AKT, активируемый предварительным кондиционированием, контролирует толерантность нейронов к ишемии через путь MDM2–p53 Ⅰ

Абстрактный

Одним из наиболее важных механизмов нейропротекции, опосредованной прекондиционирования, является ослабление клеточного апоптоза, индуцирующее толерантность мозга после последующей повреждающей ишемии. В этом контексте антиапоптотический сигнальный путь PI3K/AKT играет ключевую роль в регуляции дифференцировки и выживания клеток.

Нажмите, чтобы получить порошок цистанхе трубчатой ​​длянейропротекция

Известно, что активная AKT увеличивает экспрессию мышиной двойной минуты-2 (MDM2), E3-убиквитинлигазы, которая дестабилизирует p53, способствуя выживанию раковых клеток. В нейронах мы недавно показали, что взаимодействие MDM2-p53 потенцируется фармакологическим предварительным кондиционированием, основанным на субтоксической стимуляции глутаматного рецептора NMDA, который предотвращает индуцированный ишемией апоптоз нейронов.

Однако неизвестно, способствует ли этот механизм толерантности нейронов во время ишемического прекондиционирования (IPC). Здесь мы показываем, что IPC индуцирует PI3K-опосредованное фосфорилирование AKT по Ser473, которое, в свою очередь, фосфорилирует MDM2 по Ser166. Это фосфорилирование запускает ядерную стабилизацию MDM2, что приводит к дестабилизации p53, тем самым предотвращая апоптоз нейронов при ишемическом инсульте. Ингибирование пути PI3K/AKT вортманнином или сайленсингом AKT индуцировало накопление цитозольного MDM2, отменяя индуцированную IPC нейропротекцию.

Таким образом, IPC усиливает активацию сигнального пути PI3K/AKT и способствует толерантности нейронов, контролируя взаимодействие MDM2-p53. Наши результаты обеспечивают новый механистический путь, участвующий в индуцированной IPC нейропротекции посредством модуляции передачи сигналов AKT, предполагая, что AKT является потенциальной терапевтической мишенью против ишемического повреждения. Ключевые слова: АКТ; МДМ2; р53; ПИ3К; ишемическая толерантность; предварительное кондиционирование

1. Введение

У человека было выявлено наличие транзиторной ишемической атаки (ТИА) как эндогенного предобусловленного состояния с преимуществами функциональных исходов у пациентов с инсультом [1–3]. Эндогенная нейропротекция, индуцированная коротким субтоксическим ишемическим стимулом, известная как ишемическое прекондиционирование (ИПК), считается стратегией в новой области нейропротекции против ишемического повреждения [4–6].

Имеющиеся данные показывают, что нейропротекция, стимулируемая IPC, зависит от транскрипционных, трансляционных и посттрансляционных механизмов, которые изменяют функцию ключевых белков после ишемии [6–11]. Однако механизм, вовлеченный в индуцированную IPC ишемическую толерантность (IT), не был полностью выяснен в человеческом мозге [12,13].

Разработка новых экспериментальных подходов к пониманию нейропротекции, опосредованной ИПК, представляет собой мощный инструмент для расшифровки эндогенных механизмов, лежащих в основе ИТ головного мозга [6], которые могут раскрыть новые терапевтические цели, направленные на минимизацию повреждения головного мозга у пациентов с инсультом. В последние два десятилетия апоптотическая гибель нейронов позиционируется как важный механизм, участвующий в церебральном ишемическом повреждении [14-16]. В этом смысле протеинкиназа B или AKT, серин/треонинкиназа, для активации которой требуется функциональная фосфоинозитидкиназа (PI3K), считается важной мишенью для нейропротекторной терапии после ишемии [17,18].

Недавно мы продемонстрировали, что ингибирование сигнального пути PI3K/AKT повышает восприимчивость нейронов к эксайтотоксичности [19]. AKT участвует в сложной антиапоптотической сигнальной сети [20], компоненты которой могут присутствовать в разных субклеточных местах в зависимости от типа ткани [21,22]. В сердце AKT участвует в кардиопротекции, стимулируемой предварительным кондиционированием [23].

Данные также показывают, что фосфорилированная AKT способствует выживанию нейронов в начале церебральной ишемии [24]. Хотя активация AKT может способствовать индукции ИТ в головном мозге [25], точный механизм, включающий его IPC-опосредованную активацию, остается неясным. В опухолевых клетках активация сигнального пути PI3K/AKT приводит к фосфорилированию MDM2 по Ser166/186, что способствует ядерной транслокации MDM2 [26,27] и усиливает его убиквитинирующую активность [28].

В ядре MDM2 связывается с р53 и способствует его убиквитинированию и последующей протеасомной деградации, что ингибирует функцию р53 [29]. В условиях стресса р53 может также запускать сверхэкспрессию MDM2, которая, наоборот, подавляет активацию р53 в петле отрицательной обратной связи [30]. Ингибирование PI3K предотвращает активацию AKT [31] и фосфорилирование MDM2 в прекондиционированном сердце [32].

В этом контексте мы ранее обнаружили, что предварительное кондиционирование головного мозга in vivo снижает объем инфаркта после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (tMCAO) за счет повышения уровня экспрессии белка MDM2. Следовательно, комплекс MDM2-p53 ослаблял индуцированную ишемией активацию сигнального пути p53/PUMA/caspase-3 в первичных нейронах коры [33].

Здесь мы углубимся в роль сигнального пути PI3K/AKT в IPC-опосредованной толерантности нейронов к последующему ишемическому повреждению, а также в лежащий в основе механизм, и мы в основном сосредоточимся на потенциальной связи между активацией AKT и комплексом MDM2-p53. .

2. Результаты

2.1. Нейропротекция, продвигаемая IPC

Опосредуется фосфорилированием AKT по Ser473, фосфорилированием MDM2 по Ser166 и дестабилизацией p53 Ранее мы описали влияние взаимодействия MDM2-p53 на восприимчивость нейронов к ишемии [34] и ИТ [33]. Здесь мы исследовали потенциальную роль AKT в нейропротекции, опосредованной IPC, в качестве кандидата на участие в пути MDM2-p53.

Во-первых, мы подтвердили, что ишемия способствует активации AKT в нейронах, о чем свидетельствует фосфорилирование AKT по Ser473. Как показано на рисунке 1A, короткий (20 минут) OGD значительно индуцировал экспрессию p(Ser473)AKT и MDM2, тогда как уровни белка AKT оставались неизменными (рисунок S1A). Однако фосфорилирования AKT не наблюдалось, когда нейроны подвергались длительному OGD (90 мин). Кроме того, уровни белка MDM2 были ниже, что согласуется с более высокой экспрессией белка p53, как показано на рисунке 1A.

Зависимая от времени активация экспрессии Mdm2 после OGD (рис. 1B) подтверждает, что подострая ишемия может быть важна для индукции механизмов, которые предотвращают стабилизацию p53 после OGD, как описано ранее [33]. Мы использовали короткую OGD (20 минут) с последующей 2-часовой реоксигенацией в качестве модели IPC (рис. S1B) [33]; таким образом, мы проанализировали экстракты нейронов, собранные через 4 часа реоксигенации после OGD (OGD/R) или после OGD, которому предшествовал протокол IPC (IPC плюс OGD/R). Параллельно нейроны инкубировали в условиях нормоксии (Nx) или предварительного кондиционирования (IPC) (рис. S1B).

Как показано на рисунке 1C и рисунке S1C, IPC индуцирует раннюю активацию AKT, о чем свидетельствует фосфорилирование по Ser473 [35], с последующей стабилизацией белка MDM2 и фосфорилированием по Ser166. IPC также предотвратил стабилизацию p53, вызванную OGD/R (рис. 1C). Интересно, что изображения иммунофлуоресценции, показанные на рисунке 1D, показали, что IPC способствует фосфорилированию AKT по Ser473 в нейронах, которые преимущественно накапливаются в ядре, и снижает стабилизацию p53 после OGD/R (IPC плюс OGD/R) по сравнению с непрекондиционированными нейронами (OGD). /Р).

Следовательно, IPC предотвратил апоптоз нейронов и активацию каспазы -3, вызванную OGD/R, по данным проточной цитометрии (рис. S1D) и флуориметрии (рис. S1E) соответственно. Чтобы подтвердить роль p53 в нейропротекции, опосредованной IPC, мы использовали нейроны, экспрессирующие (дикий тип; wt) или не экспрессирующие (knockout; ko) белок p53. Наши результаты показывают, что нейроны, лишенные p53 (рис. S1F), были более устойчивы к апоптозу, вызванному OGD, чем нейроны p53 дикого типа.

Более того, уровни апоптоза в нейронах p53KO были аналогичны уровням, наблюдаемым в прекондиционированных (IPC плюс OGD/R) нейронах дикого типа (рис. S1G), что подтверждает ключевую роль дестабилизации p53 в IPC-опосредованной нейропротекции [33]. Наши результаты показывают, что IPC индуцирует нейропротекцию против ишемического инсульта посредством механизма, который включает фосфорилирование AKT по Ser473, стабилизацию MDM2 и фосфорилирование по Ser166 и дестабилизацию p53.

2.2. IPC запускает фосфорилирование MDM2 по Ser166 через путь PI3K/AKT

Сигнальный путь PI3K/AKT участвует в ИТ нейронов как in vitro [36], так и in vivo [37]. Однако роль IPC-опосредованной активации пути PI3K/AKT в регуляции комплекса MDM2-p53 остается неизученной. Для выяснения этого нейроны инкубировали с необратимым и специфическим ингибитором пути PI3K/AKT вортманнином [19].

Как показано на рисунке 2A, вортманнин отменял усиленное IPC (Ser473) AKT фосфорилирование и дестабилизацию p53, как показано на рисунке 1D. Эти результаты предполагают прямую связь между активацией AKT и ингибированием p53-опосредованного апоптоза нейронов (рис. S1D) и активацией каспазы-3 (рис. S1E), индуцированной после OGD/R. Основной регулятор стабилизации p53, MDM2, является мишенью AKT [26], которая фосфорилирует MDM2 по Ser166 и Ser186 [26]. Ингибирование PI3K вортманнином предотвращало фосфорилирование как (Ser473)AKT, так и (Ser166)MDM2, индуцированное IPC (рис. 2B).

Специфическое Akt-опосредованное фосфорилирование MDM2 по Ser166, индуцированное IPC, было подтверждено с использованием малой интерферирующей РНК (siRNA), специально разработанной против белка AKT1 (siAkt), высоко экспрессируемого в нейронах коры и чья активность необходима для выживания нейронов после ишемии. 38]. Как показано на рисунке 3, siAkt снижал уровни общего белка AKT и p(Ser473)AKT на 3-й день после трансфекции как в HEK-293T-клетках (рис. 3A), так и в нейронах коры головного мозга (рис. 3B).

Более того, нокдаун AKT (siAkt) предотвращал фосфорилирование (Ser166) MDM2 (рис. 3B). Эти результаты демонстрируют, что сигнальный путь PI3K/AKT, активируемый IPC, способствует фосфорилированию MDM2 по Ser166, что может быть ответственным за стабилизацию MDM2 и последующую дестабилизацию p53 после ишемического повреждения.

2.3. IPC-активированная AKT запускает стабилизацию ядерного белка MDM2 после ишемии

Активация AKT участвует в ядерной транслокации MDM2 в опухолевых клетках [26]. Принимая во внимание актуальность ядерной стабилизации MDM2 для выживания нейронов после ишемии [34] и, в частности, его нейропротекторную роль при ИПК [33], мы решили дополнительно исследовать значимость сигнального пути PI3K/AKT в регуляции субклеточной локализации MDM2. белок.

Таким образом, нейроны или HEK-293Т-клетки трансфицировали человеческим MDM2-меченым белком (MDM2-GFP). Репрезентативные блоты трансфицированных HEK-293T-клеток и изображения нейронов, эктопически экспрессирующих человеческий белок MDM2, после четырех различных экспериментальных условий (Nx, IPC, OGD/R и IPC плюс OGD/R) показаны на рисунке 4A и рисунке S1H. , соответственно.

Эктопическая экспрессия MDM2- GFP подтвердила, что IPC способствует накоплению ядер MDM2 по сравнению с непрекондиционированными ишемическими (OGD/R) или нормоксическими (Nx) нейронами (рис. 4A, B), как показано количественным определением отношения ядерной/цитозольной флуоресценции. (Рисунок S2B) и интенсивность ядерной флуоресценции MDM2-GFP (Рисунок S2C).

2.4. IPC способствует взаимодействию p(Ser473)AKT и MDM2, которое усиливает стабилизацию MDM2 в ядре и снижает индуцированный апоптоз нейронов при ишемии

После демонстрации роли усиленной IPC активации пути PI3K / AKT в ядерной стабилизации MDM2 мы дополнительно исследовали, взаимодействуют ли p (Ser473) AKT и MDM2 внутри ядра (рис. 6A). Иммунопреципитация MDM2 из экстрактов ядерных белков с последующим иммуноблоттингом против MDM2 и p(Ser473)AKT показала, что IPC способствует взаимодействию между p(Ser473)AKT и MDM2 после OGD/R, тем самым предотвращая стабилизацию ядерного p53, индуцированную OGD/R, как показано на входе ядра (рис. 6А).

Наконец, мы изучили пагубное влияние нарушения пути PI3K/AKT на апоптоз нейронов (рис. 6В). Ингибирование AKT противодействовало защитному эффекту IPC перед OGD, что подтверждает нейропротекторную роль AKT-MDM2 в контексте ИТ. Таким образом, наши результаты демонстрируют, что IPC индуцирует фосфорилирование и активацию AKT, что способствует фосфорилированию MDM2 по Ser166 и ядерной транслокации, где он взаимодействует с p(Ser473)AKT. Этот механизм может способствовать усиленной ядерной стабилизации MDM2, который играет важную роль в индуцированной IPC ишемической толерантности.

Как Cistanche защищает нейроны?

Есть некоторые свидетельства того, что Цистанхе может защищать нейроны, уменьшая апоптоз (запрограммированную гибель клеток) и способствуя выживанию нейронов. Апоптоз — это естественный процесс, который происходит в организме для удаления поврежденных или нежелательных клеток, но он может быть вредным, если он происходит чрезмерно или ненадлежащим образом. В лабораторных исследованиях было обнаружено, что цистанхе ингибирует апоптоз, и этот эффект может помочь защитить нейроны от повреждения.

Кроме того, Цистанхе содержит ряд биоактивных соединений, обладающих нейропротекторным действием. Например, он содержит эхинакозид, который защищает нейроны от окислительного стресса и воспаления. Он также содержит актеозид, который обладает противовоспалительными и антиоксидантными свойствами.

Продолжение следует...

Эмилия Баррио 1†, Ребека Весино 1,2†, Ирен Санчес-Моран 1 , Кристина Родригес 1,2,3, Альберто Суарес-Пиндадо 1 , Хуан П. Боланьос 1,2,3,4, Анхелес Алмейда 1, 2,3 и Мария Дельгадо-Эстебан 1,2,3,*

1 Институт функциональной биологии и геномики Университета Саламанки, CSIC, 37007 Саламанка, Испания; embg7@gmail.com (ЭБ); rebecavecino@usal.es (РВ); ирина _sm@usal.es (ИС-М.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (АС-П.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (АА)

2 Институт биомедицинских исследований Саламанки, Университетская клиника Саламанки, Университет Саламанки, CSIC, 37007 Саламанка, Испания

3 Кафедра биохимии и молекулярной биологии, Университет Саламанки, 37007 Саламанка, Испания ; Тел.: плюс 34-923-29-4908