Часть 3: Влияние изорамнетина на диабет и связанные с ним осложнения: обзор исследований in vitro и in vivo и постфактум транскриптомный анализ вовлеченного молекулярного пути

Для получения дополнительной информации. контактtina.xiang@wecistanche.com

5. Апостериорный анализ транскриптома предсказывает потенциальное влияние изорамнетина на диабет в инструменте на основе стволовых клеток.

Мы создали инструмент на основе стволовых клеток, используя перинатальныйстволовая клетка, человеческие амниотические эпителиальные клетки (hAECs), для оценки биологической активности природных соединений с использованием полногеномного микрочипового анализа [71, 140-144]. В последние годы все большее количество биоактивных соединений в лекарственных растениях подвергается скринингу на предмет их потенциального терапевтического и профилактического действия. В этом контексте подходы на основе стволовых клеток с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека (чПСК) привлекают большое внимание как физиологически более подходящие человеческие модели in vitro для скрининга лекарств и проверки тысяч соединений как в академических исследованиях, так и в фармацевтической промышленности[{{4} }]. Однако hPSC, включая эмбриональные стволовые клетки (hESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC), имеют ограниченные клеточные ресурсы, требуют инвазивных процедур экстракции, дорогостоящего перепрограммирования клеток и важных процедур обслуживания, а также создают этические ограничения и, следовательно, менее благоприятны в качестве практического источника для скрининга наркотиков. С другой стороны, hAEC получают из выброшенной доношенной плаценты, медицинских отходов. Они не требуют инвазивных процедур сбора урожая и имеют минимальные этические проблемы. Кроме того, hAECs происходят из плюрипотентных эпибластов и, таким образом, поддерживают ESC-подобный потенциал многолинейной дифференцировки и могут дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков [148-151].

Стоит отметить, что при соответствующем протоколе дифференцировки hAEC могут быть дифференцированы в гепатоцитоподобные клетки [152-155], холангиоциты [156] и, что наиболее важно, в панкреатоподобные инсулин-продуцирующие клетки [157-160 ]. Трансплантация hAEC-индуцированных клеток поджелудочной железы мышам с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, может нормализовать уровень глюкозы в крови [161]. hAECs [162], а также экзосомы, полученные из hAECs [163], могут ускорять заживление диабетических ран за счет стимулирования ангиогенеза и функции фибробластов и уменьшения воспаления. Включение hAECs в островковые органоиды [164] и экранирование нативных островков слоем hAECs [165] может усилить приживление островков и реваскуляризацию в моделях мышей с диабетом. Кроме того, сообщалось, что полученные из hAEC гепатоцитоподобные клетки, а также сам hAEC обладают терапевтической эффективностью при заболеваниях печени, включая фиброз печени [166, 167], цирроз печени [168] и печеночную недостаточность [169].

Учитывая сложную патофизиологию СД, hAEC не может быть идеальной моделью in vitro для изучения антидиабетических эффектов соединений. Однако из-за его свойств, подобных стволовым клеткам, его можно использовать для первоначального скрининга целевых соединений. Ранее мы исследовали антифиброзный [71] и индуцирующий печеночную дифференцировку [170] потенциал изорамнетина в hAECs. В настоящем исследовании мы провели целевой вторичный анализ наших ранее опубликованных данных [71], чтобы изучить потенциальную функциональность изорамнетина вдиабет(Figure 4). Data analysis was conducted for three biological replicates of day 10 control (n = 3) and isorhamnetin-treated (n =3) hAECs. The cells were grown in 3D cell culture. Control cells were maintained in placental basal epithelial cell medium(Promo Cell, Cat.#C-26140)in absence of any differentiation medium or growth factors, whereas treatment cells were supplemented with 20 mM of isorhamnetin (Sigma-Aldrich, Japan) for 10 days. Differentially expressed genes (DEGs) are referred to as genes with a linear fold change>2 и p-значение<0.05(one-way between-subjects="" anova).="" a="" total="" of="" 303="" degs="" were="" identified;="" among="" them,="" 60="" were="" upregulated="" and="" 243="" were="" downregulated.="" details="" of="" methodology="" have="" been="" explained="" elsewhere="" [71,170].="" all="" microarray="" data="" are="" available="" at="" gene="" expression="" omnibus(geo)="" under="" accession="" number:="" gse153149="" (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc="GSE153149,accessed" on="" 24="" november="">

Нажмите здесь, чтобы узнать больше продуктов

5.1. Наборы сигнатурных генов клеточного типа

В наших предыдущих исследованиях hAEC мы обнаружили, что различные типы соединений могут направлять дифференцировку hAEC в разные клеточные линии, такие как эфир кофейной кислоты, розмариновая кислота [142] и производное кофеилхиновой кислоты3,4,5- Три-O-кофеоилхиновая кислота (TCQA) [140], которая может усиливать дифференцировку нервных клеток, тогда как антоцианин, цианидин-3-O-глюкозид (Cy3G), индуцирует дифференцировку адипоцитов [143] в hAECs. Мы заметили, что биоактивность или функциональность природных соединений обычно можно предсказать по обогащенным типам клеток с помощью DEG.

Мы исследовали значительно расширенные наборы данных о сигнатурах типов клеток, используя базу данных молекулярных сигнатур (MSigDB) ver. 7.4 онлайн-программного обеспечения GSEA (https://software.wideinstitute.org/gsea/index.jsp; по состоянию на 26 ноября 2021 г.)[171]. Эти наборы генов содержат сигнатурные гены кластерных маркеров для типов клеток, идентифицированных в исследованиях секвенирования одиночных клеток тканей человека, и облегчают присвоение типов клеток в наборах данных, таких как эксперименты по разработке моделей органоидов.

Мы обнаружили, что наиболее значительно обогащенный набор генов клеточного типа был мезенхимальными стромальными клетками поджелудочной железы [172] (рис. 4А). Кроме того, было значительно обогащено количество типов протоковых и эндотелиальных клеток поджелудочной железы [172]. Сигнатурные гены поджелудочной железы в hAEC, обработанных изорамнетином, участвуют в эпителиально-мезенхимальном переходе, передаче сигналов TGF, передаче сигналов TNF через NF-kB, передаче сигналов KRAS и метаболизме жирных кислот. Также были значительно обогащены несколько наборов печеночных сигнатурных генов, таких как HSCs, клетки Купфера, клетки желчных протоков [173] и мезотелиальные клетки печени плода [174]. Было также несколько значительно обогащенных сигнатурных наборов генов скелетных мышц, включая фибриллин 1 плюс фибро-адипогенные клетки-предшественники (FBN1 плюс FAP), клетки фибро-адипогенных предшественников (FAP) и перициты скелетных мышц [175]. Биологические функции сигнатурных генов печени в hAEC, обработанных изорамнетином, включают несколько путей воспалительной реакции, тогда как сигнатурные гены скелетных мышц регулируют заживление ран, организацию коллагеновых фибрилл и каскад MAPK. Значимость измерялась как частота ложных открытий, аналог гипергеометрического значения p после поправки Бенджамини и Хохберга для проверки множественных гипотез (значение FDR q<>

5.2. Значительно обогащенные наборы генов отличительного признака

Затем мы изучили значительно обогащенные наборы генов отличительных признаков в MSigDB (получено 26 ноября 2021 г.). Наборы отличительных генов представляют собой специфические, четко определенные биологические состояния или процессы, генерируемые на основе выявления перекрытий наборов генов и сохранения генов, которые демонстрируют когерентную экспрессию. Признаки имеют набор из 50 наборов генов, собранных из более чем 4000 перекрывающихся наборов генов, и, таким образом, имеют уменьшенный шум и избыточность [176].

Значительно обогащенные наборы отличительных генов включают гены, определяющие эпителиально-мезенхимальный переход, гены, активирующиеся в ответ на гипоксию, гены, регулируемые NF-kB в ответ на TNF, гены, активирующиеся и подавляемые активацией KRAS, гены, опосредующие апоптоз путем активации каспаз, гены, участвующие в миогенез, гены, экспрессия которых активируется в ответ на TGF- 1, гены, экспрессия которых активируется STAT5 в ответ на стимуляцию IL-2, гены, определяющие воспалительный ответ, гены, участвующие в путях и сетях p53, и гены, кодирующие белки, участвующие в гликолизе и глюконеогенез (рис. 4В). Значимость рассматривалась при значении q FDR.<>

Интересным открытием является обогащение активации KRAS DEGs обработанных изорамнетином hAECs. Было обнаружено, что экспрессия нескольких генов, индуцированных KRAS, значительно подавляется изорамнетином, таких как MMP9, TSPAN1 и ITGBL1. Гипергликемия вызывает геномную нестабильность, приводящую к мутациям KRAS в клетках поджелудочной железы [177], а также связана с повышенным риском и инвазивностью рака поджелудочной железы [178] и рака толстой кишки [179]. Wang et al. сообщили, что изорамнетин подавляет пролиферацию клеточной линии аденокарциномы поджелудочной железы PANC-1 посредством подавления активности сигнального пути Ras/MAPK [134]. Поэтому, как упоминалось в разделе 4.2.4, влияние изорамнетина на KRAS-индуцированный риск развития рака при диабете, особенно рака поджелудочной железы, заслуживает дальнейшего изучения.

5.3. Значительно обогащенные пути

Дальнейший анализ путей распространения DEG был проведен с использованием базы данных сравнительной токсикогеномики (CTD) (http://ctdbase.org/; по состоянию на 29 ноября 2021 г.) [180]. CTD представляет Киотскую энциклопедию генов и геномов (KEGG) и пути REACTOME. Мы обнаружили, что нескольковоспалительныйпути, образование и сборка коллагена, сигнальный путь PI3K-Akt и сигнальный путь AGE-RAGE при диабетических осложнениях были значительно обогащены (рис. 4C).

Конечные продукты расширенного гликирования (AGE) образуются в результате неферментативного гликирования и окисления белков, липидов и нуклеиновых кислот. Рецепторы конечных продуктов усиленного гликирования (RAGE) принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов. Передача сигналов AGE/RAGE представляет собой сложный и запутанный каскад, который активирует множественные внутриклеточные сигнальные пути, включающие протеинкиназу С, НАДФН-оксидазу и МАРК, что приводит к NF-kB-индуцированной экспрессии IL-1, IL-6, TNF-, VCAM-1 и VEGF. В частности, передача сигналов AGE/RAGE вовлечена в опосредованную диабетом кальцификацию сосудов посредством активации TGF-опосредованного фиброза, путей NFkB и ERK1/2 [181-184]. Мы обнаружили, что изорамнетин значительно снижает экспрессию генов, связанных с передачей сигналов AGE/RAGE, таких как COL1A1, COL1A2, COL4A6, FN1, MMP2 и SERPINE1. Как обсуждалось в предыдущем разделе, антифибротические эффекты изорамнетина хорошо задокументированы [71, 74, 99, 119], и поэтому можно утверждать, что изорамнетин может также оказывать благотворное влияние на сосудистую патологию, вызванную диабетом.

5.4. Значительно усиленные метаболические заболевания и связанные с ними экспрессии генов

Кураторские данные об ассоциации генов и заболеваний были получены из CTD (получено 29 ноября 2021 г.). Мы курировали только значительно обогащенные метаболические заболевания. Значимость обогащения рассчитывали по гипергеометрическому распределению, скорректированному по методу Бонферрони. Значительно обогащенные метаболические заболевания включали сахарный диабет, нарушения обмена глюкозы и липидов, гипергликемию и ожирение (рис. 4D). Тепловая карта показывает, что экспрессия PPAR, TGF, TNF, IL, коллагена и генов, индуцирующих апоптоз, была значительно снижена в hAEC, обработанных изорамнетином (рис. 4E). С другой стороны, инсулиновые рецепторы, липопротеинлипазы и ингибиторы апоптоза значительно активировались в hAEC, обработанных изорамнетином.

Наш целевой анализ данных микрочипов hAEC, обработанных изорамнетином, также подтвердил потенциал изорамнетина в регуляции биологических функций, связанных с СД и связанными с ним осложнениями.

6. Биодоступность и кишечная абсорбция агликона изорамнетина и его гликозилированных производных

При наличии различных категорийфлавоноидыв природе интересно проанализировать наличие этих соединений в организме. Когда мы говорим о метаболизме изорамнетина и его доступности в организме человека после употребления, мы говорим о происхождении, метаболизме и транспорте. Это основано на наблюдении, сделанном с помощью хроматографии некоторых флавоноидов, таких как флавонолы, в сыворотке крови человека. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия дает представление о биодоступности некоторых флавоноидов в их агликоновых и гликозидных формах в организме [49]. Масс-спектрометрию можно использовать для определения флавоноидов в биологических образцах [185]. В исследовании сообщалось о 23 смешанных производных сульфатов, метила, глюкуронида и глюкозы.кверцетинкак в моче, так и в плазме добровольцев через 1 ч после приема внутрь слегка обжаренного красного лука. Это исследование обнаружило гликозиды как кверцетина, так и изорамнетина в плазме [186].

Несколько факторов играют роль в поступлении питательных веществ через пищеварительный тракт. Например, ферменты кишечной микробиоты влияют на поступление фенольных соединений.

Исследование, проведенное с экстрактами листьев гинкго на модели мышей, показало важность микробиоты кишечника для биодоступности и всасывания из желудочно-кишечного тракта некоторых биоактивных молекул, особенно изорамнетина [187]. На этом этапе ферменты кишечной микробиоты производятфлавоноидагликоны и различные продукты расщепления колец. Анализ образцов цельной крови показал, что поглощение изорамнетина увеличивалось при антибактериальном лечении, что свидетельствует о негативном влиянии ферментов микробиоты кишечника на фармакокинетику природных молекул, таких как изорамнетин.антибактериальныйили потребление пробиотиков может увеличить биодоступность гликозидной формы изорамнетина. Кроме того, скорость биотрансформации in vitro и время пребывания биоактивных молекул различались между нормальными крысами, крысами с диабетом и диабетической нефропатией [188].

С другой стороны, транспорт флавоноидов контролируют различные мембранные транспортеры, такие как натрий-зависимый переносчик глюкозы 1 (SGLT1) и белки 2 и 3, ассоциированные с множественной лекарственной устойчивостью (MRP2 и MRP3) [189]. В этом контексте транспортеры MRP регулируют трансцеллюлярный и парацеллюлярный пути транспорта изорамнетина [190]. Внутри клеток транспорт изорамнетина с апикальной на базальную сторону был в 6,8-9,3-раз выше. На рисунке 5 суммированы противодиабетические эффекты изорамнетина.

7. Выводы

Изорхамнетин представляет собой фенольное соединение семейства флавоноидов, точнее флавонолов. Первоначально это молекула кверцетина, но она подверглась метилированию. Изорхам-нетин распространен в растительном мире во многих дикорастущих и косметических растениях. Кроме того, несколько лекарственных растений производят эту молекулу, и несколько исследований подтвердили ее антидиабетический эффект среди других биологических активностей. Таким образом, все эти данные показывают интерес к изорамнетину в терапевтической промышленности. С этой точки зрения было бы очень интересно изучить влияние изорамнетина и его производных, особенно выделенных из природных ресурсов, на нарушения обмена веществ. Также необходимо выделить и проанализировать клинические исследования, проведенные в этом контексте с использованием фракций, богатых флавоноидами, и натуральных продуктов, чтобы избежать влияния побочных эффектов, вызванных синтетическими и химическими препаратами.

использованная литература

1. Гилл, С.С.; Тутея, Н. Активные формы кислорода и антиоксидантный механизм устойчивости к абиотическому стрессу у сельскохозяйственных культур. Завод Физиол. Биохим. 2010, 48, 909–930. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

2. Корпус, Ф.Дж.; Гупта, ДК; Пальма, Дж. М. Производственные участки активных форм кислорода (АФК) в органеллах растительных клеток. В активных формах кислорода и окислительном повреждении растений в условиях стресса; Springer: Берлин/Гейдельберг, Германия, 2015 г.; стр. 1–22.

3. Фаллех, Х.; Уэслати, С.; Гайо, С .; Дали, А.Б.; Магне, К.; Абделли, К.; Коури, Р. ЖХ/ЭСИ-МС/МС характеристика процианидинов и пропеларгонидинов, ответственных за сильную антиоксидантную активность съедобного галофита Mesembryanthemum edule L. Food Chem. 2011, 127, 1732–1738. [Перекрестная ссылка]

4. Трабелси, Н.; Уэслати, С.; Фалле, Х .; Ваффо-Тегуо, П.; Папастамулис, Ю.; Мерийон, Ж.-М.; Абделли, К.; Ксури, Р. Выделение мощных антиоксидантов из лекарственного галофита Limoniastrum Guyonianum. Пищевая хим. 2012, 135, 1419–1424. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

5. Булааба, М.; Мкадмини, К.; Цолмон, С .; Хан, Дж.; Смауи, А .; Кавада, К.; Ксури, Р .; Исода, Х .; Abdelly, C. Антипролиферативное действие экстрактов Arthrocnemum Indicum in vitro на раковые клетки Caco-2 посредством контроля клеточного цикла и связанной идентификации фенола LC-TOF-MS. Дополнение, основанное на доказательствах. Альтерн. Мед. 2013, 2013, 529375. [Перекрестная ссылка]

6. Каркер М.; Де Томмази, Н.; Смауи, А .; Абделли, К.; Ксури, Р .; Брака, А. Новые сульфатированные флавоноиды из тамарикса африканского и биологическая активность его полярного экстракта. Планта Мед. 2016, 82, 1374–1380. [Перекрестная ссылка]

7. Бургу, С.; Реби, И.Б.; Мкадмини, К.; Исода, Х .; Коури, Р .; Kouri, WM LC-ESI-TOF-MS и GC-MS профилирование травы полыни и оценка ее биологически активных свойств. Еда Рез. Междунар. 2017, 99, 702–712. [Перекрестная ссылка]

8. Булааба, М.; Медини, Ф.; Хайлауи, Х .; Мкадмини, К.; Фалле, Х .; Коури, Р .; Исода, Х .; Смауи, А .; Abdelly, C. Биологическая активность и фитохимический анализ фенольных экстрактов Salsola kali L. Роль эндогенных факторов в выборе лучших растительных экстрактов. С. Афр. Дж. Бот. 2019, 123, 193–199. [Перекрестная ссылка]

9. Наджар, Х.; Абделькарим, BA; Дориа, Э.; Бубакри, А .; Трабелси, Н.; Фалле, Х .; Тлили, Х .; Неффати, М. Фенольный состав некоторых тунисских лекарственных растений, связанный с антипролиферативным действием на клетки рака молочной железы человека MCF-7. ЕвроБиотехнолог. Ж. 2020, 4, 104–112. [Перекрестная ссылка]

10. Бургу, С.; Беттаиб Ребей, И.; Бен Кааб, С.; Хаммами, М .; Дахлауи, С.; Саусен, С .; Мсаада, К.; Исода, Х .; Ксури, Р .; Фоконье, М.-Л. Зеленый растворитель для замены гексана для экстракции биоактивных липидов из семян черного тмина и базилика. Foods 2021, 10, 1493. [CrossRef]