ЧАСТЬ Ⅱ: SARS-CoV-2 Инфекция на модели сирийского хомяка вызывает воспаление, а также нарушение регуляции интерферона типа I как в респираторных, так и в недыхательных тканях, включая сердце и почки

для получения дополнительной информации:ali.ma@wecistanche.com

Маген Эллен Фрэнсис, Уна Гончин и др.

НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ЧАСТЬ Ⅰ

Абстрактный

COVID-19(коронавирусная болезнь 2019 г.), вызваннаяSARS-CoV-2(тяжелый острый респираторный синдром коронавирус 2) инфекция представляет собой заболевание, поражающее несколько систем органов. Модель, которая фиксирует все клинические симптомыCOVID-19, как и болезнь дальнобойщиков, нужна. Мы исследовали реакцию хозяина, связанную с инфекцией, в нескольких основных системах органов, включая дыхательные пути, сердце ипочкипослеSARS-CoV-2инфекции у сирийских хомяков. Мы обнаружили значительное увеличение воспалительных цитокинов (IL-6, IL-1бета и TNF) и интерферонов типа II, тогда как интерфероны типа I ингибировались. Исследование внелегочной ткани показало воспаление впочка, печень и сердце, в которых также отсутствовала активация интерферона I типа. Гистологически в сердце имелись признаки миокардита и микротромбов.почкабыло тубулярное воспаление. Эти результаты дают представление о полиорганном заболевании, с которым сталкиваются люди сCOVID-19и, возможно, пролонгированное течение болезни у людей с постострыми последствиямиSARS-CoV-2(ПАСК). 2) коронавирусная инфекция может поражать несколько систем органов, включая дыхательные пути, мочевыводящие пути, неврологическую систему и сердечно-сосудистую систему. Для надлежащего изучения этого заболевания и оценки терапии была разработана модель, охватывающая все клинические симптомыCOVID-19требуется для. Известно, что повреждение, возникающее после вирусной инфекции, часто связано с собственными иммунными реакциями хозяина. Поэтому здесь мы исследовали, как иммунные реакции хозяина регулируются в нескольких основных системах органов, включая дыхательные пути, сердце ипочкипослеSARS-CoV-2инфекции у сирийских хомяков. Мы обнаружили значительное увеличение воспалительных цитокинов (IL-6, IL-1бета и TNF), а также противовирусных цитокинов, называемых интерферонами I типа. Интересно, что интерфероны типа I противовирусного ответа ингибировались в дыхательных путях. Исследование внелегочной ткани показало воспаление впочка, печень и сердце, в которых также отсутствовала активация интерферона I типа. Гистологически в сердце имелись признаки миокардита и микротромбов.почкабыло тубулярное воспаление. Эти результаты дают представление о полиорганном заболевании, с которым сталкиваются люди сCOVID-19и, возможно, пролонгированное течение болезни у людей с постострыми последствиямиSARS-CoV-2(ПАСК).

Click to Cistanche использует для функции почек

Инфекция SARS-CoV-2 приводит к значительному воспалению или иммунной регуляции в сердце, лимфатических узлах и селезенке, а также к эозинофильным сигнатурам в толстой кишке.

Иммунные маркеры воспаления, адаптивный иммунитет и противовирусные реакции также оценивались в недыхательных тканях наряду с гистопатологией тканей. Исследовали медиастинальные лимфатические узлы, сердце,почка, селезенка, печень и толстая кишка для регуляции иммунных мишеней, классифицированных, как указано выше, по типу I IFN, типу II / общему ответу на IFN и врожденным / адаптивным медиаторам (рис. 6), а также для иммунопатологии (рис. 7 и S4). Если первоначальная оценка гистопатологии предполагала участие специфических иммунных механизмов (рис. S4), выполнялось сканирование с высоким разрешением для получения большей глубины информации (рис. 7). Медиастинальные лимфатические узлы не удалось восстановить на 15-й день. Соответствующие значения для экспрессии гена можно найти в таблице S2. Реакции IFN типа I и типа II во всех внелегочных органах, кроме печени, имели такие же профили регуляции, как и в легких и носовых раковинах (рис. 6). Генная регуляция характеризовалась снижением ответов типа I и усилением ответов типа II. STAT2 был значительно снижен в медиастинальном лимфатическом узле,почка, селезенка и толстая кишка. В сердце наблюдалось значительное и устойчивое снижение IRF1, в то время как в толстой кишке наблюдалось снижение IFN-бета (рис. 6). Наоборот, заметное увеличение IFN-gamma наблюдалось в медиастинальных лимфатических узлах ипочкаи в меньшей степени в сердце и селезенке. CXCL10, хемоаттрактант Т-клеток, был повышен до высоких уровней в селезенке, печени и медиастинальном лимфатическом узле, где регуляция была двухфазной в лимфатическом узле (рис. 6). Регуляция генов врожденных/адаптивных медиаторов в селезенке и лимфатических узлах наблюдалась для всех исследованных иммунных мишеней, за исключением TGF-бета, IL-5R и CCR3, которые не регулировались эффективно. В частности, значительная регуляция CD3, CD4, CD8A, IL-2, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL{{13 }}, и IL-12 был отмечен в этих вторичных иммунных органах. Регуляция медиаторов врожденного/адаптированного иммунитета была особенно интересна в сердце, где IL-2, IL-10, IL-4 и IL-5 были увеличены в 100 раз по сравнению с исходным уровнем. . Наибольшая активация воспалительных цитокинов была обнаружена в сердце, затем в почках, печени и медиастинальных лимфатических узлах. В сердце IL -12 был значительно повышен на ранней стадии и, наряду с TNF, оставался повышенным на 15-й день pi. IL-6 и IL-1бета также временно индуцировались в ткани сердца на 5 и 8 день (рис. 6). Значительные изменения в сердце наблюдались при гистологическом анализе (S4 Fig). Визуализация с высоким разрешением обнаружила признаки микротромбов (рис. 7А, белые стрелки), а также миокардита (рис. 7В, белые стрелки) в сердце. Активация CD14, IL-1бета и TNF повышалась в почках на ранних стадиях, но снижалась к 8-му дню до 12 pi (рис. 6), что совпадало с инфильтрацией воспалительных клеток в почку и, возможно, с острым повреждением почек или канальцев (указано белыми стрелками, рис. 7C). Экспрессия IL-6 сохранялась в печени, где IL-1бета также увеличивалась в поздние моменты времени. В медиастинальном лимфатическом узле наблюдалось двухфазное увеличение IL-12 с преходящим повышением IL-6 и TNF до уровней 12, 8 и 11, соответственно. В толстой кишке наблюдалась значительная регуляция IL-5, IL-5R и CCR3 с инфильтрацией эозинофилов (рис. 7D), но минимальная регуляция любых других врожденных/адаптивных медиаторов. В дополнение к анализу внелегочных органов мы проанализировали химический состав крови животных с течением времени для оценки дисфункции органов (S5 Fig). Мы анализировали глюкозу, альбумин, щелочную фосфатазу, аланинтрансферазу, азот мочевины крови, общий билирубин и общий белок как признак функции печени [27]. Для оценки состояния почек анализировали кальций, калий, альбумин, амилазу, азот мочевины крови и общий белок [27]. Состояние желудочно-кишечного тракта оценивали по содержанию натрия, калия и щелочной фосфатазы [27]. Сердечная функция измерялась с использованием натрия, калия и аланинтрансферазы [27]. Активацию глобулина расценивали как признак антигенной стимуляции [27]. Из 14 исследованных молекул только амилаза и глюкоза были значительно повышены у инфицированных животных по сравнению с контрольной группой, достигая максимума 1700 ЕД/л и 280 мг/дл соответственно на 8-й день пи. Кроме того, изменения концентрации калия ([К плюс ]) были наиболее заметными и в основном зависели от времени в течение периода исследования, поскольку у большинства людей наблюдалось увеличение [К плюс ] с наибольшим изменением, наблюдаемым на 15-й день. в альбумине также был заметным, но умеренным у многих животных. Концентрация общего белка немного увеличилась у большинства субъектов, но это изменение было относительно легким и, вероятно, клинически незначимым. Другие маркеры печени достигли пика позже, включая глюкозу (280 мг/дл) на 8-й день, щелочную фосфатазу (ЩФ) на 12-й день (3 ЕД/л) и азот мочевины крови (АМК) (22 мг/дл). на 15-й день. Аланинтрансфераза (АЛТ), хотя и достигла пика на 2-й день, была высокой на 12-й день чуть менее 100 ЕД/л, что свидетельствует о возможном повреждении печени. Почечные маркеры также достигли пика позже, на 8-й день для амилазы (1700 ЕД/л) и на 15-й день для калия и азота азота (12 и 22 мг/дл соответственно). АМК, за немногими исключениями, имел возможное зависящее от времени увеличение концентрации. Кальций, напротив, достиг пика на 2-й день при 2,6 мг/дл, но упал в референтные диапазоны. Маркеры здоровья желудочно-кишечного тракта и сердца, такие как натрий, демонстрировали минимальную регуляцию, в то время как [K плюс ] увеличивался относительно линейно на протяжении всего времени заражения, достигая пика на 15-й день (12 мг/дл). ЩФ (желудочно-кишечный маркер) был высоким на 5 и 8 день на уровне 3 ед/л, а АЛТ (сердечный маркер) был повышен у инфицированных хомяков по сравнению с неинфицированными хомячками на 2, 8 и 12 день на уровне 75–100 ЕД/л, но различия не были существенными. Наконец, глобулин достиг пика на 2-й день при 0,6 г/дл и снижался относительно линейно с течением времени. В совокупности анализ крови указывает на некоторую дисрегуляцию во внелегочных органах, а также на антигенную стимуляцию в ответ наSARS-CoV-2.

Рис. 6. Инфекция SARS-Cov-2 у хомяков приводит к увеличению количества генов, связанных с воспалительными и иммунными медиаторами, в некоторых внелегочных органах, что может указывать на миокардит, адаптивную иммунную эволюцию и инфильтрацию эозинофилов в толстый кишечник.qRT-PCR проводили на РНК, выделенной из средостенных (M) лимфатических узлов, сердца, почек, селезенки, печени и толстой кишки изSARS-CoV-2привитые хомяки. Образцы оценивали в отношении реакции на интерферон I типа (IFN-бета, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), реакции на интерферон II типа (IFN-гамма, IRF2, STAT1, CXCL10) и врожденной/ адаптивный медиатор (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-бета, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, Гены IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1бета, IL-6, TNF используя праймеры ПЦР, специфичные для последовательностей хомяков (таблица 1). Изменение кратности рассчитывали с помощью ΔΔCt по сравнению с исходным уровнем (день 0) с BACT в качестве гена «домашнего хозяйства». N равно 3 для всех моментов времени.

Обсуждение

ПервоначальноSARS-CoV-2считалось, что инфекция в основном вызывает респираторное заболевание, но теперь ясно, чтоCOVID-19это многоликое заболевание, поражающее несколько систем органов[25,26]. Чтобы лучше понять происхождение болезни и множество клинических симптомов, наблюдаемых у людей, мы исследовали иммунопатологию в дыхательных путях, а также в недыхательных органах во время эпидемии.SARS-CoV-2инфекции у сирийских хомяков. Заражение 105 TCID50SARS-CoV-2приводит к легкой и средней степени тяжести заболевания. Инфекционный вирус в основном содержался в дыхательных путях, хотя вирусная РНК присутствовала во всех оцениваемых тканях. Профилирование ответа хозяина в дыхательных путях выявило ингибирование ответа IFN I типа с сопутствующим увеличением IFN типа II, воспалительных цитокинов, врожденных и адаптивных цитокинов. Исследование внелегочных органов также обнаружило сходный профиль передачи сигналов IFN I и II типов; однако также была идентифицирована тканеспецифическая иммунная регуляция. В частности, значительная экспрессия врожденных и адаптивных медиаторов была выявлена ​​в сердце и селезенке. Поскольку противовирусное лечение во времяSARS-CoV-2инфекция эффективна только в течение короткого промежутка времени[28], тяжелыеCOVID-19считается следствием нарушения регуляции иммунного ответа [29]. Понимание иммунного патогенеза необходимо для определения терапевтических целей и лечения острых нереспираторных симптомов, связанных сCOVID-19включая учащенное сердцебиение или мигрень и более длительные состояния в фазе восстановления, такие как постострые последствияSARS-CoV-2инфекция (PASC), также называемая длительным COVID[30].

Рис. 7. Некоторые внелегочные органы имеют отчетливую патологию после заражения SARS-CoV-2 с признаками микротромбов и миокардита в сердце, повреждением канальцев в почках и эозинофильной инфильтрацией в толстой кишке.Сердце, почку и толстую кишку брали у каждого животного при вскрытии и фиксировали в 10-процентном формалине перед заливкой парафиновым блоком. Ткани окрашивали H&E. В тканях сердца были обнаружены микротромбы (белые стрелки) в течение нескольких дней (А), а также миокардит на 8-й день (белая стрелка) (В). Почка имела острую травму/трубчатую травму (белые стрелки) (С). В толстой кишке была эозинофильная инфильтрация (белые стрелки) (D). Окрашенные ткани визуализировали и визуализировали с помощью сканера слайдов Aperio ScanScope XT. Показанные изображения являются репрезентативными для 3 животных в группе на момент времени.

Первичный очаг инфекции, влияющий на передачуSARS-CoV-2у людей — дыхательные пути. Поэтому первоначальным объектом нашего исследования были дыхательные пути, включая сопутствующие иммунные реакции и иммунопатологию. Здесь мы продемонстрировали инфекцию верхних и нижних дыхательных путей и связанное с ней заболевание после заражения SARS-CoV-2 у сирийских хомячков. Вирусная инфекция в легких привела к тяжелой патологии, характеризующейся инфильтрацией воспалительных клеток, что привело к бронхопневмонии на 5-й день после рождения и кровотечению на 8-й день. Эти результаты согласуются с инфекцией SARS-CoV-2 в предыдущих исследованиях на сирийских хомяках [19, 20,31,32] и более крупных моделей животных, включая макак-резусов[33], а также тяжелую пневмонию, выявленную у некоторых людей.COVID-19пациентов[34-36]. Согласованность данных поддерживает использование хомяка для моделированияSARS-CoV-2инфекционное заболевание органов дыхания человека и связанная с ним иммунопатология. Мы также отметили, что у некоторых хомяков наблюдалась большая потеря веса, что коррелировало с более высокой вирусной нагрузкой. Дифференциальный вес мог быть связан с естественным инстинктом хомяков прятать пищу за щеками, неэффективной прививкой или наличием врожденных свойств хозяина, которые могут привести к дифференциальной потере веса и репликации вируса в этом поголовье животных. Поскольку всех животных проверяли на наличие пищи во рту, и все животные были положительными наSARS-CoV-2вируса, мы не считаем, что этот результат является отражением ошибки взвешивания или плохой инокуляции. Требуется дополнительная работа, чтобы определить, есть ли генетические различия у сирийских хомяков из реки Чарльз. Понимание чистоты поголовья животных даст важную информацию для использования этих животных в терапевтических исследованиях SARS-CoV-2, а также возможность использования этих знаний для разработки более тяжелого хомяка.SARS-CoV-2модель. В нашем исследовании мы также выявили повышенную регуляцию ключевых воспалительных генов, таких как IL-6 и TNF, в легких и носовых раковинах, что подтверждает предыдущее иммунное моделирование у хомяков [32,37]. Эти результаты важны, поскольку было показано, что эти воспалительные маркеры являются предикторами тяжелого заболевания посредством оценки крови у людей [38-42]. Более глубокий анализ реакции хозяина на SARS-CoV-2 в респираторных тканях хомяков был проведен с использованием анализа секвенирования транскриптома [43,44]. Хоугланд и его коллеги оценили легкиеSARS-CoV-2инфицированных хомяков для регуляции иммунных генов хозяина и обнаружили выраженную активацию IL-6, TNF и IL-1бета[43], что согласуется с нашими результатами ПЦР. В другом исследовании анализ секвенирования отдельных клеток выявил заметный ответ Т-клеток, включая активацию IFN-gamma и IL-2[44], двух маркеров, которые, как мы также отметили, в высокой степени экспрессируются в легких. Кроме того, наши анализы легких выявили повышенную регуляцию маркеров Т-клеток CD3, CD4 и CD8A. Важно отметить, что анализ qRT-PCR, о котором мы сообщили в нашем настоящем исследовании, согласуется с этими другими исследованиями, тем самым подтверждая использование qRT-PCR в качестве метода быстрой оценки эффективности вакцин и терапевтических средств, оцениваемых при SARS-CoV хомяка{{ 13}} модель. Наши профили qRT-PCR содержат целевые биомаркеры, которые можно легко использовать. Наше исследование и интерпретация были ограничены только наличием анализа патогенеза. Будущие исследования должны использовать нашу панель иммунных мишеней для использования в вакцинных и терапевтических исследованиях.

Противовирусный ответ необходим для начального контроля вируса путем активного разрушения репликации вируса и иммунной стимуляции для ограничения распространения на другие клетки. После выявления присутствия вируса или вирусных антигенов индукция интерферонов играет центральную роль в установлении антимикробного состояния внутри клеток, где баланс между интерферонами и другими врожденными цитокинами имеет решающее значение для эффективного действия [45]. Недавно ингибирование интерферонов типа I (IFN-альфа и IFN-бета) было связано с тяжелым заболеванием уCOVID-19предполагая, что вирус способен блокировать противовирусный иммунитет, что приводит к усилению патогенеза [14,46,47]. В нашем исследовании мы обнаружили, что хомяки, инфицированныеSARS-CoV-2имеют типичный ответ IFN II типа. Напротив, ответ типа IIFN подавляется, о чем свидетельствует снижение экспрессии гена IFN-бета и увеличение экспрессии гена IRF2, антагониста типа I. Многочисленные исследования продемонстрировали нарушение IFN-ответа I типа после инфицирования SARS-CoV-2 in vitro[14,48-51]. Нарушение регуляции IFN, о котором мы здесь сообщаем, еще не анализировалось в респираторной ткани людей с тяжелойCOVID-19, но системные иммунные анализы крови показали аналогичные результаты [14,46,47,52]. Хотя механизмы, ингибирующие реакции интерферона I типа, полностью не выяснены, в эту дисрегуляцию вовлечены вирусные факторы и факторы хозяина [53, 54].

Нарушение регуляции интерферонового ответа — это стратегия, используемая вирусами для уклонения от иммунитета хозяина. Предыдущие исследования реакции хозяина на инфекцию SARS-CoV (коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 1) и MERS-CoV (коронавирус ближневосточного респираторного синдрома) позволяют предположить, что несколько коронавирусов используют эту стратегию[55-59]. Исследование 2020 года, проведенное Xia et al. определили, что эта дисрегуляция, используемая высокопатогенными коронавирусами, распространяется наSARS-CoV-2продемонстрировав, что все три бета-коронавируса подавляют путь интерферона I типа. В частности, NSP1, NSP6 и NSP13[50] препятствуют трансляции IFN-бета, либо блокируя рибосомы хозяина в случае NSP1[60], либо нацеливая вышестоящие белки, необходимые для индукции IFN-бета в случае NSP13[61]. ДругойSARS-CoV-2вирусные белки также участвуют в подавлении интерферона [62]. ORF3b и ORF9b специфически нацелены на митохондриальный противовирусно-сигнальный белковый комплекс, чтобы ингибировать передачу сигналов IFN I типа [63,64]. Факторы хозяина, влияющиеSARS-CoV-2исходы инфекции включают возраст и пол; кроме того, сопутствующие заболевания также были вовлечены в нарушение регуляции интерферона [65]. Исследование Trouillet-Assent et al., проведенное в 2020 г.COVID-19исходы у пациентов в когорте, включающей лиц, систематически экспрессирующих IFN I типа, и лиц, у которых были значительно более низкие уровни как IFN-альфа, так и бета. Они обнаружили, что пациенты с отсутствием экспрессии интерферона I типа были старше и с большей вероятностью были мужчинами по сравнению с теми, кто экспрессировал интерферон I типа [66]. В аналогичном исследовании у женщин были выявлены значительно более высокие системные уровни IFN-альфа-2 по сравнению с уровнями у мужчин|67]. В нашем недавнем исследовании мы обнаружили, что взрослые самцы хорьков старшего возраста имели отсроченный ответ интерферона I типа по сравнению со взрослыми самками, при этом у самцов отсутствовала индукция основных противовирусных генов, включая OASL, MIX1 и IDG15, что совпало с повышенной вирусной нагрузкой [68]. В нашем настоящем исследовании с использованием модели хомяка все наши животные были самцами, что позволяет предположить, что для полного понимания наблюдаемой нами дисрегуляции интерферона I типа необходимо исследование предубеждений по половому признаку. В настоящее время неизвестно, почему и как факторы хозяина влияют на реакцию интерферона наSARS-CoV-2. Исследование Bastard et al. выявило наличие аутоантител к интерферонам I типа у мужчин с тяжелойCOVID-19[69]. Это предлагает возможное объяснение иммунных механизмов, вовлеченных в сниженный ответ интерферона I типа у части пациентов-людей. Механизм снижения реакции интерферона в нашем настоящем исследовании, где все хомяки были взрослыми самцами, ожидает дальнейшего изучения. Более того, в совокупности иммунный профиль, который мы определили вместе с патологией дыхательных путей, предполагает, что хомяки могут быть идеальной моделью для изучения этих механизмов и тестирования терапевтических средств, таких как интерфероны типа I [48, 49, 70] или интерферон лямбда [Z1, Z2]. Оба из них продемонстрировали эффективность в леченииCOVID-19пациентов [Z3-75], но необходимы дополнительные исследования.

COVID-19это заболевание, в патогенезе которого участвуют как дыхательные, так и недыхательные органы [25,26], однако мало что известно о реакции хозяина за пределами дыхательных путей. В нашем исследовании мы идентифицировали вРНК в нескольких тканях за пределами дыхательных путей, включая медиастинальные лимфатические узлы, сердце, почки, печень, селезенку и толстую кишку. Присутствие вирусной РНК может быть индикатором репликации живого вируса и инфекции ткани, но может также присутствовать без живого вируса. Мы не обнаружили значительного количества живого вируса вне дыхательных путей, что свидетельствует о минимальной инфекции внелегочных органов, если таковая имеется. Однако присутствие вирусной РНК может иметь значение для клинических проявлений заболевания и связанных с ним механизмов. Наличие вирусной РНК может быть результатом наличия вируса в крови, который системно транспортируется, или вирусного антигена, который транспортируется антиген-презентирующими клетками в иммунологически важные ткани, такие как селезенка и медиастинальные лимфатические узлы. Присутствие вирусной РНК может играть роль в иммунных реакциях и связанном с ними патогенезе в этих тканях. Поэтому мы продолжили исследование иммунных реакций хозяина в тканях, положительных на вирусную РНК. Хотя мы обнаружили повышенную регуляцию воспалительных генов и генов интерферона типа II во всех нелегочных тканях, наиболее ярким ответом было увеличение иммуномодулирующих цитокинов в сердце. В сердце наш анализ выявил увеличение содержания цитокинов, включая IL-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-5R, IL{ {12}}, CD14 и CCR3, где транскрипты мРНК некоторых цитокинов были увеличены в 100- раз. Хотя некоторые цитокины здесь могут продуцироваться различными подмножествами Т-клеток, отсутствие TGF-бета предполагает, что присутствие Т-регуляторных клеток менее вероятно. Кроме того, отсутствие IL-13 снижает вероятность ответа TH2. Помимо Т-лимфоцитов, увеличение экспрессии генов IL-10, TNF и IL-6 может быть связано с моноцитами или макрофагами [76]. Это также подтверждается увеличением CD14 [76]. Экспрессия IL-5, IL-5R, IL-4 и CCR3 также свидетельствует о наличии эозинофилов [77]. В настоящее время большое количество клинических исследований выявило поражение сердца приCOVID-19[78-84]. На самом деле, по оценкам, примерно 30 процентов людей, выздоровевших отCOVID-19имеют какой-либо тип сердечной травмы85]. Немецкое исследование 100COVID-19пациентов обнаружили, что воспаление миокарда было обычным явлением даже через несколько месяцев после выздоровления отSARS-CoV-2инфекция[84]. В тестируемой когорте 78 процентов пациентов испытывали симптомы, связанные с сердцем, независимо от степени их тяжести.COVID-19тяжесть[84]. Моноциты входят в число типов клеток, которые, как известно, проникают в сердце при воспалении миокарда, продуцируя IL-10, IL-1бета, IL-6 и TNF [86], а также IL -12 [87,88], все из которых активировались в сердце послеSARS-CoV-2прививки в нашем настоящем исследовании. Кроме того, другая подгруппа сердечных проблем, связанных сCOVID-19приписывают эозинофилам, что приводит к эозинофильному миокардиту [89]. Известно, что другие вирусы вызывают эозинофильный миокардит после инфицирования[90-93]. Эта патология обычно возникает в результате инфицирования вирусом тканей сердца, например, вирусом Коксаки B3 [94]. Эозинофильный миокардит диагностирован уCOVID-19пациентов, после чего при вскрытии в ткани сердца была обнаружена инфильтрация воспалительными клетками, включая лимфоциты, макрофаги и особенно эозинофилы [89]. При этом было обнаружено увеличение эозинофилов и общее воспаление в сердце, несмотря на отсутствие живого вируса в сердце на момент смерти [95]. Мы нашли доказательства в нашем исследовании эозинофильного миокардита в гистопатологии, а также сигнатуру цитокинов, обнаруженную в сердце. В нашем исследовании возможно, что эозинофилы приводят к воспалительно-опосредованной кардиомиопатии за счет усиления регуляции IL-4, которая была увеличена с точки зрения экспрессии генов в сердцах хомяков на 8-й день после инокуляции SARS-CoV-2. Повышение уровня калия и небольшое повышение уровня аланинтрансферазы в плазме инфицированных хомяков также могли способствовать нарушению регуляции сердечной деятельности. Имея это в виду, механизмы, регулирующие повреждение сердца, связанное с COVID-19, до сих пор неизвестны. Учитывая распространенность поражения сердца уCOVID-19пациентов, необходимы дополнительные исследования, чтобы понять механизмы заболевания. Здесь мы представили доказательства того, что хомяки могут быть полезны для понимания определяющих механизмов повреждения сердца во время беременности.SARS-CoV-2инфекция и оценка терапии этой патологии.

Иммунологически наши анализы селезенки и медиастинальных лимфатических узлов предполагают индукцию адаптивного иммунитета. В медиастинальном лимфатическом узле выявлена ​​заметная двухфазная регуляция генов, связанных с Т-клетками, с усилением экспрессии генов CD3, CD4, IL-2, IL-21, I-10, IL{ {6}}, IL-5 и IL-13 на 2-й и 15-й день. Этот профиль предполагает раннюю презентацию антигена в дренирующем лимфатическом узле вскоре после инфекции легких дендритными клетками, которая будет поддерживаться на следующий день. 2 повышение продукции IL-12 в лимфатическом узле [96,97]. Миграция дендритных клеток, ведущая к активации Т-клеток, в конечном итоге завершается IL -2, стимулирующим рост и пролиферацию Т-клеток [98]. Уровни глобулина в крови на 2-й день после заражения у инфицированных хомяков также подтверждают раннюю антигенную стимуляцию. Повышающая регуляция IL-4, IL-5 и IL-13 предполагает асимметричный ответ TH2 [99]. Ранние исследования показали, что бессимптомное или легкоеCOVID-19случаи с иммунным перекосом в сторону системного TH2, характеризующегося увеличением IL-4 и IL-10[100]. IL-10, регуляторный цитокин, также активировался на 2-й день в нашем исследовании. Наши данные свидетельствуют о том, что активированные Т-клетки рекрутируются в ткани с живой вирусной инфекцией, такие как носовые раковины, где мы наблюдали увеличение генов, связанных с Т-клетками, на 5-й день после инокуляции. Вторичная активация генов в лимфатическом узле на 15-й день также свидетельствует об экспансии субпопуляций Т-клеток. В отсутствие инфекционных вирусов в это время это может быть увеличение подгрупп Т-клеток, которые непосредственно способствуют развитию ответа памяти. Поскольку Т-клетки центральной памяти также продуцируют ИЛ-2[101], наши данные, показывающие увеличение ИЛ-2 на 15-й день после инокуляции, могут свидетельствовать о памяти Т-клеток. IL-21 был наиболее активным геном, связанным с Т-клетками, на 15-й день. клетки к созреванию аффинитета и развитию памяти. Маркер B-клеток CD19 также был повышен в лимфатическом узле, при этом пик экспрессии гена приходился на 15-й день.SARS-CoV-2инфекция у макак-резусов, выявляющая сильный Т-клеточный ответ в медиастинальном лимфатическом узле со специфическим увеличением CD4, а также маркеров Т-фолликулярных хелперных клеток CD28 и CXCR5 [103]. Возможно, повышенная экспрессия генов Т-клеток, наблюдаемая в нашем исследовании, также свидетельствует об ответе зародышевого центра. Повышенный системный Т-клеточный ответ также наблюдался у пациентов с SARS-CoV-2, у которых выздоравливает и развивается долговременная память [97,104]. Более глубокий анализ с повышенным уровнем маркеров реакций зародышевого центра для оценки лимфатических узлов был бы полезен для исследований вакцин.

Повышенная активность лимфатических узлов также может свидетельствовать о патогенезе. Лимфатический узел был единственным недыхательным органом, где был обнаружен живой вирус. Живая вирусная инфекция лимфатических узлов, а также селезенки наблюдалась у людей, умерших отSARS-CoV-2[105]. В исследовании, проведенном Канеко и соавт., образцы лимфатических узлов и селезенки человека умершихCOVID-19у пациентов отсутствовали BCL6 плюс В-клетки, а также целые зародышевые центры в целом. Авторы предположили, что это было причиной плохого гуморального ответа наSARS-CoV-2[106]. Поскольку мы определили устойчивый ответ нейтрализующих антител, который был обнаружен на 8-й день после заражения, что совпало со снижением выделения вируса, более вероятно, что живой вирус, обнаруженный в лимфатических узлах нашего исследования, свидетельствует о функциональных ответах В-клеток и реакции зародышевого центра.

Селезенка также показала выраженный иммунный ответ, характеризующийся линейным увеличением экспрессии генов с 8-го по 15-й день. Эта поздняя активация коррелирует с типичным вовлечением селезенки в иммунный ответ на патогены, который возникает после активации в локальных дренирующих узлах [107]. Селезенка, лимфоидный орган, также активирует Т- и В-клетки в ответ на вирусный антиген. а также активность В-клеток, зависящая от зародышевого центра, как мы видели в лимфатическом узле [108]. Кроме того, ответ в селезенке может быть следствием виремии, когда плазмацитоидные дендритные клетки (pDC) участвуют в распознавании вирусного антигена через TLR7 и TLR9 для активации CD8 плюс T-клеток и естественных киллеров T (NKT). Оба этих типа клеток участвуют в элиминации инфицированных вирусом клеток после активации в селезенке IFN-бета и IL-12 [109], которые были увеличены в нашей модели вместе с CD8.IL-12 , IL -10 и CD14 повышались в селезенке инфицированных хомяков, что потенциально указывает на фагоцитарную активность макрофагов [110, 111]. Кроме того, врожденные лимфоидные клетки (ILC) в селезенке поддерживают восстановление тканей в ответ на повреждение и продуцируют IL-5 и IL-13[112]. В совокупности этот более поздний ответ селезенки указывает на функцию рециркуляции селезенки, а также потенциальную активацию лимфоцитов для ответов долговременной памяти.

Толстая кишка показала минимальную регуляцию оцениваемых цитокинов, за заметным исключением I-5, IL-5R и CCR3. Экспрессия всех трех из этих генов значительно увеличилась со 2-го по 15-й дни с пиковым кратным изменением 74 для IL-5 по сравнению с исходным уровнем на 8-й день. IL-5 преимущественно секретируется T типа 2. -хелперные клетки и эозинофилы[113]. Учитывая более низкие уровни экспрессии других генов, связанных с Th2, таких как IL-4 и IL-13, а также увеличение известных эозинофильных маркеров IL-5R и CCR3, вероятно, IL{ {18}} продуцируется в основном эозинофилами, что можно увидеть в нашем гистологическом анализе толстой кишки. Эозинофилы играют непосредственную роль в противовирусной защите, о чем свидетельствуют РНКазы в их гранулах и что они связаны с элиминацией других респираторных вирусов [114, 115]. Большое количество эозинофилов также обнаруживается в желудочно-кишечном тракте [116]. В нашем исследовании толстая кишка инфицированных хомяков не содержала живых вирусов. Однако толстая кишка была положительной дляSARS-CoV-2вирусной РНК на 2-й и 5-й дни после инокуляции, что согласуется с Sia et al., которые также наблюдали вРНК в толстой кишке при отсутствии воспалительной реакции [20]. До 20 процентовCOVID-19пациенты сообщают о желудочно-кишечных симптомах, таких как диарея [39, 117] с выделением вирусов с фекалиями [118]. Это можно объяснить снижением эозинофилов, о котором сообщалось в случаях тяжелойCOVID-19[119-121]. Увеличение экспрессии гена IL-5 эозинофилами может способствовать противовирусному состоянию толстой кишки, тем самым предотвращая инфекцию. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить точный тип клеток, приводящий к такому усиленному ответу IL-5.

В нашем исследовании мы также исследовали биохимический состав кровиSARS-CoV-2инфицированных сирийских хомяков. Мы определили референтный диапазон, используя неинфицированных хомяков из нашего источника животных, а также сравнили показания с опубликованными референтными диапазонами для хомяков, в частности, сирийских хомяков[122]. Некоторые преаналитические факторы, которые могут повлиять на химический состав крови наших животных до заражения, которые необходимо учитывать при анализе, включают уровень стресса, которому животные могут подвергаться, а также изофлюрановый анестетик, используемый при заборе крови, который может изменить химический состав крови. Было показано, что уровни глюкозы, АЛТ, ЩФ и неорганического фосфора были значительно выше у крыс под действием изофлурана и других анестетиков, не указанных здесь[123]. В нашем исследовании хомяков, инфицированных SARS-CoV-2, наиболее заметные изменения после инфекции включали концентрацию калия, которая со временем увеличивалась. Калий, который является основанием, действует как буфер для обмена на водород (H') (кислота), когда пациент находится в кислом состоянии. Поскольку ацидоз крови может быть вызван изменениями дыхательной функции, неудивительно, что хомячки, у которых были признаки пневмонии/респираторного дистресса (предполагая, что повышенное содержание углекислого газа (CO2) удерживалось (или выделялось в меньшей степени) и меньшее количество кислорода ( O2), принимаемый из-за снижения альвеолярной функции, переходит в кислое состояние, что приводит к увеличению содержания калия в крови. Что касается более низких уровней альбумина по сравнению с нашим референтным диапазоном, можно было ожидать, что альбумин будет увеличиваться в ответ на экспрессию воспалительных цитокинов. Возможно, что более низкие уровни альбумина были связаны с использованием изофлурана, что было показано ранее [122-124]. Что касается уровня глюкозы с течением времени, то у большинства инфицированных животных концентрация глюкозы повышалась, что свидетельствует о вызванном кортизолом стрессе, возбуждении, вызванном адреналином, или о нарушении регуляции выработки инсулина или взаимодействия секреции с рецептором. Таким образом, наиболее интересным результатом этого анализа было предположение о снижении уровня кислорода, связанного с повышением уровня калия. Эти результаты позволяют предположить, что мониторинг калия можно использовать для выявления пневмонии в течение жизни.COVID-19исследования на животных. В дальнейшем эту работу можно также использовать для построения эталонных значений для модели инфекции SARS-CoV-2 сирийского хомяка и для скрининга терапевтических средств в жизни.

Наше исследование предлагает важную информацию оSARS-CoV-2инфекция иCOVID-19регуляция болезни. Доклинические модели являются краеугольным камнем биомедицинских исследований, предлагая возможность экспериментально изолировать механизмы заболевания, а также оценить потенциальные медицинские контрмеры, включая иммуномодулирующие препараты, противовирусные препараты и вакцины. В качествеSARS-CoV-2впервые появились, у нас было ограниченное понимание механизмов патогенеза, не было идентифицированных терапевтических или профилактических средств, а также не было доклинической модели, которую можно было бы использовать для открытия медицинских контрмер. Со времени появления вируса были сделаны огромные скачки, особенно в разработке доклинических моделей, но наше пониманиеCOVID-19и его многочисленные проявления еще ограничены. Наше исследование подтвердило вирусный тропизм и респираторную патологию, выявленную ранее в нашем исследовании.SARS-COV-2на хомяках, но также смог расширить наше понимание иммунной регуляции и патогенеза в дыхательных путях и за их пределами.

использованная литература

1. Чжуан Пинхуэй JW. Уханьская пневмония: как разворачивались поиски источника загадочной болезни South China Morning Post 2020. Доступно по ссылке: https://www.scmp.com/news/china/society/article/3046233/Wuhan-pneumonia-how-search -источник-загадка-болезни-раскрыта.

2. Кучинотта Д., Ванелли М. ВОЗ заявляетCOVID-19пандемия. Акта Биомед. 2020; 91(1):157–60. Эпаб 20.03.2020. https://doi.org/10.23750/abm.v91i1.9397 PMID: 32191675.

3. Петросильо Н., Вицеконте Г., Эргонул О., Ипполито Г., Петерсен Э.COVID-19, SARS и MERS: они тесно связаны? Клин Микробиол Инфект. 2020; 26(6):729–34. Эпб 2020/04/03. https://doi.org/10.1016/j. cmi.2020.03.026 PMID: 32234451; Центральный PMCID в PubMed: PMC7176926.

4. Медицина JHU. Ресурсный центр по коронавирусу 2021 г. Доступно по адресу: https://coronavirus.jhu.edu/.

5. Маршалл М. Непрекращающиеся страдания дальнобойщиков коронавируса. Природа. 2020; 585 (7825): 339–41. Эпб 2020/09/16. https://doi.org/10.1038/d41586-020-02598-6 PMID: 32929257.

6. Гупта А., Мадхаван М.В., Сегал К., Наир Н., Махаджан С., Сехрават Т.С. и др. Внелегочные проявленияCOVID-19. Нат Мед. 2020; 26(7):1017–32. Эпаб 12.07.2020. https://doi.org/10.1038/s41591- 020-0968-3 PMID: 32651579.

7. Николич-Зугич Дж., Нокс К.С., Риос К.Т., Натт Б., Бхаттачарья Д., Фейн М.Дж.SARS-CoV-2а такжеCOVID-19у пожилых людей: что мы можем ожидать в отношении патогенеза, иммунных реакций и исходов. Геронаука. 2020; 42(2):505–14. Эпублик 2020/04/11. https://doi.org/10.1007/s11357-020-00186-0 PMID: 32274617; Центральный PMCID в PubMed: PMC7145538.

8. ВОЗ. Информация для педиатрических поставщиков медицинских услуг, 2021 г. Доступно по адресу: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/pediatric-hcp.html.

9. Fu Y, Cheng Y, Wu Y. ПониманиеSARS-CoV-2- Опосредованные воспалительные реакции: от механизмов до потенциальных терапевтических инструментов. Вирол Син. 2020; 35(3):266–71. Эпублик 2020/03/04. https://doi.org/10.1007/s12250-020-00207-4 PMID: 32125642; Центральный PMCID в PubMed: PMC7090474.

Примечание:приведенное выше не является полным справочным списком