Куванон Т и санггенон А, выделенные из Morus Alba, оказывают противовоспалительное действие, регулируя сигнальные пути NF-κB и HO-1/Nrf2 в клетках BV2 и RAW264.7.

Для получения дополнительной информации. контактtina.xiang@wecistanche.com

Абстрактный: Ранее мы исследовали метанольный экстракт коры Morus alba и охарактеризовали 11 соединений из экстракта: куванон G (1), кувана E (2), кувана T (3), санггенон A (4), санггенон M (5), санггенол. A(6), мульберофуран B(7), мульберофуран G(8), морацин M(9), морацин O(10) и норартокарпанон (11). Здесь мы исследовалипротивовоспалительное средствовоздействие этих соединений на клетки микроглии (BV2) и макрофаги (RAW264.7). Среди них 3 и 4 заметно ингибировали индуцированную липополисахаридом (ЛПС) продукцию оксида азота в этих клетках, что свидетельствует о противовоспалительных свойствах этих двух соединений. Эти соединения ингибировали выработку простагландина Е2, интерлейкина -6 и фактора некроза опухоли-с, а также экспрессию индуцируемых синтазы оксида азота и циклооксигеназы-2 после стимуляции ЛПС. Предварительная обработка 3 и 4 ингибировала активацию сигнального пути ядерного фактора каппа В в клетках обоих типов. Соединения также индуцировали экспрессию гемоксигеназы (HO)-1 за счет активации ядерного фактора, 2-связанного с эритроидным фактором 2. Подавление активности HO-1 обращало вспять противовоспалительные эффекты, вызванные путем предварительной обработки 3 и 4, что позволяет предположить, что противовоспалительные эффекты регулируются HO-1. В совокупности 3 и 4 являются потенциальными кандидатами для разработки терапевтических и профилактических средств длявоспалительные заболевания.

Ключевые слова: Морус белый; куванон Т; санггенон А; БВ2; клетки RAW264.7; противовоспалительные эффекты

Нажмите здесь, чтобы узнать больше продуктов

1. Введение

Morus alba, лекарственное растение, принадлежащее к семейству Moraceae, использовалось для лечения воспалительных заболеваний легких в традиционной медицине [1]. Кора его корня содержит различные активные компоненты, такие как умбеллиферон, скополетин, муцины, дубильные вещества,флавоноиды(морузин, малберрин, малберрихромен, цикломульберрин, морацин P, морацин O, малберрофуран Q, кувана E и куванон H) [2], 2-арилбензофураны (морацин D, морацин P, морацин O и малберрофуран O), и пренилированные флавоноиды (ликофлавон С, цикломулберрин, неоцикломорузин, санггенон I, морузин и кувана U) [3,4]. Экстракты M. alba и активные соединения могут облегчать заболевания легких, как показали недавние исследования [5-7]. Помимо фармакологического действия M.alba на легкие, изопренилированные флавоноиды (санггенол Q, кувана Т, санггенон Н, мульберрофуран G и мульберрофуран С) оказывают гепатопротекторное действие на t-BHP-индуцированные клетки HepG2 [8]. Пренилфлавоноиды (куванон А, кувана С, кувана Т и морузин) и тритерпеноиды (бетулиновая кислота, ацил и -ситостерол) существенно ингибируют дифференцировку адипоцитов 3T3-L1 [9]. Морингидрат, основной флавоноидный компонент M. alba, облегчает хроническое непредсказуемое ухудшение памяти, вызванное стрессом, что указывает на то, что это соединение может усиливать систему антиоксидантной защиты и ингибировать нейровоспалительные пути [10]. Эти исследования показывают, что компоненты, содержащиеся в M.alba, являются потенциальными кандидатами для лечения различных заболеваний.

Воспаление, сложная реакция самозащиты на повреждающие стимулы, играет важную роль в иммунной защите посредством активации нескольких иммунных клеток, включая макрофаги, моноциты, лейкоциты, тучные клетки и другие типы клеток [11]. Макрофаги являются наиболее многочисленными и широко распространенными иммунными клетками в организме, а микроглия является резидентными макрофагами в центральной нервной системе (ЦНС) [12]. Макрофаги и клетки микроглии играют ключевую роль в воспалительной реакции. Они могут активироваться в ответ на такие стимулы, как липополисахарид (ЛПС), цитокины и хемокины, и вызывать воспалительные состояния [13]. В условиях воспаления чрезмерно активированные макрофаги и клетки микроглии вызывают аномальную регуляцию провоспалительных медиаторов (оксида азота (NO), простагландина E2 (PGE), индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) и циклооксигеназы (ЦОГ)-2). ) и провоспалительные цитокины (интерлейкин (IL) -6 и фактор некроза опухоли (TNF)-a) посредством активации сигнального пути ядерного фактора каппа B (NF-B) [14,15]. Повышенные уровни провоспалительных медиаторов еще больше усугубляют прогрессирование воспалительных заболеваний, что еще больше увеличивает активацию воспалительных факторов, что приводит к порочному кругу [16]. Следовательно, регулирование медиаторов воспаления необходимо для лечения и профилактики воспалительных заболеваний.

Гемоксигеназа (HO)-1 представляет собой ограничивающий скорость фермент, катализирующий расщепление гема на биливердин, ион двухвалентного железа (Fe2 plus ) и монооксид углерода (CO)[17]. Индукция HO-1 регулируется активацией ядерного фактора эритроидного 2-родственного фактора 2 (Nrf2). HO-1 может индуцироваться в ответ на окислительный стресс и воспаление для защиты тканей и поддержания гомеостаза в организме [18]. Таким образом, воздействие на индукцию HO-1 является одной из потенциальных стратегий лечения воспалительных заболеваний.

В нашем постоянном стремлении исследовать кандидаты из натуральных продуктов для лечения воспалительных заболеваний, мы представляем здесьпротивовоспалительные эффектысоединений 11l, выделенных из M.alba, в клетках BV2 и RAW264.7, индуцированных ЛПС.

2. Результаты

2.1.Влияние 11 соединений, выделенных из M.alba, на жизнеспособность клеток BV2 и RAW264.7

В предыдущем исследовании кору корня M. alba экстрагировали водным метанолом, а полученные экстракты последовательно разделяли на EtOAc, н-BuOH и H2O2. Повторная колоночная хроматография с SiO2, ODS и Sephadex LH-20 фракции EtOAc дала 11 соединений, таких как куванон G(1), Kuwana E(2), Kuwana T (3), санггенон A(4), санггенон M (5), санггенол A (6), мульберофуран B (7), мульберофуран G (8), морацин M (9), морацин O (10) и норартокарпанон (11) [6, 19, 20]. Химическая структура 11 соединений, выделенных из M. alba, показана на рисунке 1. Для определения цитотоксического действия этих соединений использовали 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил){{ 26}}. Проведен анализ 5-дифенилтетразолия бромида (МТТ), клетки BV2 и RAW264.7 обрабатывали указанными концентрациями соединений в течение 48 ч в концентрациях до 80 мкМ. (Фигура 2). Соединения 2, 3 и 4 проявляли токсическое действие при 80 мкМ, соединение 5 — при 40 мкМ. На основании результатов оценки токсичности был выбран нетоксичный диапазон концентраций для последующих исследований противовоспалительного действия (соединения 2, 3, 4 при 40 мкМ, соединение 5 при 200 мкМ и другие соединения при 80 мкМ). .

2.2. Влияние соединений l1, выделенных из M. alba, на экспрессию воспалительных факторов и белка iNOS в клетках BV2 и RAW264.7

NO является свободным радикалом в сердечно-сосудистой, нервной ииммунная система. Он поддерживает внутриклеточный гомеостаз, транспортирует нейротрансмиттеры, регулирует противовоспалительную активность и цитотоксичность. Однако, когда вырабатывается большое количество NO, он оказывает вредное воздействие на организм, включая вазодилатацию, цитотоксичность и повреждение тканей [21,22]. Затем мы исследовали влияние этих соединений на продукцию нитритов в клетках BV2 и RAW264.7, индуцированных ЛПС. Клетки обрабатывали различными концентрациями соединений в течение 2 часов перед стимуляцией ЛПС (1 мкг/мл) в течение 24 часов. Среди соединений только соединение 3 (куванон Т) и соединение 4 (сангенон А) значительно ингибировали выработку нитрита как в клеточных линиях BV2, так и в клеточных линиях RAW264.7 (фиг. 3). Кроме того, мы провели дополнительный эксперимент для сравнения ингибирующего эффекта образования нитритов между группой, обработанной ЛПС, после предварительной обработки соединением и группой, обработанной соединением, после предварительной обработки ЛПС. В результате не было никакой разницы в ингибирующем эффекте производства нитрита между двумя экспериментальными группами (дополнительная фигура S1). Поэтому в этом исследовании были проведены следующие эксперименты с использованием предварительной обработки соединениями в течение 2-3 часов перед обработкой ЛПС.

Производство NO увеличивается с помощью провоспалительных белков, индуцируемых синтазой оксида азота (iNOS). Однако сверхэкспрессия iNOS серьезно ухудшает патофизиологию заболевания [23]. Соединения 3 и 4 ингибировали экспрессию iNOS в зависимости от концентрации (рис. 4). Мы исследовали влияние соединений 3 и 4 на индуцированную ЛПС экспрессию воспалительных факторов в клетках BV2 и RAW264.7. Клетки обрабатывали различными концентрациями соединений 3 и 4 в течение 2 ч, после чего стимулировали ЛПС (1 мкг/мл) в течение 24 ч. Оба соединения значительно ингибировали LPS-индуцированную экспрессию PGE2, TNF и IL -6 в клетках BV2 и RAW264.7 (рис. 5). Результаты показали, что предварительная обработка соединениями 3 и 4 подавляла индуцированное ЛПС воспаление в клетках BV2 и RAW264.7.

2.3. Эффекты соединений 3 и 4 на транслокацию NF-xB в клетках BV2 и RAW264.7

NF-kB является фактором транскрипции, регулирующим экспрессию iNOS [24]. В норме NF-kB остается в неактивной форме, образуя комплексы с регуляторными белками, такими как IKB. Однако, когда он активируется LPS, IkBa расщепляется путем фосфорилирования, а NF-kB (такой как p65) перемещается в ядро ​​[25], что способствует продвижению гена медиатора воспаления и индуцирует экспрессию воспалительных факторов [26]. Для дальнейшего изучения ингибирующего действия соединений 3 и 4 на продукцию провоспалительных факторов в клетках BV2 и RAW264.7, активированных липополисахаридами, мы исследовали ядерную транслокацию экспрессии p65 в клетках, обработанных соединениями 3 и 4, липополисахаридом или оба используют анти-p65 FITC-меченое антитело. DAPI использовали для окрашивания ядер. В контрольной группе экспрессия р65 была обнаружена в цитозоле. Однако в клетках, индуцированных ЛПС, в ядре было обнаружено накопление р65, как показано на объединенных изображениях окрашивания DAPI и р65. Кроме того, по сравнению с клетками, индуцированными ЛПС, соединения 3 и 4 заметно снижали опосредованное ЛПС повышение активности связывания ДНК с NF-KB (p65) (рис. 6А, В) и ядерной транслокации (рис. 6С-F). Эти данные показывают, что соединения 3 и 4 являются негативными регуляторами LPS-стимулированной ядерной транслокации NF-kB.

2.4.Влияние соединений 3 и 4 на путь Nrf2/HO-1 в BV2 и RAW264.7

Клетки Гемоксигеназа-1(HO-1) является мишенью ядерного фактора E2-родственного фактора 2 (Nrf2), путь Nrf2/HO-1 является мощной антиоксидантной сигнальной системой для продвижения свободного железа в окиси углерода (CO), биливердине и геме [27]. Оксид углерода, газообразный метаболит катаболизма гема, проявляет регуляторные эффекты вазодилатации и провоспалительных реакций [28]. Кроме того, известно, что HO-1 играет важную роль в защите клеток от воспаления и окислительного стресса, а также в регулировании продукции нитритов в активированных макрофагах [29]. Мы провели Вестерн-блоттинг, чтобы выяснить, повышают ли соединения 3 и 4 уровень экспрессии HO-1, при этом хорошо известный индуктор HO-1 кобальтовый протопорфирин (CoPP) использовали в качестве положительного контроля, увеличивающего HO{{ 16}} экспрессия белка. [30]. Результаты показали, что соединения 3 и 4 также повышали экспрессию HO-1 (рис. 7). Далее мы исследовали, регулируют ли соединения 3 и 4 активацию Nrf2. Транслокация Nrf2 в ядро ​​увеличивалась в зависимости от времени, что указывает на то, что соединения 3 и 4 значительно активировали путь Nrf2/HO-1 в клетках BV2 и RAW264.7 (рис. 8).

Чтобы дополнительно изучить, коррелируют ли противовоспалительные и противовоспалительные эффекты соединений 3 и 4 с экспрессией HO-1 в клетках BV2 и RAW264.7, мы провели серию экспериментов с протопорфирином олова-IX (SNPP). который является селективным ингибитором активности HO-1. Используя SNPP, который может подавлять экспрессию HO-1, мы попытались определить, опосредует ли HO-1 ингибирующий эффект вышеуказанных соединений на воспалительную реакцию, индуцированную LPS [31]. После обработки клеток 20 мкМ соединений 3 и 4 в течение 2 ч с 50 мкМ SNPP или без них их обрабатывали ЛПС в течение 24 ч. Хотя соединения 3 и 4 уменьшали выработку нитритов в клетках BV2 и RAW264.7, индуцированных липополисахаридами, их противовоспалительные эффекты были обращены вспять при лечении SNPP (рис. 9). Сам по себе SNPP не влиял на выработку оксида азота (NO) после стимуляции LPS, что позволяет предположить, что противовоспалительные эффекты соединений 3 и 4 регулируются экспрессией HO-1.

3. Обсуждение

Настоящее исследование показало, что Kuwana T и санггенон A подавляют воспаление, вызванное LPS, в клетках BV2 и RAW264.7. Эти соединения ингибировали индуцированную ЛПС продукцию NO, PGE2 и провоспалительных цитокинов, включая IL-6 и TNF-, а также экспрессию iNOS и COX-2 как в клетках BV2, так и в клетках RAW264.7. Эти результаты показали, что Kuwana T и санггенон A проявляют противовоспалительное действие, инактивируя сигнальный путь NF-kB. Кроме того, эти соединения индуцировали экспрессию HO-1 посредством активации Nrf2. Кроме того, эти соединения индуцировали экспрессию HO-1 посредством активации Nrf2, и было также подтверждено, что этот эффект связан с противовоспалительная активность.

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.) и тромбоксан A2(TXA)[361. При воспалительных состояниях уровни iNOS и ЦОГ-2 увеличиваются, что приводит к перепроизводству NO и PGE2 соответственно и ведет к обострению воспалительных заболеваний [37]. В настоящем исследовании мы сначала оценили 11 соединений, выделенных из M. alba, чтобы определить, ингибируется ли продукция NO в стимулированных LPS клетках BV2 и RAW264.7. Наши результаты показали, что куванон Т и санггенон А оказывали самое сильное ингибирующее действие как на клетки BV2, так и на клетки RAW264.7 (рис. 3). В нашем предыдущем исследовании морацин М оказывал противовоспалительное действие на альвеолярные макрофаги, но наши результаты показали другое. шаблон. Однако, поскольку каждая клетка имеет разные характеристики, даже при одном и том же механизме может проявляться разная активность J38]. Следовательно, как и в результатах этой статьи, было подтверждено, что морацин М не обладал противовоспалительной активностью в клетках BV2 и RAW264.7 вплоть до лечебной концентрации. Поэтому для дальнейших экспериментов были выбраны куванон Т и санггенон А.

Цитокины оказывают комплексное регулирующее влияние на воспалительные и иммунные реакции [39]. Активация макрофагов и клеток микроглии усиливает секрецию провоспалительных цитокинов J40, и эта повышенная секреция приводит к дальнейшему высвобождению цитокинов [41]. IL-6 является одним из основных цитокинов и растворимым медиатором, ответственным за воспаление, иммунный ответ и гемопоэз [42]. Передача сигналов IL-6 регулируется двумя различными механизмами, включая связывание с мембраносвязанным рецептором IL-6 (mblL6R) и распознавание растворимого рецептора IL-6 (sIL6R) [43]. Оба механизма связаны с активацией гликопротеина (GP)130, что приводит к активации нижестоящих сигнальных молекул, включая Янус-киназу (IAK)/преобразователь сигнала и активатор транскрипции (STAT)киназы, фосфоинозитид 3-киназу (PI3K ) и митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK) [44]. IL-6 используется для прогнозирования и оценки уровней воспаления у пациентов с раком, инфекциями, аутоиммунными заболеваниями, заболеваниями поджелудочной железы и сердечно-сосудистыми заболеваниями.

TNF-, другой основной цитокин, также играет важную роль во многих иммунных и воспалительных процессах, таких как пролиферация иммунных клеток, апоптоз, некроз и выживание. Биологические эффекты TNF-регулируются путем связывания с двумя различными рецепторами, рецептором фактора некроза опухоли (TNFR)1 и TNFR2. TNFR1 является основным медиатором активности TNF- в большинстве клеток, поскольку TNFR2 имеет меньшую аффинность связывания с TNF-, в результате чего TNF- легче диссоциирует от TNFR2, чем от TNFR1. Нарушения в передаче сигналов TNF- и перепроизводство TNF- приводят к развитию многих заболеваний, включая ревматоидный артрит, псориаз, болезнь Крона, атеросклероз, сепсис, диабет и ожирение [45,46. Поэтому важно ингибировать продукцию провоспалительных цитокинов для подавления и предотвращения воспалительных реакций и развития воспалительных заболеваний. В настоящем исследовании куванон Т и санггенон А ингибировали индуцированную ЛПС продукцию ИЛ -6 и ФНО- как в клетках BV2, так и в клетках RAW264.7.

NF-kB является наиболее распространенным транскрипционным фактором [47], а передача сигналов NF-kB играет важную роль в экспрессии генов, связанных с воспалительными реакциями, включая те, которые кодируют iNOS, ЦОГ -2 и провоспалительные цитокины [47]. 48]. В инактивированном состоянии субъединицы NF-kB существуют в цитоплазме, связанные со своим белком-ингибитором, ингибитором каппа B (kB)-. Некоторые стимулы, в том числе LPS и цитокины, вызывают фосфорилирование и деградацию IkB-, обеспечивая высвобождение и транслокацию субъединиц NF-kB в ядро. Транслоцированные субъединицы связываются с сайтами kB генов-мишеней в ДНК, что приводит к индукции транскрипции генов, кодирующих провоспалительные медиаторы [49]. Следовательно, инактивация пути NF-kB может быть терапевтической мишенью при воспалительных заболеваниях. В настоящем исследовании предварительная обработка куваноном Т и санггеноном А ингибировала индуцированную ЛПС активацию передачи сигналов NF-kB путем ингибирования ДНК-связывающей активности и ядерной транслокации субъединиц NF-kB (рис. 6). Эти результаты свидетельствуют о том, что противовоспалительные эффекты куванона Т и санггенона А проявляются посредством регуляции сигнального пути NF-kB.

В нормальных условиях Nrf2 связывается с Kelch-подобным ECH-ассоциированным белком 1 (Keap1) в цитоплазме. Однако он диссоциирует от Keapl, перемещается в ядро ​​и связывается с сайтами элементов антиоксидантного ответа (ARE) на ДНК, что приводит к экспрессии различных генов антиоксидантов, включая те, которые кодируют HO-1, NAD(P)H : хиноноксидоредуктаза 1 (NQO1), пероксиредоксин (Prx) и тиоредоксин (Trx) [50]. В частности, известно, что HO-1 связана с противовоспалительным действием, а ее активность представлена ​​уровнями CO, одного из трех побочных продуктов, образующихся из гема ферментативной активностью HO{{12 }} [51]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что куванон Т и санггенон А индуцируют экспрессию HO-1 путем активации Nrf2 (рис. 7 и 8). Кроме того, мы проверили корреляцию между противовоспалительным действием куванона Т и санггенона А и экспрессией HO-1 с использованием SNPP, селективного ингибитора активности HO-1. Ингибирующее действие куванона Т и санггенона А на продукцию NO и TNF и активацию NF-kB частично устранялось совместным лечением с SNPP (рис. 9). Эти результаты позволяют предположить, что противовоспалительные эффекты куванона Т и санггенона А регулируются экспрессией HO-1.

4. Материалы и методы

4.1. Материалы

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) и эмбриональную бычью сыворотку приобретали у Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA). Все химикаты были получены от Sigma-Aldrich Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США). Первичные антитела против iNOS, против - -актина, против p65 и против HO-1 были приобретены у Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния, США); и антикроличьи и антимышиные вторичные антитела от Millipore

(Биллерика, Массачусетс, США). Наборы для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) для PGE, IL -6 и TNF- были приобретены у R&DSystems Inc. (Миннеаполис, Миннесота, США). Выделение и структурное определение 11 соединений из Morus alba описано в другом месте [19-21].

4.2. Культура клеток и анализ жизнеспособности

Клетки BV2 и RAW264.7 высевали при плотности 5×105 клеток/мл в среду RPMI 1640 с добавлением 1% антибиотика (пенициллин-стрептомицин) и 10% инактивированной нагреванием FBS. Клетки культивировали при 37 градусах во влажном 5-процентном CO, с 95-процентной воздушной атмосферой, в соответствии с ранее описанным методом [52].

4.3. Измерение производства NO

Производство нитрита, стабильного конечного продукта окисления NO, измеряли как показатель продукции NO в клетках. Вкратце, концентрацию нитрита в кондиционированных средах определяли методом, основанным на реакции Грисса [53]. Детали анализа были описаны ранее [54].

4.4. PGE2 Ass4y/

Концентрацию PGEz в каждом образце измеряли с помощью имеющегося в продаже набора ELISA по ранее описанному методу [55].

4.5. Измерение уровней IL-6 и TNF-a

Культуральную среду собирали для определения уровней IL-6 и TNF- с использованием имеющегося в продаже набора (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США). Анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки BV2 и RAW264.7 высевали в культуральные планшеты с 24-лунками при плотности 20×10 клеток/лунку. После инкубации супернатант собирали и использовали для измерения концентраций IL-6 и TNF- с помощью наборов ELISA.

4.6. Вестерн-блот-анализ

Осажденные клетки BV2 и RAW264.7 промывали PBS и лизировали в буфере RIPA. Равные количества белков количественно определяли с использованием концентрата реагента красителя для анализа белка, полученного от Bio-Rad Laboratories (№ 5000006; Геркулес, Калифорния, США), смешивали с буфером для загрузки образца и разделяли с помощью SDS-PAGE. Затем разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Неспецифическое связывание с мембраной блокировали инкубацией в растворе обезжиренного молока. Мембрану инкубировали с первичными антителами (все они использовались в соотношении 1:1000) при 4 градусах в течение ночи, а затем реагировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (все они использовались в соотношении 1:5000) (Millipore). 31].

4.7. Локализация NF-xB и иммунофлуоресцентный анализ

Для изучения локализации NF-kB клетки BV2 и RAW264.7 культивировали на предметных стеклах камеры Lab-Tek II и обрабатывали различными концентрациями соединений в течение 2 часов перед стимуляцией ЛПС ({6}},5 мкг/мл) в течение 1 часа. час Затем клетки фиксировали в формалине, пермеабилизировали холодным ацетоном и зондировали антителами против p65 (1:200) с последующей инкубацией со вторичным антителом, меченным изотиоцианатом флуоресцеина (1:1000) (Alexa Fluor 488, Invitrogen). Для визуализации ядер клетки обрабатывали 1 мкг/мл 4'6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 30 мин, промывали PBS в течение 5 мин и обрабатывали 50 мкл VectaShield (Vector Laboratories, Берлингейм, Калифорния, США). Окрашенные клетки визуализировали, и изображения получали с использованием флуоресцентного микроскопа Zeiss (Provis AX70; Olympus Optical Co., Токио, Япония). [31].

4.8. Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественных сравнений Тьюки использовался для сравнения различий между тремя группами. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 5.01, GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США).

5. Выводы

Куванон Т и санггенон А оказывали противовоспалительное действие на клетки BV2 и RAW264.7, индуцированные липополисахаридами, путем ингибирования продукции NO, PGE2, IL-6 и TNF-, а также экспрессии iNOS и ЦОГ{{8}. }. Наши результаты показали, что эти ингибирующие эффекты были опосредованы инактивацией пути NF-KB при обработке куваноном Т и санггеноном А. Кроме того, эти соединения индуцировали экспрессию HO-1, активируя транслокацию Nrf2 в ядро. . Наши результаты показали, что экспрессия HO-1, индуцированная куваноном Т и санггеноном А, была связана с подавлением воспаления, вызванного ЛПС. В совокупности наши результаты свидетельствуют о том, что Kuwana T и санггенон A, выделенные из M. Albu, могут быть кандидатами для разработки терапевтических и профилактических средств для нейровоспалительных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.