Фенилэтаноидные гликозиды Cistanche Deserticola: механизм нейропротекторного действия

Майцюань Ли и др.

Абстрактный:Ядерный фактор, 2-родственный эритроидному фактору 2 (Nrf2), является ключевым фактором транскрипции против окислительного стресса и нейродегенеративных заболеваний.Фенилэтаноидные гликозиды(PhGs; салидрозид,актеозид, изоактеозид иэхинакозид) обладают антиоксидантными свойствами инейропротекторныйбиоактивность. Это исследование было проведено для изучениянейропротекторныйЭффект и молекулярный механизмPhG. PhGпредварительная обработка значительно подавляла цитотоксичность, индуцированную H2O2-, в клетках PC12, вызывая ядерную транслокацию Nrf2 и обращая вспять подавленную экспрессию белка гемоксигеназы 1 (HO-1), NAD(P)H хиноноксидоредуктазы 1 (NQO1 ), каталитическую субъединицу глутамат-цистеинлигазы (GCLC) и субъединицу-модификатор глутамат-цистеинлигазы (GCLM). siRNA Nrf2 или ингибитор HO-1 протопорфирин цинка (ZnPP) уменьшалинейропротекторныйэффект. PhG показали потенциальное взаимодействие с сайтом связывания Nrf2 в Kelch-подобном белке 1 ассоциации ECH (Keap1). Этот результат может поддерживать гипотезу о том, что PhG являются активаторами Nrf2. Мы продемонстрировали потенциальное связывание между PhG и Keapl-активируемым путем Nrf2/ARE, а также то, что PhG с большим количеством гликозидов обладают усиленными эффектами.

Ключевые слова:Сохранить1; НРФ2;Нейропротекторный; клетки РС12;PhG(NQO1), среди прочих [5-7]. Этот процесс представляет собой ключевой этап в защите клеток от окислительного стресса и становится многообещающей терапевтической мишенью для нейропротекции [8]. Gaia сообщил, что Nrf2 смягчает нейродегенерацию, индуцированную LRRK2- и a-synuclein, путем мощного стимулирования гомеостаза нейронных белков клеточно-автономным и зависящим от времени образом [9].

Фенилэтаноидные гликозиды (PhG) характеризуются остатками коричной кислоты и гидроксифенилэтила, присоединенными к ар-глюкопиранозе через сложноэфирные и гликозидные связи соответственно. Эти молекулы являются членами группы водорастворимых природных продуктов, широко распространенных в растительном мире [10]. Исследования in vitro и in vivo показали, что эти соединения обладают антиоксидантными свойствами [11],нейропротекторный[12], антибактериальный,

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Цистанхе обладает нейропротекторными свойствами, нажмите здесь, чтобы узнать больше

1. Введение

Окислительный стресс, представляющий собой дисбаланс антиоксидантного гомеостаза, вызывает перекисное окисление липидов, повреждение белков и ДНК, старение и гибель клеток. Этот процесс, вероятно, способствует развитию ряда нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП) и ишемия/реперфузия [1]. Известно, что перекись водорода (H2O2), которая является одной из основных активных форм кислорода (АФК), вызывает перекисное окисление липидов и повреждение ДНК [2]. Более того, H2O2 является эндогенным источником гидроксильных свободных радикалов, что способствует фоновому уровню клеточного окислительного стресса [3,4]. Следовательно, терапевтические стратегии для предотвращения апоптоза, вызванного окислительным стрессом, могут иметь потенциал в лечении нейродегенеративных заболеваний.

Ядерный фактор, 2-родственный эритроидному фактору 2 (Nrf2), представляет собой фактор транскрипции, тесно связанный с окислительным стрессом. Активация Nrf2 индуцирует транскрипцию многочисленных генов антиоксидантов и детоксикации, в том числе гемоксигеназы -1 (HO-1), NAD(P)H-хиноноксидоредуктазы 1.

противовоспалительная [13] и иммуномодулирующая [14] биоактивность. Osmanthusfragrans является распространенным ингредиентом некоторых азиатских блюд и уже давно употребляется в пищу. Ранее мы показали, что экстракты цветков O.fragrans улучшают пространственное обучение и память, ингибируют окислительное повреждение и проявляют нейропротекторную активность при старении, вызванном d-галактозой, на модели ICR у мышей [15]. Салидрозид, актеозид и изоактеозид являются основным ответом PhG на антиоксидантную активность экстрактов цветков O.fragrans [16].

Исследования нейропротекторного действия ФГ дали желаемые результаты. Салидрозид значительно снижал клеточный апоптоз клеток PC12, которые подвергались воздействию MPP plus [17,18]. Актеозид также ослаблял MPP plus-индуцированный апоптоз и окислительный стресс в клетках PC12 [19] и A p25-35-индуцированное повреждение клеток SH-SY5Y [20].Эхинакозидисследовали апоптоз, индуцированный фактором некроза опухоли-а (TNFa), в клетках SH-SY5Y [21], дофаминергическую токсичность, индуцированную MPTP, у мышей [22], первичные культуры клеток коры головного мозга, поврежденные глутаматом [23], и {{ 9}}Повреждение, вызванное OHDA, в клетках PC12 [24]. Результаты показали, что PhG проявляют цитопротекторный эффект и являются потенциальными средствами для лечения нейродегенеративных заболеваний. Исследования показали, что антиоксидантные свойства PhG лежат в основе многих других видов биоактивности этих соединений [25]. Однако в нескольких исследованиях изучался молекулярный механизм PhG против окислительной токсичности.

В нашем исследовании мы выбрали четыре типичных ФГ: салидрозид (фенилэтаноидные моносахариды), актеозид (фенилэтаноидные дисахариды), изоактеозид (фенилэтаноидные дисахариды) иэхинакозид(фенилэтаноидтрисахариды). Мы использовали модель гибели нейронов с использованием дифференцированных клеток PC12 [26] для исследования защитного эффекта и молекулярного механизма PhG на H2O2-индуцированной модели клеток PC12. Мы продемонстрировали, что PhG активируют путь Nrf2/ARE путем связывания с Kelch-подобным ECH-ассоциированным белком 1 (Keap1). Этот процесс активировал антиоксидантные ферменты и повысил устойчивость клеток PC12 к окислительному стрессу.

2. Результаты

2.1. PhG подавляли H2O2-индуцируемую цитотоксичность в клетках PC12

Были протестированы цитотоксические эффекты H2O2 и PhG (0.1,1,5 и 10 мкг/мл) на клетках PC12. Результаты показали, что H2O2 индуцирует потерю жизнеспособности клеток PC12 в зависимости от концентрации и времени (рис. 1А). Воздействие на клетки PC12 200 H2O2 в течение 2 часов привело к жизнеспособности клеток 57,4%. Предварительная обработка клеток PhG в концентрациях 0,1, 1, 5 и 10 -/мл не влияла на жизнеспособность клеток (рис. 1B) и заметно защищала клетки PC12 от повреждений, вызванных H2O2-, улучшая жизнеспособность клеток, как показано на рис. 9,549-22,141%, 12,092-25,289%, 1,470-9,289% и 3,411-11,441% соответственно (рис. 1C). . Однако салидрозид (0,1 мкг/мл), изоактеозид (0,1, 1, 5 и 10 мкг/мл),эхинакозид(0.1,1 и 5 мкг/мл) предварительная обработка не показала существенной разницы в повреждении клеток, вызванном HzOz. Предварительная обработка клеток PhG также улучшала морфологические характеристики, индуцированные H2O2 (рис. 1D).

Рисунок 1. PhG подавляли H2O2-индуцированную цитотоксичность в клетках PC12. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа МТТ. Цитотоксическое действие Н2О2 (А) и ФГ (Б) в разных концентрациях на клетки РС12. (C) PhG ослабляли H2O2-индуцированное снижение жизнеспособности клеток. Клетки PC12 инкубировали с PhG ({{10}}.1 и 10 мкг/мл) в течение 24 ч, а затем инкубировали с 200 пМ H2O2 в течение еще одного через 2 ч после удаления ФГ. (D) Морфологическое наблюдение. Клетки после обработки наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа (x100), CK: нормальная группа, H2O2: группа, получавшая H2O2, HL: группа, получавшая низкую дозу салидрозида, HH: группа, получавшая высокую дозу салидрозида, ML: группа, получавшая низкую дозу актеозида, MH: группа, получавшая высокую дозу актеозида, IL: группа, получавшая низкую дозу изоактеозида, IH: группа, получавшая высокую дозу изоактеозида, SL: группа, получавшая низкую дозу эхинакозида, SH: группа, получавшая высокую дозу эхинакозида. ** p < 0,01="" по="" сравнению="" с="" группой="" без="" лечения;="" #="" p="">< 0,05="" по="" сравнению="" с="" группой,="" получавшей="" h2o2;="" ##="" p="">< 0,01="" по="" сравнению="" с="" группой,="" получавшей="">

2.2. PhGs подавляли H2O2-индуцируемое внутриклеточное накопление ROS, перекисное окисление липидов (MDA) и повышенную активность супероксиддисмутазы (SOD) в клетках PC12

Воздействие на клетки PC12 200 пМ H2O2 в течение 2 ч повышало уровни АФК, содержание МДА и снижало активность СОД (рис. 2). Предварительная обработка PhG снижала уровень ROS, салидрозида и актеозида, а предварительная обработка высокими дозами изоактеозида и эхинакозида значительно снижала уровень ROS (p < 0,01).="" предварительная="" обработка="" салидрозидом="" не="" влияла="" на="" содержание="" мда,="">актеозидпредварительная обработка значительно снижала содержание MDA (p < 0,05).="" предварительная="" обработка="" изоактеозидом="" и="" эхинакозидом="" значительно="" снижала="" содержание="" мда="" до="" более="" высокого="">

Рис. 2. ФГ блокировали накопление АФК и МДА и повышали активность СОД в клетках РС12. Клетки PC12 инкубировали с PhG (0.1 и 10 4 г/мл) в течение 24 ч, а затем инкубировали с 200 мкМ H2O2 в течение еще одного через 2 ч после удаления ФГ. (А) ФГ блокировали накопление АФК и МДА. (B) PhG блокировали накопление MDA. (C) PhG увеличивали активность SOD. CK: нормальная группа, Модель: группа, обработанная H2O2, Салидрозид: группа, обработанная салидрозидом, Актеозид: группа, обработанная актеозидом, Изоактеозид: группа, обработанная изоактеозидом, Эхинакозид: группа, обработанная эхинакозидом. ** p < 0,01="" по="" сравнению="" с="" группой,="" не="" получавшей="" лечения;="" #="" p="">< 0,05="" по="" сравнению="" с="" группой,="" получавшей="" h2o2,="" ##="" p="">< 0,01="" по="" сравнению="" с="" группой,="" получавшей="">

2.3.PhGs обращает H2O2-индуцированный апоптоз в клетках PC12

Обработка H2O2 (200 |1M) в течение 2 ч значительно увеличивала апоптоз в клетках PC12 с общей скоростью апоптоза до 16,02% (рис. 3). Однако предварительная обработка ФГ (0,1 и 10 мкг/мл) в течение 24 ч снижала скорость апоптоза зависимым от концентрации образом (p < 0,01).="">актеозид, изоактеозид иэхинакозидзаметно снизил процент клеточного апоптоза на 4,750-6,627%, 4,413-5,800%, 6,593-10,047% и 1,530-7. 510 процентов соответственно.

Рисунок 3. PhG обращали H2O2-индуцированный апоптоз в клетках PC12. Клетки PC12 инкубировали с PhG (0.1 и 10 мкг/мл) в течение 24 ч, а затем инкубировали с 200 пМ H2O2 еще 2 ч после удаления PhG. Затем измеряли апоптоз с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентного зонда PI/FITC.

CK: нормальная группа, Модель: группа, обработанная H2O2, Салидрозид: группа, обработанная салидрозидом, Актеозид: группа, обработанная актеозидом, Изоактеозид: группа, обработанная изоактеозидом,Эхинакозид: эхинакозидобработанная группа. ** p < {{0}}.01="" по="" сравнению="" с="" группой,="" не="" получавшей="" лечения;="" ##="" p="">< 0,01="" по="" сравнению="" с="" группой,="" получавшей="">

2.4. PhG ослабляли индуцированную H2O 2-дисрегуляцию путей Nrf2-ARE в клетках PC12

Путь Nrf{{0}}ARE, как один из основных антиоксидантных путей в большинстве типов клеток, важен для регуляции роста и гибели клеток. Поэтому мы исследовали, участвует ли путь Nrf2-ARE в H2O2-индуцированном апоптозе, с помощью иммунофлюоресцентного анализа и вестерн-блоттинга с использованием специфических антител. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что PhG (0,1 и 10 мкг/мл) индуцировали ядерную транслокацию Nrf2 (рис. 4). После лечения ФГ, изоактеозидом иэхинакозидпривело к частичному восстановлению нормальной морфологии клеток. Результаты вестерн-блоттинга и анализа серой плотности показали, что PhG ({{0}},1 и 10 пг/мл) не оказывали существенного влияния на экспрессию Nrf2 в цитоплазме (рис. 5А, B) (p > {{20}}.05), но с повышенной экспрессией Nrf2 в ядре (рис. 5C, D) (p <0,01). затем="" мы="" изучили="" роль="" nrf2="" в="" h2o2-индуцированном="" апоптозе="" путем="" импорта="" мирнк="" nrf2.="" экспрессия="" белка="" и="" мрнк="" nrf2="" была="" значительно="" снижена="" во="" всех="" группах,="" получавших="" мирнк="" nrf2="" (рис.="" 5e-h).="" phg="" (0,1="" и="" 10="" пг/мл)="" предотвращали="" цитотоксичность,="" индуцированную="" h2o2-,="" в="" группах="" без="" обработки="" мирнк="" nrf2="" (p="">< 0,01),="" но="" такая="" защита="" отменялась="" мирнк="" nrf2.="" после="" обработки="" мирнк="" nrf2="" жизнеспособность="" клеток="" значительно="" снизилась="" даже="" при="" обработке="" phg="" (рис.="">

Рисунок 5. Защитный эффект PhG на Nrf2 в клетках PC12, обработанных H2O2-. (A) Экспрессия белка Nrf2 в цитоплазме была обнаружена с помощью иммуноблоттинга с использованием специфического антитела. p-Actin использовали в качестве контроля загрузки. (B) Количественный денситометрический анализ белка Nrf2 в цитоплазме. (C) Экспрессия белка Nrf2 в ядре была обнаружена с помощью иммуноблоттинга с использованием специфического антитела. Гистоны H3 использовали в качестве контроля загрузки. (D) Количественный денситометрический анализ белка Nrf2 в ядре. (E, F) Клетки PC12 предварительно инкубировали без (E) или с (F) миРНК Nrf2 в течение 24 ч, затем инкубировали с PhG или без них (0.1 и 10 мкг/мл) в течение 24 ч и инкубировали с H2O2 еще 2 ч после удаления ФГ. Общую экспрессию белка Nrf2 определяли иммуноблоттингом с использованием специфического антитела, а р-актин использовали в качестве контроля нагрузки. (G) Количественный денситометрический анализ общего белка Nrf2. (H) Количественный анализ мРНК Nrf2. (I) Клетки PC12 предварительно инкубировали с миРНК или без нее в течение 24 ч, затем инкубировали с PhG или без них (0,1 и 10 -/мл) в течение 24 ч и инкубировали с H2O2 еще 2 ч после удаления PhG. После лечения выживаемость клеток определяли с помощью анализа МТТ. CK: нормальная группа, Модель: группа, обработанная H2O2, Контроль Si: контрольная группа, обработанная миРНК, Отрицательный миРНК: группа, обработанная без миРНК, Положительный миРНК: группа, обработанная миРНК, Салидрозид: группа, обработанная салидрозидом, Актеозид: группа, обработанная актеозидом, Изоактеозид: обработанная изоактеозидом группа группа,Эхинакозид: группа, получавшая эхинакозид. ** p < {{0}}.01="" по="" сравнению="" с="" группой,="" не="" получавшей="" лечения;="" #="" p="">< 0.05,="" по="" сравнению="" с="" группой,="" обработанной="" h2o2="" (без="" обработки="" мирнк="" nrf2),="" ##="" p=""><0,01, по="" сравнению="" с="" группой,="" обработанной="" h2o2="" (без="" обработки="" мирнк="" nrf2);="" &="" p=""><0,05 по="" сравнению="" с="" группой,="" обработанной="" h2o2="" (с="" обработанной="" мирнк="" nrf2),="" и="" p=""><0,01 по="" сравнению="" с="" группой,="" обработанной="" h2o2="" (с="" обработанной="" мирнк="">

2.4. PhGs Reversed H2O2-Индуцированное подавление экспрессии белков HO-1, NQO1, GCLC и GCLM

HO{{0}}, NQO1 и глутамат-цистеинлигаза (GCL) являются важными клеточными антиоксидантными ферментами, а HO-1, NQO1 и каталитические или модифицирующие субъединицы GCL (GCLC или GCLM) Nrf2-регулирует нижележащие гены [27]. Экспрессия белков HO-1, NQO1, GCLC и GCLM наблюдалась после лечения. Было обнаружено очевидное различие между экспрессией белков HO-1 и NQO1 с H2O2 или без него (рис. 6A-C) (p <0.01). phg="" (0.1="" и="" 10="" п^г/мл)="" обращали="" вызванное="" h2o2-понижение="" экспрессии="" белка="" ho-1="" (за="" исключением="" салидрозида="" в="" {{32}="" },1="" пг/мл),="" nqo1="" (за="" исключением="" актеозида="" в="" концентрации="" 0,1="" пг/мл)="" (p="">< 0,01).="" h2o2="" также="" подавляла="" экспрессию="" белков="" gclc="" и="" gclm="" (p=""><0,05) (рис.="" 6a,="" d,="" e).="" phg="" (0,1="" и="" 10="" пг/мл)="" обращали="" вспять="" индуцированное="" h2o2-="" подавление="" экспрессии="" белка="" gclc="" (за="">эхинакозидпри {{0}}.1 пг/мл) (p < 0.01)="" и="" gclm="" (за="" исключением="" салидрозида="" при="" 0.1="" пг/мл)="" (="" р="">< 0.01).="" затем="" химические="" ингибиторы="" ho-1="" были="" использованы="" для="" дальнейшей="" оценки="" роли="" антиоксидантных="" ферментов="" в="" регуляции="" защиты="" phg="" от="" h2o2-индуцированной="" цитотоксичности.="" phg="" (0,1="" и="" 10="" пг/мл)="" предотвращали="" цитотоксичность,="" индуцированную="" h2o2-,="" но="" такой="" защитный="" эффект="" отменялся="" ингибитором="" ho-1="" znpp="" (p="">< 0,01)="" при="" 20="" пм="" (рис.="" 6f,="" p="">< 0,01).="">

2.5. Экспрессия Keap1 и молекулярный анализ стыковки

В физиологических условиях Keap1 действует как белок-репрессор Nrf2, связываясь с доменом Neh2 Nrf2 и нацеливая Nrf2 на Cul3-основанную на E3 убиквитинлигазу для убиквитинирования и последующей деградации протеасомой 26S [28]. Способность PhG связываться с Keap1 оценивали с помощью анализа молекулярного докинга для изучения механизма их антиоксидантного действия.

3. Обсуждение

Мы исследовали нейропротекцию PhG в отношении цитотоксичности, индуцированной H2O2, в клетках PC12. Результаты показывают, что предварительная обработка PhG значительно подавляла цитотоксичность, индуцированную HzOz, снижала уровень внутриклеточных АФК, улучшала уровень внутриклеточных антиоксидантных ферментов и, в конечном итоге, обращала вспять индуцированную H2O 2- цитотоксичность в клетках PC12. Более того, PhG усиливали транскрипционную активацию Nrf2, обращали вспять индуцированное HzOz подавление экспрессии белков HO-1, NQO1, GCLC и GCLM. Кроме того, PhG продемонстрировали потенциальное взаимодействие с сайтом связывания Nrf2 в белке Keap1.

При повреждении клеток PC12, индуцированном H2O2-, перекисное окисление липидов, которое относится к окислительной деградации липидов, увеличивает проницаемость мембран, что приводит к повреждению клеток [29]. Образование МДА широко используется в качестве показателя перекисного окисления липидов [30]. H2O2 увеличивает выработку АФК и истощает ферменты антиоксидантной защиты, такие как SOD, каталаза и GPx. Этот процесс приводит к окислительному стрессу [31], который играет ключевую роль в возникновении и прогрессировании большинства нейродегенеративных заболеваний. В соответствии с предыдущими исследованиями мы наблюдали повышенный уровень АФК, снижение внутриклеточных антиоксидантных ферментов и усиленный апоптоз клеток PC12 после обработки H2O2. Предварительная обработка PhG значительно ослабляла индуцированное HzOz увеличение внутриклеточных АФК, улучшала внутриклеточные антиоксидантные ферменты и, в конечном итоге, обращала вспять индуцированную HzOz цитотоксичность в клетках PC12.

Куанг и др. [32] сообщили, чтоэхинакозидпродемонстрировал значительный нейропротекторный эффект в отношении цитотоксичности, индуцированной H2O2-, в клетках PC12 посредством митохондриального апоптотического пути. В этом исследовании мы обнаружили, что эхинакозид, салидрозид, актеозид и изоактеозид проявляют нейропротекторное действие за счет усиления антиоксидантной активности клеток PC12, поскольку они усиливают транскрипционную активацию Nrf2 и усиливают экспрессию нижестоящих белков HO-1, NQO1, GCLC и GCLM. Многочисленные исследования ясно продемонстрировали, что активация генов-мишеней Nrf2, в частности HO-1, в астроцитах и ​​нейронах сильно защищает от воспаления, окислительного повреждения и гибели клеток. Сообщается, что система HO-1 очень активна в центральной нервной системе, и ее модуляция, по-видимому, играет решающую роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний [33]. Недавние исследования также прояснили роль Nrf2 в прогрессировании и риске БП [9] и Keap1 как эффективной мишени для реактивации Nrf2 при БА [34]. Результаты подтверждают новые данные о Nrf2 в качестве терапевтической мишени при нейродегенеративных заболеваниях.

Молекулярный анализ стыковки показал, что PhG могут связываться с Keap1 со следующими возможностями связывания:эхинакозид>изоактеозид > актеозид > салидрозид. В соответствии с этими результатами предварительная обработка PhG приводила к ядерной транслокации Nrf2 со следующей экспрессией Nrf2 в ядре:эхинакозид>изоактеозид * актеозид > салидрозид. Мы предположили, что количество гликозидов влияет на возможный способ связывания PhG и Keap1, а способ связывания дополнительно вызывает высвобождение Nrf2 из Keap1. Этот процесс привел к активации Nrf2 и нижестоящих генов и, в конечном счете, защищает клетки PC12 от H2O2 -индуцированного окислительного стресса.

4. Материалы и методы

4.1. Химические соединения и реагенты

Салидрозид (номер CAS 10338-51-9), актеозид (номер CAS 61276-17-3), изоактеозид (номер CAS 61303-13-7) иэхинакозид(CAS № {{0}}) были приобретены у YYuanye Biotechnology Company (Шанхай, Китай). PhG растворяли в PBS с получением маточного раствора 10 мг/мл, который хранили при -20 градусах. H2O2 приобретали у Aladdin® (Шанхай, Китай). Среда RPMI-1640 и фетальная бычья сыворотка были приобретены у Hyclone (Логан, Юта, США), а 0,5% трипсин-ЭДТА, пенициллин и стрептомицин были приобретены у Keyi (Ханчжоу, Китай). Диагностические наборы MDA, SOD, MTT и DCFH-DA были приобретены в Институте биотехнологии Beyotime (Нанкин, Цзянсу, Китай). Набор для двойного окрашивания Annexin V-FITC/PI был приобретен у компании Solarbio Life Sciences (Пекин, Китай). Антитела к Nrf2, гистону H3, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM и p-актину, IgG против пероксида мышиного хрена (HRP) и IgG против кроличьего пероксида хрена были приобретены у Abcam. (Лондон, Великобритания). Ингибиторы HO-1 и ZnPP были приобретены у Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США). RNAiso Plus, набор реагентов PrimeScript™RT с gDNA Eraser и SYBR® Premix Ex Taq™ II были приобретены у Takara (Shiga, Япония). Реагент для трансфекции Lipofectamine® RNAiMAX был приобретен у Thermo Fisher Scientific (Waltham, UK). Последовательности миРНК Nrf2 были следующими: вперед, CCGAAUUACAGUGUCUUAA; и наоборот, UUAAGACACUGUAAUUCGG. При этом контрольные последовательности миРНК были следующими: вперед, UUCUCCGAACGUGUCACGU; и наоборот, ACGUGACACGUUCGGAGAA.

4.2. Культура клеток

Линия феохромоцитомы надпочечников мыши (клетки PC12) была получена из Института биохимии и клеточной биологии, SIBS (CAS, Шанхай, Китай). Клетки поддерживали в RPMI-1640 (Hyclone), содержащем 10% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone), 100 ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина при 37°С с 5% CO2. Среду меняли через день.

4.3. Анализ жизнеспособности клеток

Клетки PC12 высевали в 96-луночные планшеты в количестве 2 x 104 клеток/лунку. После прикрепления клетки предварительно инкубировали с ингибитором или без него в течение 20 мин, инкубировали с ФГ или без него в течение 24 ч, а затем инкубировали с Н2О2 еще 2 ч после удаления ФГ. После инкубации клетки обрабатывали 5 мг/мл МТТ в течение 4 ч при 37°С и осторожно удаляли среду. Кристаллы формазана, образованные выжившими клетками, растворяли в 150 мкл ДМСО для получения синего цвета [35] и измеряли оптическую плотность при 570 нм на планшет-ридере. В контролях использовали такую ​​же концентрацию среды только с ДМСО. Жизнеспособность клеток нормализовали как процент от контроля.

Концентрации PhG (0.1,1,5 и 10 мкг/мл) были выбраны в зависимости от анализа цитотоксичности PhG и сообщения о цитопротекторном эффекте эхинакозида [32]. Согласно отчету, цитотоксический эффект не проявлялся ниже 10 мкг/мл, и сообщалось, что эхинакозид проявляет цитозащитный эффект в модели поврежденных клеток HzOz.

4.4. Анализ апоптоза

Апоптоз выявляли с помощью набора для двойного окрашивания Annexin V-FITC/PI (Solarbio). Клетки PC12 высевали в 6-луночные планшеты в количестве 2 x 105 клеток/лунку. После прикрепления клетки обрабатывали ФГ (0,1 и 10 мкг/мл) в течение 24 ч и инкубировали с Н2О2 еще 2 ч после удаления ФГ. После инкубации клетки промывали холодным PBS, дважды центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин и ресуспендировали в 500 мкл буфера для связывания. Аннексин V с меткой FITC (5 мл) и йодид пропидия.

4.5. Измерение внутриклеточных АФК, продукции МДА и СОД

Внутриклеточный уровень АФК определяли с помощью чувствительного к АФК флуоресцентного зонда, а именно 2,7-дихлордигидрофлуоресцентного диацетата (DCFH-DA). Клетки PC12 высевали в 6-луночные планшеты в количестве 2 x 105 клеток/лунку. После прикрепления клетки обрабатывали ФГ (0.1 и 10 мкг/мл) в течение 24 ч и инкубировали с Н2О2 еще 2 ч после удаления ФГ. После инкубации клетки трижды промывали PBS и затем инкубировали с 10 мкМ DCFH-DA. После инкубации при 37° в течение 20 мин клетки промывали PBS и собирали путем осторожного центрифугирования. Внутриклеточные АФК измеряли с использованием проточного цитометра Gallios™ (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США).

МДА и СОД измеряли с помощью наборов для анализа (Beyotime Biotechnology, Нанкин, Цзянсу, Китай). Все процедуры полностью соответствовали инструкциям производителей. Содержание МДА и СОД нормировали соответствующим содержанием общего белка.

4.6. Иммунофлуоресценция ядерной транслокации Nrf2

Клетки PC12 высевали на 6-луночные предметные стекла с плотностью 2 x 105 на лунку. После прикрепления клетки обрабатывали ФГ ({13}}.1 и 10 мкг/мл) в течение 24 ч и инкубировали с Н2О2 еще 2 ч после удаления ФГ. После инкубации клетки промывали холодным PBS и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 мин при комнатной температуре с последующей пермеабилизацией мембран с использованием 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин. Клетки инкубировали с IgG кролика против Nrf2 (Abcam) с 5% FBS в течение ночи при 4°С. Затем на клетки наносили вторичные антикроличьи антитела, конъюгированные с FITC, на 20 мин при комнатной температуре. Ядра окрашивали 4z,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) на заключительном этапе подготовки. Предметные стекла ненадолго промыли PBS, высушили на воздухе и поместили в антифлуоресцентную среду для обесцвечивания. Слайды визуализировали под лазерным конфокальным микроскопом (LMS780, Zeiss, Германия).

4.7. Экстракция белка

Клетки PC12 высевали в чашки диаметром 100 мм из расчета 1 x 107 клеток/чашку. После прикрепления клетки обрабатывали ФГ (0,1 и 10 мкг/мл) в течение 24 ч, а затем еще 2 ч инкубировали с Н2О2 с удалением ФГ. После инкубации клетки дважды промывали холодным PBS и соскребали с чашек 1000 мкл PBS. Гомогенаты клеток центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. После обработки клеточные белки экстрагировали буфером для лизиса клеток Beyotime RIPA с 1 мМ PMSF в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, выделяли цитоплазматические и ядерные белки, как описано в наборе Beyotime для экстракции ядер и цитоплазмы. Концентрацию белка в образцах определяли с помощью набора для анализа белка Beyotime BCA, и все образцы хранили при температуре -80 для вестерн-блоттинга.

4.8. Вестерн-блотанализ

Вестерн-блот анализ проводили стандартными методами. Вкратце, образцы белка (20 или 30 мкг) разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на мембраны PVDF. Мембраны блокировали в 5-процентном молоке-TBST и инкубировали в течение ночи при 4 градусах в первичных антителах. Используемые антитела включали Nrf2 (Abcam), Keap1 (Abcam), HO-1 (Abcam), NQO-1 (Abcam), GCLC (Abcam), GCLM (Abcam), гистон H3 (Abcam) и р-актин (Abcam). В качестве вторичного антитела использовали конъюгированный с пероксидазой антимышиный IgG (Abcam) или антикроличий IgG (Abcam). Белковые полосы визуализировали с использованием серии ChemiScope (Clinx Science Instruments, Шанхай, Китай). Значение серого для белковых полос определяли количественно с помощью ImageJ (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США).

4.9. Количественная ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК экстрагировали с использованием RNAiso Plus (Takara, Shiga, Japan) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы тотальной РНК подвергали обратной транскрипции с помощью набора реагентов PrimeScript™RT с gDNA Eraser (Takara, Shiga, Japan) в соответствии с инструкциями производителя. Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara, Shiga, Japan) в системе Applied Biosystems ViiA™ 7 для ПЦР в реальном времени. Относительную экспрессию генов-мишеней нормализовали по п-актину и анализировали методом 2-AACt. Последовательности праймеров для Nrf2 были следующими: прямой ACAGTGCTCCTATGCGTGAA и обратный TCTGGGCGGCGACTTTAT. Последовательности праймеров для п-актина были следующими: вперед, GCTGTCCCTGTATGCCTCT; и наоборот, TTGATGTCACGCACGATTT.

4.10. трансфекция миРНК

Клетки PC12 культивировали на предметных стеклах с 6-лунками при плотности 2 x 105 на лунку (для вестерн-блоттинга) или на предметных стеклах с 96-лунками при плотности 2 x 104 на лунку (для анализа клеток). анализ жизнеспособности). Контрольную миРНК и миРНК Nrf2 трансфицировали в клетки с использованием Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Через 24 часа инкубации клетки обрабатывали с помощью PhG и H2O2 или без них в течение указанного времени, а затем использовали для вестерн-блоттинга, qRT-PCR или анализа жизнеспособности клеток, как описано выше.

4.11. Молекулярный стыковочный анализ

Molecular docking analysis was performed to investigate the possible binding mode of PhGs to Keap1. The 3D structure of ligands was obtained from NCBI. The crystallized structure of Keap1 (PDB Code: 4L7B) was prepared using correcting structure issues (such as break bond and miss loop) using SYBYL-X 2.0. In this software simulation, crash represents the inadequate penetration between the protein and the ligand. Polar represents the hydrogen bonding and electrostatic interactions between the protein and the ligand. G-score [36] represents the hydrogen bonding, complex (ligand-protein), and internal (ligand-ligand) energies between the protein and the ligand. PMF-score [37] represents the Helmholtz free energy between the protein and the ligand. D-score [38] represents the charge and van der Waals interactions between the protein and the ligand. Chem-score [39] represents the hydrogen bonding, metal-ligand interaction, lipophilic contact, and rotational entropy, along with an intercept term between the protein and the ligand. C score represents the consensus score between the protein and the ligand, comprehensively reflecting the G, PMF, D, and Chem-scores. Tota-score reflects the binding capacity of the ligand to the protein. The best modes were generated and evaluated using the Total-score (>6) and C-score (>4).

4.12. Статистический анализ

Данные были проанализированы с использованием одностороннего ANOVA с анализом LSD с использованием SPSS. Все результаты были подтверждены тремя независимыми экспериментами. Данные выражали как среднее ± SD. Статистически значимые различия считались при p <>

Благодарности: Это исследование было поддержано Национальной крупной программой исследований и разработок Китая (№ 2017YFD0400200), Китайским фондом естественных наук провинции Чжэцзян (№ R15C200002) и Специальным проектом по оценке рисков безопасности качества сельскохозяйственной продукции (№ GJFP2018015), Министерство сельского хозяйства и сельских дел Китая.

Вклад автора:Байи Лу и Майцюань Ли разработали исследование. Майцюань Ли выполнил лабораторную работу, анализ данных и написал статью. Майцюань Ли, Тао Сюй, Фей Чжоу, Мэнмэн Ван, Хуаксинь Сун, Син Сяо и Байи Лу редактировали рукопись.

1 Национальная инженерная лаборатория интеллектуальных пищевых технологий и оборудования,

Ключевая лаборатория послеуборочной обработки агропродукции Министерства сельского хозяйства и сельских дел, Ключевая лаборатория оценки пищевой ценности агропродукции Министерства сельского хозяйства и сельских дел, Ключевая лаборатория Чжэцзян по переработке агропищевой продукции, Институт пищевых наук Фули, Колледж биосистем Инженерия и пищевые науки, Чжэцзянский университет, Ханчжоу 310058, Китай;

2 Колледж первой клинической медицины, Гуанчжоуский университет китайской медицины,

использованная литература

1. Вс, А.Ю.; Чен Ю.М. Окислительный стресс и нейродегенеративные расстройства. Дж. Биомед. науч. 1998, 5, 401-414.

2. Махешвари, А.; Мисро, ММ; Аггарвал, А .; Шарма, РК; Нандан, Д. Пути, участвующие в апоптозе зародышевых клеток яичка, индуцированном H2O2 in vitro. FEBS J. 2009, 276, 870-881.

3. Холливелл Б. Активные формы кислорода и центральная нервная система. Дж. Нейрохим. 1992, 59, 1609-1623.

4. Ричардсон, Дж. С.; Суббарао, КВ; Анг, Л.С. О возможной роли перекисного окисления свободных радикалов, вызванного железом, в дегенерации нервной системы при болезни Альцгеймера. Анна. Академик Нью-Йорка науч. 1992, 648, 326-327.

5. Чжан Д.Д. Изучение механизмов сигнального пути Nrf2-Keap1. Препарат Метаб. Ред. 2006 г., 38, 769-789.

6. Ито, К.; Тонг, К.И.; Ямамото, М. Молекулярный механизм, активирующий путь Nrf2-Keap1 в регуляции адаптивного ответа на электрофилы. Свободный Радик. биол. Мед. 2004, 36, 1208-1213.

7. Конг А.Н.; Овуор, Э .; Ю, Р .; Хеббар, В.; Чен, К.; Ху, Р.; Мандлекар, С. Индукция ксенобиотических ферментов посредством карткиназного пути и элемента антиоксидантного или электрофильного ответа (ARE/EpRE). Препарат Метаб. Ред. 2001, 33, 255-271.

8. Буэндиа И.; Михальская, П.; Наварро, Э.; Гамейро, И.; Эгеа, Дж.; Леон, Р. Путь Nrf2-ARE: новая мишень против окислительного стресса и нейровоспаления при нейродегенеративных заболеваниях. Фармакол. тер. 2016, 157, 84-104. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

9. Скибински Г.; Хван, В.; Андо, ДМ; Дауб, А .; Ли, А. К.; Рависанкар, А .; Модан, С .; Финукейн, мм; Потертый, BA; Finkbeiner, S. Nrf2 смягчает нейродегенерацию, вызванную LRRK2- и a-синуклеином, путем модуляции протеостаза. проц. Натл. акад. науч. США 2016, 114, 1165-1170.

10. Хименес, К.; Ригера, Р. Фенилэтаноидные гликозиды в растениях: структура и биологическая активность. Нац. Произв. 1994, 11, 591-606.

11. Георгиев М.; Алипиева, К.; Орхан, И.; Абрашев Р.; Денев, П.; Ангелова, М. Антиоксидантная и ингибирующая холинэстеразную активность Verbascum xanthophoeniceum Griseb. и его фенилэтаноидные гликозиды. Пищевая хим. 2011, 128, 100-105.

12. Ли, Н.; Ван, Дж.; Ма, Дж.; Гу, З .; Цзян, К.; Ю, Л.; Fu, X. Нейропротекторные эффекты терапии Cistanches Herba у пациентов с болезнью Альцгеймера средней степени тяжести. Дополнение, основанное на доказательствах. Альтерн. Мед. 2015, 2015,103985.

13. Лю, Ю.Л.; Он, В.Дж.; Мо, Л.; Ши, М.Ф.; Чжу, Ю.Ю.; Пан, С .; Ли, XR; Сюй, QM; Ян, С.Л. Антимикробная, противовоспалительная активность и токсикология фенилэтаноидных гликозидов из Monochasma savatieri Franch. бывший Максим. Дж. Этнофармакол. 2013, 149, 431-437.

14. Донг, К.; Яо, Дж.; Фанг, Дж. Н.; Дин, К. Структурная характеристика и иммунологическая активность двух экстрагируемых холодной водой полисахаридов из Cistanche Deserticola YC Ma. углевод. Рез. 2007, 342, 1343-1349.

15. Сюн, Л.; Мао, С .; Лу, Б.; Ян, Дж .; Чжоу, Ф .; Ху, Ю .; Цзян, Ю .; Шен, К .; Чжао, Ю. Экстракт цветков Osmanthusfragrans и актеозид защищают от старения, вызванного d-галактозой, в модели ICR на мышах. Дж. Мед. Еда 2016, 19, 54-61.

16. Цзян Ю.; Мао, С .; Хуанг, В .; Лу, Б.; Кай, З .; Чжоу, Ф .; Ли, М.; Лу, Т .; Чжао, Ю. Профили фенилэтаноидных гликозидов и антиоксидантная активность Osmanthusfragrans Lour. Цветы с помощью UPLC / PDA / MS и имитации модели пищеварения. Дж. Агрик. Пищевая хим. 2016, 64, 2459-2466.

17. Ли, X.; Е, Х .; Ли, Х .; Солнце, X .; Лян, В.; Тао, Л.; Канг, X .; Чен, Дж. Салидрозид защищает от апоптоза, индуцированного MPP plus, в клетках PC12, ингибируя путь NO. Мозг Res. 2011,1382, 9-18.

18. Чжан, Л.; Дин, В .; Солнце, Х .; Чжоу, В .; Хуанг, Дж.; Ли, Х .; Се, Ю .; Чен, Дж. Салидрозид защищает клетки PC12 от MPP plus-индуцированного апоптоза посредством активации пути PI3K/Akt. Пищевая хим. Токсикол. 2012, 50, 2591-2597.

19. Шэн, GQ; Чжан, младший; Пу, ХР; Ма, Дж.; Li, CL Защитный эффект вербаскозида на нейротоксичность, вызванную ионами 1-метил-4- фенилпиридиния, в клетках PC12. Евро. Дж. Фармакол. 2002, 451, 119-124.

20. Ван, Х.; Сюй, Ю .; Ян, Дж .; Чжао, X .; Солнце, X .; Чжан, Ю .; Го, Дж.; Zhu, C. Актеозид защищает клетки нейробластомы SH-SY5Y человека от повреждения клеток, вызванного бета-амилоидом. Мозг Res. 2009, 1283, 139-147.