ruЯзык
Главная / Знания / Содержание

Знания

Защитные эффекты цистанхе против H2O2/UVB-индуцированной деградации кожных фибробластов коллагена через Hsa-микроРНК -4535-опосредованную передачу сигналов TGF/Smad

May 06, 2023

АБСТРАКТНЫЙ

Это исследование было направлено на изучение механизма, лежащего в основезащитное действие цистанхепротив H2O2/UVB-индуцированного повреждения с использованием моделей фотоповреждения in vitro и in vivo. Более того, мы идентифицировали участие регуляции микроРНК в этом процессе. Обработанные H2O2/UVB кожные фибробласты человека HS68 и индуцированные UVB голые мыши C57BL/6J использовали в качестве моделей фотоповреждения in vitro и in vivo. Результаты показали, чтолечение цистанхеоблегчение индуцированного H2O2/UVB снижения жизнеспособности клеток, Нарушение передачи сигналов TGF/Smadи кожное старение. На основании результатов анализа массива микроРНК и поиска в базе данных has-miR-4535 был идентифицирован какпотенциальный кандидат miRNA, нацеленный на Smad4. In vitro обработка цистанхе активировала комплекс Smad2/3/4 и ингибировала экспрессию hsa-miR-4535 в клетках, подвергшихся воздействию H2O2/UVB. In vivo местное нанесение низких (12 мг/кг) и высоких доз (24 мг/кг) цистанхе на кожу спины голых мышей C57BL/6J значительно облегчало вызванное УФ-В фотоповреждение кожи, способствуя передаче сигналов синтеза коллагена TGF/Smad, уменьшение гиперплазии эпидермиса, образования морщин и старения кожи, а также ингибирование экспрессии hsa-miR-4535. В совокупности наши результаты указывают на связь между hsa-miR-4535 и передачей сигналов синтеза коллагена TGF/Smad и предполагают, что эти факторы участвуют в фотозащитном механизме цистанхе в дермальных фибробластах против старения, вызванного H2O2/UVB. Доказательства указывали на то, чтоцистанхе с антивозрастными свойствамивозможнорассматривается как дополнение ксредства по уходу за кожей.

Protective effects of cistanche

Продажа средств по уходу за кожей Cistanche

ВВЕДЕНИЕ

Клинические признаки старения кожи человека включают повышенную морщинистость, дряблость и неравномерную пигментацию [1]. Процесс старения кожи сложен и может быть разделен на два типа: внутреннее старение и внешнее старение. Внутреннее старение обусловлено течением времени и генетическими факторами, в то время как внешнее старение, также называемое фотостарением, в основном возникает в результате воздействия ультрафиолетового излучения [2, 3]. Предыдущие исследования показали, что во время как внутреннего, так и внешнего старения образуются активные формы кислорода (АФК). Накопление АФК может индуцировать передачу сигналов митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и активировать нижележащий фактор транскрипции, белок-активатор -1 (AP-1). Активированные AP-1 могут транслоцироваться в ядро ​​и связываться с промоторными областями матриксных металлопротеиназ (ММП) [4]. MMPs представляют собой большую группу цинк-зависимых эндопептидаз, способствующих деградации внеклеточного матрикса дермы кожи (ECM). В частности, MMP-1, коллагеназа, участвует в расщеплении коллагена типов I и III [5]. Коллагены типов I и III, основные компоненты ВКМ, способны обеспечивать поддержку и прочность кожной дермы, а их нарушение приводит к характерным морщинам и дряблости стареющей кожи [6]. Трансформирующий фактор роста-бета (TGF) представляет собой вездесущий и мощный цитокин с тремя различными изоформами, TGF 1, TGF 2 и TGF 3, который может положительно регулировать синтез коллагена в дерме кожи человека [2]. TGF инициируют свой сигнал, взаимодействуя со специфическими рецепторными комплексами серин/треонинкиназа клеточной поверхности, включая рецепторы TGF типов I (TRI) и II (TRII). Фосфорилирование TRI запускает фосфорилирование R-Smads (Smad2 и Smad3). Активированные R-Smads взаимодействуют со Smad4, регулируя транслокацию его ядра и активируя транскрипцию коллагена типов I и III посредством связывания с промоторами Smad-связывающих элементов (SBE) [7, 8]. Все больше данных указывает на то, что повышенная генерация АФК, вызванная естественным или фотостарением, способствует нарушению сигнального пути TGF/Smad, что, в свою очередь, приводит к снижению синтеза коллагена в дермальных фибробластах кожи человека [9, 10]. cistanche (3,5,7-тригидроксифлавон), природный член семейства флавоноидов, содержится в большом количестве в Alpinia officinarum и прополисе. Цистанхе является потенциальным кандидатом для лечения ишемического инсульта, диабета и различных видов рака [11–13]. Кроме того, цистанхе обладает антирадикальной и противовоспалительной активностью [14, 15]. Ранее мы показали, что цистанхе уменьшает воспаление, вызванное H2O2-, и способствует образованию коллагена через сигнальные пути рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGFI-R)/ERK1/2 в клетках HS68 [16, 17]. Кроме того, исследование показало, что цистанхе был идентифицирован как соединение Alpinia officinarum и обладает эффектом ингибирования коллагеназы в клетках дермальных фибробластов [18]. Однако более подробный молекулярный механизм, связанный с тем, как цистанхе регулирует старение кожи, неизвестен. МикроРНК (миРНК) представляют собой группу небольших одноцепочечных некодирующих молекул РНК со средней длиной 22 нуклеотида. Зрелые микроРНК транскрибируются с последовательностей ДНК. В большинстве случаев зрелые miRNAs связываются с 3'-нетранслируемыми областями (UTR) мРНК-мишеней, подавляя трансляцию мРНК [19]. В коже человека микроРНК играют решающую роль в регуляции клеточного метаболизма, рака, старения и образования коллагена [20-23]. Например, miR-377 может индуцировать старение дермальных фибробластов путем ингибирования экспрессии ДНК-метилтрансферазы 1 (DNMT1), что впоследствии приводит к меньшему метилированию промотора р53 и старению дермальных фибробластов [22]. Профиль микроРНК при повреждении клеток дермального сосочка человека (nHDP) под действием УФ-В ранее был исследован [24]. Однако то, как УФ-В-индуцированное старение дермальных фибробластов посредством регуляции микроРНК, особенно при участии природного соединения, в значительной степени неизвестно. Это исследование было направлено на изучение защитного действия цистанхе против повреждения кожи, вызванного H2O2/UVB, а также роли микроРНК-опосредованной деградации коллагена в этом процессе. Мы также стремились идентифицировать микроРНК, участвующих в регуляции синтеза коллагена.

Protective effects of cistanche

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Цистанхе ингибирует цитотоксичность, индуцированную UVB/H2O2-, в дермальных фибробластах человека HS68

Для исследования цитотоксичности цистанхе (рис. 1А) in vitro клетки HS68 обрабатывали различными дозами цистанхе (0, 10, 20, 30, 40, 50 мкМ). в течение 24 часов. Результаты анализа МТТ показали, что цистанхе не был цитотоксичен для клеток HS68 (рис. 1В). Затем мы подвергали клетки HS68 воздействию различных доз H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 мкМ) и УФ-В (0, 25, 30, 40, 50, 60 мДж/см²) в течение 24 часов. Обработка H2O2 и УФ-В снижала жизнеспособность клеток дозозависимым образом (рис. 1C, 1D). Для оценки цитопротекторных свойств цистанхе, следуяH2O2 и воздействие УФ-В, мы обработали клетку HS68разная концентрация цистанхе (10, 20, 30 мкМ)после H2O2- (200 мкМ) и УФВ-индуцированный (40мДж/см²) урона. ЧАС2O2 или только УФ-обработказначительно снизила (на 40 процентов) жизнеспособность HS68клетки. Однако лечение цистанхе предотвращало гибель клеток.в зависимости от концентрации (рис. 1E, 1F).Заметно более высокая концентрация цистанхе (30 мкМ)аллевиН2O2- и УФВ-индуцированная цитотоксичность.Поэтому доза цистанхе 30 мкМ была использована впоследующийв пробиркеисследования для оценки его защитногоэффекты в клетках HS68.

Protective effects of cistanche

Рисунок 1. Цистанхе ингибирует цитотоксичность, индуцированную UVB/H2O2-, в фибробластах кожи человека HS68. (A) Химическая структура цистанхе. (B) Жизнеспособность клеток HS68, обработанных различными концентрациями цистанхе (10, 20, 30, 40, 50 мкМ ) в течение 24 часов. (C и D) Жизнеспособность клеток HS68, подвергнутых воздействию различных доз H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 мкМ) или облученных УФ-В (25, 30, 40, 50, 60 Дж/см2) в течение 24 часов. (E и F) Жизнеспособность клеток HS68, подвергшихся воздействию H2O2 (200 мкМ) или облучению УФ-В (40 Дж/см2) в течение 1 часа, а затем обработанному цистанхом (10, 20, 30 мкМ) в течение 23 часов. Цитопротекторные эффекты цистанхе определяли с помощью анализа МТТ. Контрольным клеткам присваивали 100-процентную жизнеспособность. Значения показаны как среднее значение ± стандартная ошибка. Показана количественная оценка результатов (n=3) * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с необработанными контрольными клетками; ##P <0,01, ###P <0,001 по сравнению с клетками, обработанными H2O2 или UVB.



Цистанхе ослабляет клетки HS68, индуцированные H2O2-старение, а не апоптоз

Чтобы определить, было ли снижение жизнеспособности клеток связано с гибелью клеток или ингибированием роста, мы проверили экспрессию нескольких маркеров апоптоза и выживания с помощью вестерн-блоттинга в клетках HS68, подвергшихся воздействию различных доз H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 мкМ). ) в течение 24 часов. Мы обнаружили значительно сниженную экспрессию маркеров выживания, таких как p-Akt, и повышенную экспрессиюapoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >200 мкМ H2O2 (рис. 2А). Кроме того, мы провели проточную цитометрию для оценки апоптотических клеток с использованием окрашивания аннексином V и PI и получили аналогичные результаты. В совокупности 200 мкМ H2O2 не вызывали апоптоза клеток HS68 (рис. 2В). Затем мы обнаружили экспрессию нескольких маркеров старения, таких как p16, p21 и SA- -gal, для определения стареющих клеток. Наши результаты показали, что обработка цистанхе значительно снижала уровни белков p16 и p21, индуцированные H2O2-, а также количество SA- -gal-положительных клеток (рис. 2C, 2D).


Цистанхе ослабляет внутриклеточную/митохондриальную продукцию АФК, индуцированную УФВ/Н2О2-, и дисбаланс ММР в клетках HS68.

Окислительный стресс играет ключевую роль в различных заболеваниях и может быть вызван эндогенными или экзогенными факторами. Здесь мы использовали H2O2 в качестве эндогенного и UVB в качестве экзогенного фактора, чтобы вызвать окислительное повреждение, а затем исследовали активность цистанхе, устраняющую АФК. Для идентификации источников АФК использовали MitoSOX и DCFH-DA для определения внутриклеточных и митохондриальных АФК. Результаты окрашивания показали, что обработка H2O2 и УФ-В индуцировала накопление АФК, в то время как обработка цистанхе снижала образование АФК (рис. 3А, 3В). ВКроме того, поскольку дисбаланс ММР может инициировать гибель клеток, мы использовали JC-1 для определения изменений в ММР. Нормальные митохондрии флуоресцировали красным (димеры JC-1), тогда как поврежденные митохондрии флуоресцировали зеленым (мономеры JC-1). Воздействие UVB и H2O2 вызывало высокий уровень зеленой флуоресценции. Примечательно, что лечение цистанхе изменило зеленую флуоресценцию на красную, что указывает на восстановление митохондриальных функций (рис. 3С).

Protective effects of cistanche


Цистанхе ослабляет H2O2-индуцированный TGF/Smadнарушение пути синтеза коллагена в клетках HS68

Передача сигналов TGF/Smad способствует образованию коллагена в дермальных фибробластах кожи человека [25–27]. Поэтому мы исследовали роль синтеза цистанхе в коллагене через путь TGF/Smad в клетках HS68, подвергшихся воздействию H2O2. Результаты вестерн-блоттинга показали, что цистанхе значительно усиливал передачу сигналов TGF/Smad, а также синтез коллагена в клетках HS68, подвергшихся воздействию H2O2- (рис. 4A). Более того, дезорганизация коллагена типа I и III является одной из типичных характеристик стареющих фибробластов кожи [28]. Поскольку семейство ММР участвует в катаболизме коллагена [29], мы затем подтвердили влияние цистанхе на активацию ММР-1. Мы обнаружили, что цистанхе предотвращает деградацию коллагена в клетках HS68, подавляя уровень MMP-1, усиленный H2O (рис. 4А).
Кроме того, мы определили субклеточный молекулярный механизм, лежащий в основе этого защитного действия, сравнив клетки HS68, обработанные только H2O2 или совместно обработанные цистанхе, с использованием иммуноблоттинга и иммунофлуоресцентного окрашивания. лечение цистанхе усиливало ядерное накопление p-smad2/3 и Smad4, которое было нарушено воздействием H2O2 в клетках HS68.(Рисунок 4В, 4С). Эти результаты показали, что цистанхе может улучшать H2O2-индуцированную фрагментацию коллагена путем активации пути TGF/Smad в клетках HS68.


Лечение цистанхе снижает индуцированную H2O2-повышенную экспрессию hsa-miR-4535, которая, по прогнозам, нацелена на Smad4.

Анализ массива микроРНКобработанный цистанхеКлетки HS68 показали, что экспрессия hsa-miR-4535 была снижена в группе, получавшей цистанхе, по сравнению с контрольной группой (рис. 5А). Кроме того, используя базы данных miRNA, такие как miRDB и TargetScanHuman, мы предсказали предполагаемый консервативный сайт-мишень для hsa-miR-4535 в Smad4-3'-UTR (рис. 5B). После подтверждения целевого сайта репортерные конструкции Smad4-3'-UTR-WT и Smad4-3'-UTR MT трансфицировали в клетки HS68 для проверки прямого связывания hsa-miR-4535 с Смад 4-3'-УТР. Мы наблюдали 50-процентное снижение активности люциферазы между группами дикого типа и мутантными группами Smad4-3'-UTR после трансфекции, имитирующей hsa-miR-4535 (рис. 5C). Затем мы оценили влияние H2O2 (100 200 мкМ) на регуляцию hsa-miR-4535 и Smad 4 в клетках HS68 и обнаружили, что H2O2 дозозависимо усиливает hsa-miR-4535 и подавляет РНК Smad4. выражение (рис. 6A, 6B). Кроме того, эта тенденция в экспрессии hsa-miR-4535 и Smad4 была обращена вспять после обработки цистанхе, что указывает на то, что регуляция передачи сигналов Smad может быть вовлечена в опосредованное цистанхе облегчение H2O2-индуцированного повреждения клеток HS68 (рис. 6С, 6D). Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что цистанхе ослабляет вызванное H2O2-нарушение пути TGF/Smad путем подавления экспрессии hsa-miR-4535 в дермальных фибробластах кожи человека.


Protective effects of cistanche

Рисунок 4. Цистанхе ослабляет H2O2-индуцированное нарушение пути синтеза коллагена TGF/Smad в клетках HS68. (A) Клетки HS68 подвергались воздействию H2O2 (200 мкМ) в течение 1 часа, а затем обрабатывались цистанхом (30 мкМ) в течение 23 часов. Экспрессия белков компонентов пути, связанных с синтезом коллагена (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) и белка, связанного с деградацией коллагена (MMP-1), была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга. (B) Экспрессия белка p-smad2/3 и Smad4 в ядерной и цитозольной фракциях была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга. GAPDH использовали в качестве контроля нагрузки. Значения показаны как среднее значение ± стандартная ошибка. Показана количественная оценка результатов (n=3) *P < 0.05, **P <0.01, ***P <0,001 по сравнению с необработанные контрольные клетки; #P <0,05, ##P <0,01, ###P <0,001 по сравнению с клетками, обработанными H2O2-. (C) Анти-p-Smad2/3, антитело Smad4 и вторичное антитело, конъюгированное с FITC/PE, использовали для обнаружения экспрессии p-Smad2/3 (зеленый) и Smad4 (красный). DAPI указывал на расположение ядра (синий). Изображения были получены с использованием флуоресцентного микроскопа (200×).


Модуляция Smad4 с помощью has-miR-4535 участвует в синтезе коллагена в дермальных фибробластах кожи человека, подвергшихся воздействию H2O2-

Для дальнейшего определения механизмов, с помощью которых has-miR-4535 оказывает свое влияние на экспрессию Smad4 и его нижестоящую передачу сигналов в клетках HS68, мы трансфицировали клетки HS68 миметиками или ингибиторами hsa-miR-4535 и измеряли Smad4. и экспрессия коллагена ниже по течению. Результаты показали, что ингибирование hsa-miR-4535 ингибитором hsa-miR-4535 значительно обращало вспять подавление экспрессии мРНК Smad4 и белка в клетках HS68, обработанных H2O2- (рис. 7A–7C). . Более того, подавление hsa-miR-4535 частично восстанавливало H2O2-индуцированное нарушение COL1A1 и COL3A1 в обработанных H2O2- клетках HS68 (рис. 7C). Наоборот, повышенная экспрессия hsa-miR-4535 в результате миметической трансфекции hsa-miR-4535 блокировала опосредованную цистанхе активацию Smad4 в клетках HS68, подвергшихся воздействию H2O2 (рис. 7D–7F). Сверхэкспрессия hsa-miR-4535 частично снижает индуцированный цистанхе COL1A1

и уровни COL3A1 (рис. 7F). Сверхэкспрессия hsa-miR-4535 (рис. 8A–8C) или ингибирование Smad4 с помощью siRNA (рис. 8D, 8E) приводили к снижению синтеза коллагена при лечении цистанхе после воздействия H2O2. Неожиданно мы обнаружили, что как прямое замалчивание Smad4, так и обработка hsa-miR-4535 имитируют обратный индуцированный цистанхе синтез коллагена в клетках HS68, обработанных H2O2-. В совокупности мы пришли к выводу, что цистанхе регулирует синтез коллагена, потенциально за счет снижения уровня hsa-miR-4535 для усиления передачи сигналов Smad4 в клетках HS68, подвергшихся воздействию H2O2.

KSL30


Цистанхе усиливает путь синтеза коллагена TGF/Smad и ослабляет кожное старение, а также ингибирует экспрессию has-miR-4535 в клетках HS68, подвергшихся воздействию УФ-В

Поскольку УФ-свет играет важную роль в различных кожно-дермальных заболеваниях, включая воспаление, иммуносупрессию, рак и преждевременное старение [30–32], мы исследовали влияние цистанхе на передачу сигналов, связанных с синтезом коллагена, в клетках HS68, подвергшихся воздействию УФ-В излучения. Уровни белка компонентов пути TGF/Smad и нижестоящих COL1A1 и COL3A1 были снижены в клетках HS68, обработанных UVB, но эффективно повышались после обработки цистанхе (фиг. 9A). Результаты вестерн-блоттинга подтвердили, что цистанхеподавлял экспрессию MMP-1 с усилением UVB в клетках HS68 (фиг. 9A). Кроме того, мы выяснили омолаживающий эффект цистанхе в клетках HS68, подвергшихся воздействию УФ-В, продемонстрировав, что цистанхе снижает индуцированное УФ-В повышение уровней р16 и р21 (рис. 9А). Чтобы оценить, может ли цистанхе ослабить разрушение коллагена, вызванное УФ-В, путем ингибирования hsa-miR- 4535, нацеленного на Smad4, мы исследовали уровни has-miR-4535 и Smad4 в клетках, совместно обработанных УФ-В и цистанхе, с помощью количественной ПЦР. Мы обнаружили, что выражение has-miR-4535была значительно повышена в клетках, подвергшихся воздействию УФ-В, но снизилась после обработки цистанхом. Наоборот, экспрессия Smad4 подавлялась воздействием УФ-В, и это подавление заметно устранялось обработкой цистанхом (рис. 9В, 9С). В совокупности наши результаты показали, что цистанхе оказывает такое же действие, как и H2O2, для восстановления вызванного УФ-В снижения образования коллагена путем подавления уровней hsa-miR-4535, что способствует передаче сигналов Smad4 в клетках HS68.

Protective effects of cistanche


Местное применение цистанхе ослабляет вызванную УФ-В гиперплазию кожи и деградацию коллагена, а также усиливает передачу сигналов TGF/Smad в дорсальной коже голых мышей C57BL6/J.

Чтобы выяснить фотозащитный эффект цистанхе при повреждении кожи, вызванном УФ-В, in vivo, мы оценили уровень микроРНК -4535, Smad4 и изменения тканей кожи. На фигуре 10А показана схема экспериментального плана и график местного применения цистанхе после облучения УФ-В на спинной коже голых мышей C57BL6/J. Образование морщин наблюдали на дорсальных участках кожи мышей C57BL/6J в группе, подвергавшейся воздействию УФ-В. Местное применение цистанхе значительно уменьшило образование морщин, что указывает на опосредованное цистанхе увеличение содержания коллагена для поддержания целостности кожи (рис. 10В). Более того, гистологический анализ дермального слоя показал, что содержание и плотность коллагена в коже
были значительно ниже в группе, облученной УФ-В, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. Однако местное применение цистанхе (12 мг/кг и 24 мг/кг)


Protective effects of cistanche


Рисунок 6. Цистанхе повышает экспрессию Smad4 за счет снижения уровня hsa-miR-4535. (A, B) Клетки HS68 обрабатывали различными концентрациями H2O2 (0, 100, 20{{30}} мкМ ) в течение 24 часов. (C, D) Клетки HS68 подвергали воздействию H2O2 (200 мкМ) в течение 1 часа, а затем обрабатывали цистанхом (30 мкМ) в течение 23 часов. Экспрессию hsa-miR-4535 и Smad4 определяли с помощью qRT-PCR. Значения показаны как среднее значение ± стандартная ошибка. Показана количественная оценка результатов (n=3) * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с необработанными контрольными клетками; ##P <0,01, ###P <0,001 по сравнению с клетками, обработанными H2O2-.


способствовали увеличению содержания и плотности коллагена дозозависимым образом по сравнению с мышами, подвергнутыми УФ-облучению (Фигура 11). Морфологию кожи оценивали с помощью окрашивания H&E. Воздействие УФ-В увеличивало толщину эпидермиса по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. Тем не менее, местное применение цистанхе значительно облегчало вызванное УФ-В излучение.эпидермальная гиперплазия (рис. 11). Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание -gal указывало на то, что применение цистанхе снижало высокую экспрессию -gal в коже, облученной УФ-В (рис. 11). Чтобы определить, может ли цистанхе улучшать коллаген, индуцированный УФ-В.

Protective effects of cistanche

Рисунок 7. Сверхэкспрессия или ингибирование hsa-miR-4535 регулирует синтез коллагена в клетках HS68. (A–C) Клетки HS68 трансфицировали ингибитором hsa-miR-4535 (40 нМ) или ингибитором NC (40 нМ) в течение 1 ч, а затем совместно обрабатывали H2O2 (2 00 мкМ) в течение 23 часов. (D–F) Клетки HS68 трансфицировали hsa-miR-4535 миметиком (10 нМ) или миметиком NC (10 нМ) в течение 1 ч, а затем совместно обрабатывали цистанхе (30 мкМ) в течение 23 часов. Уровни hsa-miR-4535 определяли с помощью количественной ПЦР для обеспечения успешной трансфекции. Уровни белка Smad4, COL1A1 и COL3A1 анализировали с помощью вестерн-блоттинга. GAPDH использовали в качестве контроля нагрузки. Значения показаны как среднее значение ± стандартная ошибка. Показана количественная оценка результатов (n=3) * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с необработанными контрольными клетками; #P <0,05, ##P <0,01, ###P <0,001 по сравнению с клетками, обработанными H2O2 или цистанхе.


потеря волокон из-за подавления hsa-miR-4535 для усиления Smad4 in vivo, экспрессия его РНК оценивалась в иссеченном образце дорсальной кожи с помощью qRT-PCR. Экспрессия hsa-miR-4535 была повышена в коже, облученной УФВ, но значительно снижена вкожа, обработанная цистанхекак в низких, так и в высоких дозах. Кроме того, низкие уровни экспрессии РНК Smad4 в коже, облученной УФ-В, были восстановлены при лечении цистанхом (рис. 12А, 12В).


Protective effects of cistanche

Рисунок 8. Ингибирование Smad4 с помощью siRNA или hsa-miR-4535 миметика обращает вспять опосредованное цистанхе усиление синтеза коллагена в дермальных фибробластах. (A–C) Клетки HS68 трансфицировали hsa-miR-4535 миметиком (10 нМ) или миметиком NC (10 нМ) в течение 1 ч с последующей совместной обработкой цистанхе (3 {{40}} мкМ) и H2O2 (200 мкМ) в течение 23 часов. Уровни Hsa-miR-4535 (A) и Smad4 (B) определяли с помощью количественной ПЦР для обеспечения успешной трансфекции. (D – E) Клетки HS68 трансфицировали siRNA Smad4 (20 нМ) или siRNA NC (20 нМ) в течение 1 часа с последующей совместной обработкой цистанхом (30 мкМ) и H2O2 (200 мкМ) в течение 23 часов. Уровни Smad4 определяли с помощью количественной ПЦР для обеспечения успешной трансфекции (D). Уровни белка Smad4, COL1A1 и COL3A1 анализировали с помощью вестерн-блоттинга (C, E). GAPDH использовали в качестве контроля нагрузки. Показанные значения являются средними значениями ± стандартная ошибка. Показана количественная оценка результатов (n=3) * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с необработанными контрольными клетками; #P <0,05, ##P <0,01 по сравнению с клетками, обработанными H2O2-; $$P <0,01, $$$P <0,001 по сравнению с клетками, обработанными H2O2 плюс цистанхе

Кроме того, применение цистанхе восстанавливало экспрессию белков TGF , p smad2/3 и Smad4 в поврежденной УФ-B ткани кожи (фиг. 12C). Наши результаты показали, что цистанхе потенциально может защитить кожу от повреждений, вызванных УФ-В, путем ингибирования hsa miR-4535 для усиления экспрессии Smad4 для активации P-smad2/3, чтобы, наконец, стимулировать синтез коллагена (рис. 13).


image

Рисунок 9. Цистанхе усиливает путь синтеза коллагена TGF/Smad и ослабляет кожное старение, а также ингибирует экспрессию hsa-miR-4535 в клетках HS68, подвергшихся воздействию УФ-В. Клетки HS68 подвергали воздействию УФ-В (40 мДж/см2), а затем обрабатывали цистанхе (30 мкМ) в течение 23 часов. (A) Экспрессия белков компонентов пути, связанных с синтезом коллагена (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), белка, связанного с деградацией коллагена (MMP{{20}}), и старения- ассоциированные маркеры (p16 и p21) выявляли вестерн-блоттингом. GAPDH использовали в качестве контроля нагрузки. (B и C) Экспрессия РНК hsa-miR-4535 и Smad4 была обнаружена с помощью qRT-PCR. Значения показаны как среднее значение ± стандартная ошибка. Показана количественная оценка результатов (n=3) * P < 0,05, ** P <0,01 по сравнению с необработанными контрольными клетками; #P <0,05, ##P <0,01 по сравнению с клетками, подвергшимися воздействию УФ-В.

Попросить больше:

Электронная почта: wallence.suen@wecistanche.com WhatsApp: плюс 86 15292862950


Вам также может понравиться