5 мг/мл для использования.

Таблица 4-1 Моделирование режима приема лекарств

В соответствии с вышеуказанным режимом дозирования всех мышей взвешивали и вводили дозы индивидуально в соответствии с массой тела. В группе двойного лечения временной интервал между введением 5-Fu и L-OHP составлял более 5 часов [17].

(2) Показатели оценки модели подавления костного мозга

Показатели оценки модели подавления костного мозга включают снижение количества клеток периферической крови [18-22] или количество клеток периферической крови в сочетании с ядросодержащими клетками костного мозга [9.23-25]. В данном исследовании использовался второй метод для оценки эффекта моделирования.

2.2 Показатели и материалы наблюдений

2.2.1 Общее состояние мышей

В ходе эксперимента ежедневно наблюдали за питанием, дефекацией, активностью, состоянием, психическим состоянием и состоянием шерсти каждой группы мышей. Если мыши умирали, их вовремя фиксировали.

2.2.2 Изменение веса мышей в каждой группе

Взвешивайте и записывайте вес каждой мыши перед введением дозы в день моделирования (d0), а также взвешивайте и записывайте вес каждой мыши через день после моделирования.

2.2.3 Изменения количества клеток периферической крови

Закрепите мышь фиксатором, обнажите хвост и погрузите его в горячую воду на 45-50 градусов. После высыхания хвоста отрежьте 1-2 мм кончика хвоста. Быстро и осторожно погладьте хвост от основания к кончику 2-3 раз. Используйте пробирку для сбора капиллярной крови, чтобы собрать 20 мкл крови, разбавить ее приготовленным разбавителем клеток крови и выполнить анализ клеток крови на аппарате. Собирайте кровь каждый день в установленное время; весь забор крови выполняется одним человеком. К показателям обнаружения относятся: лейкоциты, эритроциты, гемоглобин и тромбоциты.

2.2.4. Изменения количества ядросодержащих клеток костного мозга

За день до отбора проб возьмите микропипеткой 1000 мкл раствора PBS, разбавьте его до EP-пробирки емкостью 2 мл и храните в холодильнике с температурой 4 градуса для дальнейшего использования. На 6-й день из каждой группы случайным образом выбирали по 8 мышей и умерщвляли путем смещения шейных позвонков. Под стерильным чистым столом хирургическими ножницами срезали шерсть возле бедренной кости, удаляли правое бедро и обертывали его медицинской марлей для удаления остатков мягких тканей. Используйте иглу шприца объемом 1 мл (игла № 4) для извлечения раствора PBS в трубку EP, просверлите один конец бедренной кости, чтобы промыть костный мозг в трубку EP; несколько раз промойте и аспирируйте, чтобы удалить клетки костного мозга, пока бедренная кость не побелеет. Приготовленную суспензию клеток костного мозга пропускали через 200-нейлоновую сетку. Используйте автоматический счетчик клеток крови для обнаружения ядросодержащих клеток костного мозга. На 13-й день остальных мышей умерщвляли таким же образом и собирали образцы.

2.2.5 Патология костного мозга. Окрашивание HE.

На день 6, после того как мышей в каждой группе умерщвляли путем вывиха шейных позвонков, хирургическими ножницами под стерильным чистым столом срезали шерсть возле бедренной кости, удаляли левое бедро, делали восковые блоки, срезы и окрашивали HE.

(1) Этапы подготовки и изготовления восковых блоков

① Отбор проб: зафиксируйте ткань 4% параформальдегидом на срок более 24 часов, замочите в растворе для декальцинации на 24-48 часов, проколите ткань булавкой, разрежьте и обрежьте ткань после того, как она размягчится, и поместите ее в восковой блок. коробка;

② Обезвоживание: ткань последовательно помещают в 70% спирт (2 часа), 80% спирт (1,5 часа), 95% спирт I (1,5 часа), 95% спирт II (1,5 часа). часов), 100% спирта I (0,5 часа) и 100% спирта II (0,5 часа) и обезвоживают градиентным способом.

③ Прозрачность: ткань последовательно помещают в раствор безводного этанола и ксилола (объемное соотношение 1:1), ксилола I и ксилола II на 40 минут каждый.

④ Погружение в воск: ткань последовательно помещают в смесь ксилола и парафина (1:1), парафина I и парафина II на 20 минут каждый. Погружение в воск осуществляется в устройстве с постоянной температурой 58 градусов, чтобы парафин оставался расплавленным.

⑤ Заливка: после маркировки блока ткани предварительно нагрейте пинцет, введите расплавленный парафин в форму, а затем поместите блок ткани и подождите, пока парафин затвердеет.

⑥ Нарезка: после заливки поместите блок тканевого воска на слайсер, отрегулируйте угол слайсера и разрежьте блок ткани на кусочки толщиной 4-5 мкм.

⑦ Приклеивание: разложите ломтики парафина в воде с температурой 42 градуса, возьмите ломтики один за другим с помощью предметного стекла и приклейте их на предметное стекло.

⑧ Выпечка: поместите застрявшее предметное стекло в коробку с постоянной температурой около 70 градусов и запекайте в течение 1,5 часов.

(2) Этапы окрашивания HE:

① Депарафинизация путем замачивания в ксилоле I и II по 15 минут каждый.

② Замочить в 100% спирте I и II на 5 минут.

③ Замочите в градиентном спирте 95%, 85% и 75% на 3 минуты и промойте дистиллированной водой.

④ Окрашивание гематоксилином в течение 1-3 мин и промывание дистиллированной водой.

⑤ Дифференциация соляной кислоты и спирта в течение 2-3 с, промыть дистиллированной водой.

⑥ Погрузить в аммиачную воду до синего цвета на 1 минуту, промыть дистиллированной водой.

⑦ Окрашивание эозином в течение 5 мин.

⑧ Погрузить в градиентный спирт 75%, 85%, 95% на 2 минуты.

⑨ Погрузить в 100% спирт I, IⅡ на ​​3 минуты каждый.

⑩ Погрузить в ксилол I, Ⅱ на 5 минут каждый.

⑪ Запечатайте нейтральной резинкой.

2.3 Статистические методы

SPSS26.0 использовался для статистического анализа данных. Данные измерений выражали как среднее значение ± стандартное отклонение (x±s). Сначала данные проверялись на нормальность и однородность дисперсии: для нормально распределенных данных использовался однофакторный дисперсионный анализ для сравнения между несколькими группами: когда дисперсия была равна, для попарного сравнения использовался тест LSD; если дисперсия не была равна, для парного сравнения использовался критерий Тамхане t2; если оно не соответствовало нормальному распределению, использовался непараметрический тест. П<0.05 was considered statistically significant.