Количественная оценка дегенерации нейритов с повышенной точностью и эффективностью на модели болезни Паркинсона in vitro. Часть 1

Абстрактный

Дегенерация нейритов связана с ранними стадиями нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона (БП) и боковой амиотрофический склероз. Один метод, который обычно используется для анализа дегенерации нейритов, включает расчет индекса дегенерации (DI) после использования инструмента «Анализ частиц» ImageJ для обнаружения фрагментов нейритов на микрофотографиях культивируемых клеток. Однако анализ DI подвержен нескольким типам ошибок измерения, может занимать много времени и ограничен в применении.

Под нейродегенерацией понимаются изменения, происходящие внутри или вокруг нейронов, которые могут влиять на когнитивные функции, интеллект, эмоции, поведение человека и т. д. Многие люди думают, что нейродегенерация тесно связана с ухудшением памяти, но это может быть не так.

Во-первых, нейродегенерация не обязательно означает, что память ухудшается с возрастом. Некоторые люди могут сохранять хорошую память и даже понимать праведность. Это связано с тем, что на память человека влияет сочетание таких факторов, как физические упражнения, диета и образ жизни.

Во-вторых, человеческий мозг может восстанавливать новые нейронные связи и формировать новые воспоминания, что называется пластичностью. Независимо от возраста мозг постоянно учится и формирует новые воспоминания. Таким образом, нейродегенерация — это просто естественное изменение в мозге, которое не обязательно означает ухудшение памяти.

Наконец, поддержание оптимистического настроя также может улучшить память человека. Беспокойство и стресс могут оказывать неблагоприятное воздействие на мозг, приводя к потере памяти. Позитивный настрой может способствовать здоровью мозга, улучшению памяти и когнитивных способностей.

Подводя итог, можно сказать, что нейродегенерация не обязательно приводит к потере памяти, а оптимистическое отношение к жизни может помочь нам сохранить хорошую память и когнитивные способности. Поэтому нам следует сохранять оптимистичный настрой и усиливать физические упражнения, диету и образ жизни, чтобы поддерживать здоровье мозга и память. Видно, что нам необходимо улучшить нашу память. Цистанхе может значительно улучшить память, поскольку Цистанхе также может регулировать баланс нейромедиаторов, например, повышая уровень ацетилхолина и факторов роста. Эти вещества очень важны для памяти и обучения. Кроме того, мясо также может улучшить кровоток и способствовать доставке кислорода, что может гарантировать, что мозг получает достаточное питание и энергию, тем самым повышая жизнеспособность и выносливость мозга.

Нажмите, чтобы узнать, как улучшить работу мозга

Здесь мы описываем улучшенный метод выполнения DI-анализа. Точность измерений была повышена за счет модификации критериев отбора для обнаружения фрагментов нейритов, удаления артефактов изображения и ненейритных материалов с изображений, а также оптимизации контрастности изображения. Такие улучшения были реализованы в макросе ImageJ, который обеспечивает быстрый и полностью автоматизированный DI-анализ нескольких изображений. В макросе предусмотрены операции автоматического удаления тел клеток с микрофотографий, что расширяет возможности применения DI-анализа в экспериментах с участием диссоциированных культур.

Мы представляем экспериментальные результаты, подтверждающие, что по сравнению с традиционным методом расширенный метод анализа обеспечивает измерения с повышенной точностью и требует значительно меньше времени для выполнения.

Кроме того, мы демонстрируем полезность метода для исследования дегенерации нейритов на модели БП в культуре клеток, проводя эксперимент, выявляющий влияние N-концевой киназы c-Jun (JNK) на дегенерацию нейритов, вызванную окислительным стрессом в мезэнцефалических клетках человека. Этот улучшенный метод анализа может быть использован для получения нового понимания факторов, лежащих в основе дегенерации нейритов и прогрессирования нейродегенеративных заболеваний.

Ключевые слова:

Аксональная дегенерация; индекс дегенерации; дегенерация нейритов; нейродегенерация; окислительный стресс; Болезнь Паркинсона.

Заявление о значении

Дегенерация нейритов — это клеточное событие, связанное с ранними стадиями нескольких типов нейродегенеративных заболеваний. Молекулярные факторы, регулирующие дегенерацию нейритов, остаются малоизученными, а существующие методы изучения дегенерации нейритов имеют ограниченное применение и эффективность. Здесь мы определяем модификации широко используемой процедуры анализа дегенерации нейритов, которые уменьшают ошибку измерения.

Такие методологические усовершенствования были включены в макрос ImageJ, тем самым облегчая быстрый и полностью автоматизированный анализ дегенерации нейритов с использованием больших наборов микрофотографий. Используя модель клеточной культуры болезни Паркинсона (БП), мы демонстрируем, что макрос способствует более точным и эффективным измерениям дегенерации нейритов, одновременно расширяя пригодность метода анализа для экспериментов с участием диссоциированных культур.

Введение

Дегенерация нейритов представляет собой клеточный процесс, при котором аксоны или дендриты подвергаются прогрессирующей дисфункции и морфологическим изменениям, что приводит к потере целостности нейритов. Дегенерация нейритов — это эволюционно консервативный процесс, который имеет решающее значение для правильного формирования нейронных сетей во время развития центральной нервной системы (Neukomm and Freeman, 2014).

Однако этот процесс также запускается в ответ на различные формы травм, таких как механическое повреждение или воздействие препаратов, используемых для химиотерапии (Salvadores et al., 2017). Кроме того, дегенерация нейритов связана с прогрессированием различных возрастных нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона (БП), болезнь Хантингтона и боковой амиотрофический склероз.

Интересно, что для всех подобных нейродегенеративных заболеваний накапливающиеся данные позволяют предположить, что дегенерация нейритов является ключевым событием на ранней стадии, которое предшествует гибели нейронов или появлению клинических симптомов (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert and Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Сузуки и др., 2020). Таким образом, исследования факторов, регулирующих этот клеточный процесс, могут выявить новые цели для лечения различных нейродегенеративных состояний.

Исследование дегенерации нейритов особенно важно для понимания БП — заболевания, характеризующегося накоплением белковых агрегатов, содержащих альфа-синуклеин, прогрессирующей потерей дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции (SNpc) и развитием разнообразных двигательных и когнитивных симптомов. (Аарсланд и др., 2017).

Данные посмертных и визуализирующих исследований человека показывают, что агрегаты альфа-синуклеина более распространены в нейрональных волокнах, чем в телах клеток, и деградация дофаминергических аксонов происходит в большей степени, чем потеря дофаминергических нейронов в SNpc в период, ведущий к клиническому началу. (Тальяферро и Берк, 2016).

Хотя молекулярные взаимодействия, которые способствуют прогрессирующему ухудшению дофаминергических нейритов, остаются до конца не изученными, недавние данные показывают, что дегенерация нейритов может быть опосредована событиями, независимыми от сигнальных каскадов, лежащих в основе гибели нейронов (Fukui, 2016; Geden and Deshmukh, 2016). Таким образом, исследования, которые непосредственно оценивают физиологические основы дегенерации нейритов, имеют решающее значение для разработки методов лечения, препятствующих раннему прогрессированию БП.

В ответ на доказательства центральной роли дегенерации нейритов в прогрессировании нейродегенеративных заболеваний были разработаны различные методы измерения дегенерации нейритов с использованием микрофотографий культивируемых нейронов. Например, было разработано множество различных методов для измерения дегенерации нейритов с использованием программного обеспечения для обнаружения уменьшения количества или длины нейритов (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Однако, поскольку такие методы напрямую не оценивают фрагментацию нейритов, интерпретация результатов для определения влияния переменной на дегенерацию нейритов может быть затруднена потенциальным влиянием переменной на рост нейритов. Некоторые исследовательские группы также измеряли дегенерацию нейритов путем субъективной оценки изображений нейритов на основе морфологических особенностей и степени очевидной фрагментации (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Однако этот альтернативный метод требует много времени и может привести к ошибке исследователя.

Один из методов, который облегчает объективное и прямое измерение фрагментации нейритов, включает использование алгоритма анализа частиц ImageJ для измерения площади фрагментов нейритов на микрофотографиях культивируемых клеток. Измерения используются для расчета индекса дегенерации (DI), шкалы от {{0}}.0 до 1,0, отражающей степень дегенерации нейритов (Sasaki et al., 2009).

Хотя анализ DI можно использовать для обнаружения различной степени фрагментации нейритов, точность измерений обычно ограничивается несколькими источниками ошибок, а применение метода в основном ограничивается культурами эксплантатов или клетками, выращенными в разделенных микрофлюидных устройствах. Более того, анализ DI требует много времени при экстраполяции на большие наборы изображений. Таким образом, мы стремились преодолеть эти ограничения, изменив процедуру анализа DI, чтобы обеспечить большую точность и эффективность, одновременно расширяя возможности применения.

В настоящем исследовании мы выявляем несколько источников ошибок, обычно связанных с анализом DI, и сообщаем о методологических изменениях, которые уменьшают различные формы ошибок. Мы включаем процедурные усовершенствования в макрос ImageJ, называемый автоматическим индексом дегенерации нейритов (ANDI), для полной автоматизации анализа DI на основе больших наборов изображений. Для работы ANDI Macro требуется только программное обеспечение и файлы с открытым исходным кодом, которые находятся в свободном доступе. Измерения, полученные с помощью ANDI, имеют повышенную точность и существенно сокращают время, необходимое для выполнения анализа.

Более того, мы демонстрируем, как новый метод анализа может быть применен для точного и быстрого измерения дегенерации нейритов в модели БП на клеточной культуре с участием диссоциированных клеток, выращенных без компартментализации. В совокупности эти методологические усовершенствования могут привести к новому пониманию факторов, лежащих в основе важного клеточного процесса, связанного с нейродегенерацией.

Материалы и методы

Культура клеток

Культуры мезенцефальных клеток Лунда человека (LUHMES) помещали в восьмилуночные предметные стекла Lab Tek II, покрытые поли-L-орнитином (PLO) и фибронектином, поли-D-лизином (PDL) и ламинином, всеми четырьмя субстратами или без них. субстраты, как указано. Для покрытия PLO и фибронектином предметные стекла инкубировали в течение ночи при комнатной температуре с раствором, содержащим 200 мг/мл PLO (Sigma-Aldrich, номер по каталогу P3655).

После промывки стерильной водой (Avantor) предметные стекла инкубировали с 2 мг/мл фибронектина (Sigma-Aldrich, номер по каталогу F0895) в течение 3 часов при 37 градусах. Затем предметные стекла промывали стерильным PBS (Corning Life Sciences, каталог №21-040-CV) и давали высохнуть на воздухе. Для покрытия PDL и ламинина предметные стекла инкубировали при комнатной температуре с раствором, содержащим 100 нг/мл PDL (Sigma-Aldrich, № по каталогу P7280) и 10 мг/мл ламинина (Corning, № по каталогу 354232).

После инкубации в течение ночи предметные стекла промывали стерильным PBS и оставляли высыхать на воздухе. Для нанесения покрытия на все четыре подложки вышеупомянутые процедуры выполнялись последовательно. Клетки LUHMES (ATCC, RRID: CVCL_B056) высевали на предметные стекла с покрытием при указанной плотности в среду для дифференцировки, состоящую из DMEM/F12 (Invitrogen, номер по каталогу 11330057) с добавлением 2 мМ глутамина (VWR), 1% (об./об.) добавка N-2, 1 мг/мл тетрациклина (Sigma-Aldrich, номер по каталогу 87128-25G), 1 мМ N6, 29-одибутириладенозин цАМФ (db-цАМФ) ; Enzo Life Sciences, каталог #BML-CN125-0100) и 2 нг/мл нейротрофического фактора, полученного из линии глиальных клеток (GDNF; R&D Systems, каталог #212-GD-010).

Если не указано иное, все культуры высевали с плотностью 115000 клеток на лунку. Замену среды на 50% объема проводили каждые 48 часов до начала лечения. Чтобы предотвратить генетический дрейф, во всех экспериментах использовались клеточные запасы, пассированные шесть или менее раз.

Эксперименты с первичными культурами симпатических нейронов были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Восточного Кентукки или Университета Вирджинии. Верхние шейные ганглии вырезали у мышей 0-6 C56Bl/6 постнатального дня, инкубировали при 37 градусах в буфере для ферментативной диссоциации, промывали питательной средой для удаления протеолитических ферментов и растирали.

Клеточные суспензии высевали с плотностью 7000 клеток на лунку в восьмилуночные предметные стекла Lab Tek II. Среды меняли в день in vitro (DIV) 1, с последующей заменой сред через день. В среду добавляли цитозин-арабинофуранозид (Ara-C, Millipore-Sigma) на DIV1-DIV3, чтобы предотвратить рост ненейрональных клеток, с последующим удалением Ara-C из среды по крайней мере за 24 часа до обработки, как указано. Для экспериментов, проведенных в Университете Восточного Кентукки, включающих обработку перекисью водорода, предметные стекла были покрыты 200 мг/мл PLO (Sigma-Aldrich, каталожный номер P3655), 2 мг/мл фибронектина, 100 нг/мл PDL (Sigma-Aldrich, каталожный номер P3655). #P7280) и 10 мг/мл ламинина (Corning, номер по каталогу 354232) перед использованием, а диссоциацию осуществляли посредством 30-минутной инкубации в буфере, состоящем из DMEM (ThermoFisher, номер по каталогу 11960- 044), содержащего 0,025% трипсин (Corning Life Sciences, каталог №25-053-CI) и 0,3% коллагеназы (Worthington Biochemical, каталог №LS004176).

Среда для выращивания для таких экспериментов состояла из DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, каталог № 26140-079), 2 мМ L-глутамина (Corning, каталог № 25-005-CI) и 40 нг/мл. фактор роста нервов (Fisher Scientific, каталог №13-257-019); 5 мМ Ara-C (Sigma-Aldrich) использовали для удаления ненейрональных клеток.

Для экспериментов, проведенных в Университете Вирджинии по изъятию NGF, клетки высевали на предметные стекла, покрытые 100 нг/мл PDL (Millipore Sigma) и 10 мг/мл ламинина (Invitrogen), и диссоциацию проводили через 20-мин. инкубация в буфере, состоящем из DMEM/F12, содержащего БСА (10 мг/мл, Sigma-Aldrich), коллагеназу типа 2 (4 мг/мл, Worthington Biochemical), дезоксирибонуклеазу 1 (Millipore Sigma) и гиалуронидазу (Sigma-Aldrich). Среда для выращивания для таких экспериментов состояла из DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen), 1 ед./мл пенициллина/стрептомицина (Invitrogen) и 45 нг/мл NGF (очищенного из слюнных желез); 10 мМ Ara-C использовали для удаления ненейрональных клеток.

Клеточные процедуры

Дифференцированные клетки LUHMES подвергали воздействию указанных концентраций {{0}}гидроксидофамина (6-OHDA; Sigma-Aldrich, № по каталогу 162957) или раствора носителя на пятый день пребывания в среде для дифференцировки. Исходные запасы 6- OHDA готовили в охлажденном PBS, содержащем 0,02% аскорбата (Sigma-Aldrich, номер по каталогу A5960), а аликвоты хранили в защищенных от света флаконах в атмосфере инертного газа при температуре 80 градусов. После 24 ч обработки клетки фиксировали инкубацией в PBS, содержащем 4% параформальдегида (PFA), в течение 25 мин при комнатной температуре.

Чтобы определить роль N-концевой киназы c-Jun (JNK) в дегенерации нейритов, вызванной окислительным стрессом, культуры предварительно обрабатывали в течение 1 часа 10 мМ SP600125 (Sigma-Aldrich, каталожный номер S5567) или раствором носителя. перед полной заменой среды на среду, содержащую 7,5 мМ 6-OHDA, 7,5 мМ 6-OHDA и 10 мМ SP600125 или растворы носителя. Исходные запасы SP600125 готовили путем растворения ингибитора в стерильном диметилсульфоксиде (ДМСО), а замороженные аликвоты хранили в защищенных от света флаконах, наполненных инертным газом при 20 градусах. Обработку проводили таким образом, чтобы клетки подвергались воздействию не более 0,1% ДМСО.

Первичные культуры симпатических нейронов обрабатывали DIV5. Для экспериментов, включающих дегенерацию нейритов, вызванную перекисью водорода, культуры подвергали воздействию 500 мМ перекиси водорода (Sigma-Aldrich, каталог #H1009-100ML) или раствора носителя, состоящего из стерильной воды (Cytiva, каталог #SH30529.02). на 24 часа.

В экспериментах, связанных с удалением NGF, культуры SCG либо заменяли среду питательной средой, либо подвергались лишению NGF. Культуры SCG, лишенные NGF, трижды промывали питательной средой, не содержащей NGF, а затем инкубировали в питательной среде, не содержащей NGF, в течение 80 часов без замены среды. После обработки клетки фиксировали инкубацией в 4% PFA в PBS в течение 30 мин с последующим удалением PFA промыванием PBS.

Окрашивание и флуоресцентная микроскопия

Для экспериментов с клетками LUHMES, а также экспериментов с участием симпатических нейронов, обработанных перекисью водорода, предметные стекла с восемью лунками, содержащие фиксированные клетки, были пермеабилизированы 0,1% тритоном X-100 в PBS и заблокированы для 1 час с 10% нормальной козьей сывороткой в ​​PBS, содержащем 0,1% тритона X-100. Затем слайды инкубировали с первичным антителом, специфичным к тубулину b I (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) в блокирующем растворе при 4 градусах в течение ночи. Затем предметные стекла промывали PBS, инкубировали со вторичным антителом, связанным с Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) в течение 90 минут при комнатной температуре и подвергали дополнительным промывкам.

Для экспериментов по окрашиванию тирозингидроксилазой (TH) предметные стекла подвергали дополнительной инкубации в PBS, содержащем 10% нормальной сыворотки козы, 0,1% тритона X-100, антитела, специфичного к TH (Sigma- Олдрич, 1:400, AB152) при температуре 4 градуса ночью. Затем предметные стекла промывали PBS, инкубировали со вторичным антителом, связанным с Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889), и подвергали дополнительным промывкам PBS.

После завершения иммуномечения b III-тубулина или TH предметные стекла инкубировали с 5 мг/мл 49,69-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; каталог № D9542) в PBS в течение 5 минут. Затем предметные стекла промывали PBS и покровные стекла монтировали с использованием среды для монтажа Fluoromount G (Southern Biotech, каталог № 0100-01).

Для экспериментов с участием симпатических нейронов, подвергшихся изъятию NGF, предметные стекла блокировали в течение 1 часа путем инкубации при комнатной температуре в буфере, состоящем из 5% нормальной сыворотки козы (Life Technologies) и 0.0005%. Тритон X-100 в PBS с последующей инкубацией в растворе первичных антител, содержащем мышиный антимышиный Tuj1 (1:1000, Covance), в течение ночи при 4 градусах. Затем предметные стекла промывали PBS, инкубировали в течение 1 часа с козьим антимышиным IgG Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) и 0,1 мг/мл Hoechst 33342 (Invitrogen) в блокирующем буфере, подвергали дополнительным промывкам PBS и оставляли на ночь. сушить. Слайды монтировали с помощью Fluoromount-G (Southern Biotech, каталог №0100-01) и хранили при комнатной температуре.

Слайды, содержащие клетки LUHMES, визуализировали с помощью объектива системы инвертированного микроскопа Nikon Eclipse II Ti-U с 4-канальным светодиодным источником света Lumencor Mira. 1280 1024-Изображения в пикселях были сняты с помощью ПЗС-камеры Nikon DSQi1Mc с разрешением 5 МП и NIS Elements 3.22.15 (сборка 738). За исключением случаев, когда указано иное, все фазово-контрастные изображения были получены с использованием таких настроек интенсивности света и времени экспозиции, которые обеспечивали среднюю интенсивность фона 165 в 8-битных изображениях.

Чтобы уменьшить затенение фона или другие несоответствия, перед каждым сеансом микроскопии снималось изображение пустой лунки и использовалось для коррекции фона во время визуализации клеток LUHMES. Слайды, содержащие симпатические нейроны, культивированные в Университете Восточного Кентукки или Университете Вирджинии, визуализировали с использованием микроскопической системы Zeiss LSM 800 или микроскопической системы Zeiss LSM 980 соответственно. Изображения были получены при увеличении 20 и разрешении 1024 1024 с использованием программного обеспечения Zen (Carl Zeiss Micrography).

Анализ жизнеспособности клеток

Дифференцированные культуры клеток LUHMES создавали на предметных стеклах с восемью лунками Lab Tek II, которые были покрыты, как указано, различными субстратами. Смену среды на 50% осуществляли каждые 48 часов, а клетки фиксировали 4% PFA в PBS на шестой день дифференцировки. Слайды, содержащие фиксированные клетки, подвергали окрашиванию DAPI, а изображения окрашивания ядер получали с помощью системы инвертированного микроскопа Nikon Eclipse II Ti-U и ПЗС-камеры Nikon DS-Fi1 5 MP.

Слепой исследователь оценивал клетки как здоровые или нездоровые на основании внешнего вида ядер. Клетки с уменьшенной площадью ядра или фрагментацией ядра считались нездоровыми. Количество здоровых клеток на изображение оценивали по меньшей мере для пяти полей зрения на каждое условие в каждом эксперименте.

DI-измерения

Традиционные измерения DI выполнялись с использованием пакета Fiji Is Just ImageJ (FIJI), содержащего ImageJ 1.52p, с помощью метода, включающего широко цитируемые параметры для анализа DI (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Лорето и др., 2020; Шин и Чо, 2020). Восьмибитные изображения дифференцированных клеток LUHMES с хорошо разделенными аксонными путями были подвергнуты бинаризации с использованием алгоритма бинаризации по умолчанию, с бинарными опциями, настроенными для создания изображения с черными клетками на переднем плане и белым фоном.

Инструмент рисования от руки использовался для ручного отслеживания всех областей изображения с телами клеток, и все черные пиксели в прослеживаемых областях были преобразованы в белые. Инструмент «Измерение» ImageJ был применен для измерения общей черной области бинаризованных изображений, содержащих исключительно нейриты. Затем был применен инструмент «Анализ частиц» с настройкой размера 20–10,000 пикселей и настройкой округлости 0,2–1,0 для обнаружения фрагментов нейритов. Суммарную площадь всех фрагментов нейритов затем делили на общую площадь черного цвета для расчета DI изображения.

Для экспериментов, связанных с оптимизацией размерных параметров для идентификации фрагментов нейритов, для всех измерений частиц использовались критерии округлости {{0}}.2–1.00. Плагин Particle Remover (версия 20{{10}}4/02/09), разработанный Уэйном Расбандом, был получен с https://imagej.nih.gov/. Там, где указано, применение плагина Particle Remover с использованием параметров размера 0–9 пикселей и параметров округлости 0,0–1,0 было выполнено для удаления небольших объектов, не являющихся нейритами, из бинаризованных изображений, полученных из фазово-контрастных микрофотографий.

Аналогично, параметры размера {{0}}–4 пикселей и параметры округлости 0–1,0 использовались для удаления мелких объектов из бинаризованных изображений, полученных из флуоресцентных микрофотографий, представляющих иммуноокрашивание b III-тубулина. Если не указано иное, перед анализом DI все фазово-контрастные изображения были подвергнуты усилению контрастности с помощью ImageJ для применения таблицы поиска (LUT) с минимумом 90 и максимумом 205.

Измерение искусственной фрагментации

Культуры, содержащие здоровые клетки LUHMES, фиксировали 4% PFA на шестой день дифференцировки и иммуномаркировали b III-тубулином. Используя объектив 20, 1280 1024-пиксельные микрофотографии с фазовым контрастом и флуоресцентные микрофотографии, каждая из которых изображает идентичные поля зрения, были получены из случайно выбранных областей. Всего было получено десять наборов изображений девяти отдельных культур.

ImageJ использовался для создания бинаризованных копий исходных фазоконтрастных и флуоресцентных микрофотографий, а также копий фазоконтрастных микрофотографий, которые были бинаризированы после усиления контраста с помощью LUT с минимумом 90 и максимумом 205. Для каждого набора Из изображений ослепленный исследователь идентифицировал небольшую 150 150-пиксельную область исходной фазоконтрастной микрофотографии, показывающую исключительно здоровые и неповрежденные нейриты.

Размер и координаты области затем сохранялись в менеджере областей интереса (ROI) ImageJ и использовались для выполнения измерений DI в аналогичных областях бинаризованных изображений из того же набора изображений. Измерения DI проводились традиционным методом с параметрами размера фрагмента 20 -10,000 пикселей. Поскольку все измеренные области содержали исключительно интактные нейроны, любые обнаруженные фрагменты считались искусственными фрагментами.

ЭНДИ Макро

Макрос ANDI был написан с использованием языка макросов ImageJ. Макрос представляет собой серию операций, которые позволяют пользователю выбирать пути для трех каталогов: один каталог содержит изображения нейронов, иммуномеченных для нейронального маркера, такого как b III-тубулин, второй каталог содержит соответствующие изображения, изображающие ядерное окрашивание, и третий каталог. предназначен для сохранения файлов результатов. Затем вычисляются площади фрагментов и общие площади нейритов изображений в выбранных каталогах с помощью серии операций ImageJ. Короче говоря, изображение, изображающее ядерную маркировку, открывается, подвергается усилению контраста и бинаризируется. Плагин удаления частиц используется для удаления небольших неядерных артефактов из бинаризованного изображения, при этом бинаризованное изображение подвергается серии расширений и эрозий.

Соответствующее изображение клеток, иммуномеченных b III-тубулином (или другим нейрональным маркером), открывают и подвергают контрастному усилению. Бинаризованное изображение, изображающее увеличенные ядра клеток, затем вычитается из изображения клеток, иммуномеченных b III-тубулином, таким образом генерируя изображение, показывающее исключительно нейриты. Затем изображение нейрита бинаризируется и подвергается удалению частиц между 0 и 4 пикселями. Площадь фрагмента нейрита рассчитывается с помощью алгоритма анализа частиц для измерения частиц с округлостью от 0,2 до 1,0 и размером от 5 до 10,0000 пикселей. Общая площадь нейритов рассчитывается путем применения инструмента «Измерение» для расчета общей черной площади. Изображение, изображающее бинаризованную область нейритов с выделенными фрагментами, сохраняется в каталоге, указанном пользователем, вместе с файлами .csv, сообщающими об измерениях фрагментированной площади нейритов и общих измерениях площади нейритов.

Помимо вышеупомянутых операций, в макрос включено несколько дополнительных операций для обеспечения простоты использования и ограничения ошибок пользователя. К ним относятся функции, которые удаляют информацию о масштабе из изображений и обеспечивают получение измерений в пикселях; настройте параметры цвета ImageJ и двоичные параметры для соответствующего вычитания и бинаризации изображения; убедитесь, что выбранные каталоги для изображений окрашивания b III-тубулина и окрашивания DAPI содержат одинаковое количество изображений; закройте ранее использованные изображения, чтобы сократить время обработки; четкие результаты предыдущих анализов перед проведением новых анализов; и предотвратить ошибки, связанные с созданием файла .ini в Windows 10.

Для экспериментов, включающих анализ симпатических нейронов, макрос ANDI был переработан и теперь включает операцию, которая представляет диалоговое окно, позволяющее пользователю контролировать количество раз, когда бинаризованные изображения ядер будут расширены. Версия ANDI с этой ревизией получила название ANDI v1.1. Изменение значения в диалоговом окне на большее число увеличивает размер удаления сомы, а изменение значения на меньшее число уменьшает размер удаления сомы. Значение по умолчанию — 12, что представляет собой количество расширений, используемых для всех экспериментов с участием клеток LUHMES. Значение 16 использовалось для удаления более крупных областей тела клетки во время анализа симпатических нейронов.

Макрос ANDI имеет открытый исходный код и доступен для бесплатного использования и модификации по следующему URL-адресу: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Точная работа ANDI была проверена на нескольких персональных компьютерах с операционной системой Windows 10. Набор изображений с клеточными культурами LUHMES, демонстрирующими различную степень дегенерации нейритов, также доступен по вышеупомянутому веб-адресу и может использоваться для исследования точного выполнения макроса на других типах компьютеров. Веб-адрес также обеспечивает доступ к протоколу, описывающему использование макроса.

Оценка времени

Чтобы оценить время, необходимое для ручного выполнения измерений DI, необходимо использовать фазоконтрастные микрофотографии, изображающие клетки LUHMES, обработанные раствором носителя, 2,5 мМ 6-OHDA, 5,0 мМ 6-OHDA или 7,5 мМ 6-OHDA подвергали оценке DI с использованием ранее разработанных методов (Kraemer et al., 2014). Каждое изображение подвергалось контрастному усилению и бинаризации. Затем был использован инструмент ImageJ, созданный вручную, для цифрового удаления всех изображенных тел клеток из бинаризованных изображений. Инструмент «Анализ частиц» использовался для измерения фрагментов с округлостью от 0.2 до 1,0 и размером от 20 до 10 000 пикселей, а инструмент «Измерение» использовался для определения общей площади нейритов.

Значения о площади фрагментированных нейритов и общей площади нейритов были перенесены в электронную таблицу в Microsoft Excel, а для расчета показателей DI использовалась математическая операция в Excel. После открытия изображения с помощью ImageJ измерялось время, необходимое для ручного выполнения каждой из этих процедур. Среднее время анализа было рассчитано на основе 36 изображений. Изображения были получены из девяти независимых препаратов клеточных культур, и анализ проводился с использованием одного изображения для каждого условия обработки из каждого препарата клеточной культуры. Для определения скорости измерений DI, выполняемых с помощью ANDI Macro, те же наборы изображений использовались для определения времени, необходимого для открытия макроса в ImageJ, запуска макроопераций, переноса данных в электронную таблицу Excel и расчета DI.

Статистика

Количественные сравнения представлены в виде прямоугольных диаграмм и диаграмм с усами, где средняя линия представляет собой медиану, прямоугольники простираются до 25-го и 75-го процентилей, а «усы» обозначают 5-й и 95-й процентили. Средние значения статистически сравнивались в GraphPad Prism 9.1.2 путем повторных измерений ANOVA с апостериорными сравнениями с использованием поправки Сидака. Нормальность количественных данных проверялась с помощью теста Шапиро-Уилка в IBM SPSS 26.

Когда предположение о нормальности нарушалось (рис. 1C, 3D), групповые сравнения проводились с помощью непараметрического теста Фридмана с тестом Данна, выполняемым для апостериорных сравнений. Корреляционный анализ изображается в виде диаграмм рассеяния и включает линии наилучшего соответствия. Такие отношения анализировались с использованием корреляций момента произведения Пирсона или r Спирмена, когда предположение о нормальности нарушалось. Нормальность остатков для корреляционного анализа оценивали путем визуального осмотра соответствующих графиков QQ.

Коэффициенты корреляции момента произведения Пирсона сравнивались друг с другом с использованием асимптотического z-теста Штайгера (Steiger, 1980; Lee and Preacher, 2013). Никакие выбросы не были исключены. Статистическую значимость принимали за р=0,05. Значения P округляются до четырех десятичных знаков и указываются по всему основному тексту. Для параметрического анализа также указаны размеры эффекта и 95% доверительные интервалы, при этом размеры эффекта описаны в основном тексте, а доверительные интервалы указаны в таблице 1.

Доступность данных

Дополнительные данные о настоящей статье будут предоставлены по обоснованному запросу.

Доступность кода

Код/программное обеспечение, описанные в статье, находятся в свободном доступе в Интернете по адресу https://github.com/kraemerb/kraemerlab. Код доступен как Расширенные данные 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com