Быстрое одновременное определение шести эффективных компонентов в Cistanche Tubulosa методом ближней инфракрасной спектроскопии

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Синьхун Ван, Сяогуан Ван и Юхай Го

Абстрактный:

Количественное определение нескольких эффективных компонентов в данном растении обычно требует очень большого количества подлинных натуральных продуктов. В этом исследовании мы предложили быстрый и неразрушающий метод одновременного определения эхинакозида, вербаскозида, маннита, сахарозы, глюкозы и фруктозы вЦистанхе трубчатаяметодом ближней инфракрасной спектроскопии (NIRS). Спектроскопия диффузного отражения в ближней инфракрасной области (DRS) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) были проведены на 116 партиях образцов Cistanche tubulosa. Данные DRS были обработаны с использованием методов стандартного нормального разнообразия (SNV) и коррекции мультипликативного рассеяния (MSC). Частичная регрессия методом наименьших квадратов (PLSR) использовалась для построения калибровочных моделей для представляющих интерес компонентов Cistanche tubulosa. Затем все модели оценивались путем расчета среднеквадратичной ошибки калибровки (RMSEC), коэффициента корреляции калибровки (r). Было определено, что значения r для всех шести калибровочных моделей превышают 0,94, что позволяет предположить, что каждая модель надежна. Следовательно, количественные NIR-модели, представленные в этом исследовании, могут быть квалифицированы для точного количественного определения содержания шести лекарственных компонентов вЦистанхе трубчатая.

Ключевые слова: Cistanche tubulosa; высокоэффективная жидкостная хроматография; ближняя инфракрасная спектроскопия; частичные наименьшие квадраты

Введение

Цистанхе(Hoffmg. Et Link) — многолетний фанерогамный род растений семейства Orobanchaceae. Большинство видов, принадлежащих к роду Cistanche, на протяжении тысячелетий использовались в качестве лекарственных растений в Китае; иметь репутацию превосходного тоника; и известны как «Женьшень пустынь» [1,2].Цистанхе трубчатаяявляется облигатным паразитом корней многолетнего растения Tamarix Chinensis. Он был задокументирован в Китайской фармакопее как подлинный источник Cistanches Herba (китайское название: Roucongrong) из издания 2005 года [3]. Современные фармакологические исследования видов Cistanche были начаты в 1980-х годах [4]. Фармакологические исследования показали, что экстракты растений цистанхе обладают широким спектром действия, таким как лечение почечной недостаточности и старческих запоров, повышение способности к обучению и запоминанию, против болезни Альцгеймера, повышение иммунитета, против старения, против усталости и др. [1,5–7]. За последние три десятилетия всесторонние и систематические фармакологические исследования были объединены с фитохимическими исследованиями, чтобы осветить материальную основу полезных эффектов корней растений цистанхе. Эти обзоры показывают, что фенилэтаноидные гликозиды (PhG) были основными эффективными компонентами растений цистанхе, играя ключевую роль в лечении почечной недостаточности, импотенции [8], омолаживающих [9] и против болезни Альцгеймера [10]. Содержание двух PhG (эхинакозида и вербаскозида) требовалось в Китайской фармакопее. Между тем, углеводы, такие как маннит, сахароза, глюкоза и фруктоза в растениях цистанхе, обладают слабительной функцией, а кластеры углеводов растений цистанхе использовались для лечения запоров [11].

Дикие ресурсыЦистанхе трубчатаяв основном распространены в районе, окружающем пустыню Такла-Макан в южной части Синьцзянского автономного района Китая. Подобно многим другим видам, используемым в качестве традиционных китайских лекарств (ТКМ), C. tubulosa имеет большую экономическую ценность и почти исчезла в дикой среде обитания из-за чрезмерного сбора. Выращивание C. tubulosa началось в 1990-х годах в Китае, чтобы обеспечить поставку сырья для Cistanches Herba, а также защитить ресурсы диких растений. По состоянию на 2017 г. в префектуре Хотан в Синьцзяне насчитывается около 13 тыс. га культивируемых C. Tubulosa [12,13]. Достижения в технологии посадки требуют расширения возделывания, а также повышения качества урожая.Цистанхе трубчатая.

Основная цель выращиванияЦистанхе трубчатаясостоит в том, чтобы производить Cistanches Herba, богатые этими эффективными компонентами. Однако на содержание эффективных компонентов цистанхов трав, таких как ФГ и олигосахариды, в процессе производства могут существенно влиять многие факторы [12,13]. Следует изучить систему определения качества C. Tubulosa в режиме реального времени. Следовательно, необходимо разработать высокопроизводительный метод, чтобы полностью выполнить требование анализа большого количества образцов за короткий период времени. Традиционно определение этих основных эффективных компонентов, таких как PhG и углеводы, в C. Tubulosa обычно выполнялось с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [14,15]. Несмотря на то, что он точен и надежен, сбор и обработка данных отнимает много времени и сил. Кроме того, много времени и усилий требуется для подготовки проб, которая обычно включает измельчение, экстракцию и фильтрацию для анализов ВЭЖХ. Поэтому для получения относительно большого объема данных необходим четкий принцип и простой в эксплуатации инструмент. К счастью, ближняя инфракрасная спектроскопия (NIRS) широко используется для оценки сельскохозяйственной продукции [16], продуктов питания [17], медицинских образцов [18] и фармацевтических продуктов [19], поскольку она является быстрой и неразрушающей. Следовательно, NIRS может точно соответствовать требованиям для эффективных измерений ТКМ, и неудивительно, что NIRS применялась для качественной идентификации [20, 21] и количественного определения соединений [22] в ТКМ.

В этом исследовании содержание шести эффективных компонентов, включая эхинакозид, вербаскозид, маннит, сахарозу, глюкозу и фруктозу, в 116 партиях образцов C. Tubulosa, собранных в префектуре Хотан в Синьцзяне в 2013–2015 гг., впервые определяли с помощью ВЭЖХ. После этого калибровочные модели этих шести компонентов были созданы методом частичной регрессии наименьших квадратов (PLSR). Затем эти модели были проверены с помощью коэффициента корреляции и ошибок прогнозирования в наборах калибровки. Результаты показали, что разработанный метод может быть использован в качестве надежного метода количественного анализа C. Tubulosa.

Результат

ВЭЖХ-анализ

Содержание эхинакозида и вербаскозида определяли хорошо известным методом ВЭЖХ-УФ в литературе [3,23], а четыре углевода (маннит, сахароза, глюкоза и фруктоза) определяли четко определенным методом ВЭЖХ-ELSD в литературе [24] для всех 116 образцов. Подготовка проб и методы определения описаны в разделах 3.1 и 3.3. На рис. 1 представлены характеристические хроматограммы смешанных стандартов. Можно видеть, что все шесть эффективных компонентов были разделены по базовой линии и, следовательно, могут быть определены количественно. Метод ВЭЖХ был валидирован перед тестированием образца. Основные результаты метода ВЭЖХ приведены в таблице 1. В результатах показаны благоприятная линейная зависимость (r=0,9998) и выход (98,5%) метода определения эхинакозида, тот же результат, что и во всех пять компонентов. Следовательно, можно точно определить содержание шести эффективных компонентов. Все определенные диапазоны содержания приведены в таблице 1.

БИК-анализ

На рис. 2 представлены NIR-спектры (4000–10,000 см–1) образцов C. Tubulosa. Во всех образцах появились значительные пики поглощения от 4000 см-1 до 7500 см-1, а небольшие колебания появились от 7500 см-1 до 10000 см-1. Дрейф базовой линии спектров NIR произошел из-за того, что на образец легко повлияли такие факторы, как размер и цвет частиц (рис. 2А). Предварительная математическая обработка спектров использовалась для уменьшения влияния ненужной информации до некоторой степени. Предварительная математическая обработка включала первую деривацию (1-ю деривацию), вторую деривацию (2-ю деривацию), стандартную нормальную разновидность (SNV) и коррекцию мультипликативного рассеяния (MSC). На рисунке 2B показана вторая производная NIR-спектров C. Tubulosa, и очевидны значительные вариации, которые произошли в трех областях: 4000–4500 см–1, 5000–5500 см–1 и 7000–7500 см–1. .

Создание моделей количественной калибровки

Частичная регрессия наименьших квадратов (PLSR) является классическим методом моделирования и широко применяется в количественных моделях из-за высокого качества результатов. К преимуществам PLSR относятся его хорошие возможности прогнозирования и относительная простота. PLSR также широко применялся при создании моделей количественной калибровки ТКМ [25]. На основе предварительно обработанных спектров NIR и модели количественного анализа NIR для шести эффективных компонентов в C. Tubulosa была создана с использованием метода PLSR с данными анализа ВЭЖХ в качестве истинных значений. 116 образцов были случайным образом разделены на калибровочные и проверочные наборы в соотношении 3:1. Наиболее подходящие условия для калибровки были выбраны по низкому значению RMSEC и высокому коэффициенту корреляции.

Выбор диапазона волн для калибровочных моделей

Выбор подходящего диапазона волн был важным шагом для построения калибровочных моделей. В этом исследовании сравнивались интервальные спектры NIR 4000–7500 см-1 (рекомендовано программным обеспечением для анализа TQ) и 4000–10 000 см-1. Было замечено, что этот диапазон не подходит для калибровки в интервале между 4000 см-1 и 7500 см-1 из Таблицы 2. Следовательно, в текущем исследовании спектральные интервалы для шести химических составляющих были все они выбраны из интервала от 4000 до 10 000 см-1 путем сравнения характеристик RMSEC и коэффициента корреляции.

Выбор оптимального количества факторов для калибровочных моделей

PLSR объясняет максимальное количество изменчивости данных уменьшением размерности данных спектров путем расчета факторов. Проблема «недооснащенности» возникла из-за недостаточности информации, вызванной ограниченным числом факторов; однако выбор факторов, превышающих оптимальные значения, введенные в модель, приведет к проблеме «переобучения». Либо «недостаточность», либо «переоснащение» снизят прогностическую силу установленных моделей [22]. На рис. 3 показана связь между RMSECV и факторами для всех шести соединений. Поэтому мы выбрали те факторы, которые соответствуют самым низким значениям RMSECV. Оптимальный выбор факторов для калибровочных моделей приведен в таблице 3.

Выбор спектральной предварительной обработки для калибровочных моделей

Другим наиболее важным фактором, влияющим на модели калибровки, является предварительная спектральная обработка, направленная на снижение влияния рассеяния и дрейфа базовой линии, улучшение отношения сигнал/шум и устранение нерегулярных вариаций. Методы мультипликативной коррекции рассеяния (MSC) и стандартной нормальной вариации (SNV) использовались для исключения влияния обычного рассеяния излучения. Для решения проблемы дрейфа базовой линии сравнили спектры 1-й и 2-й производных и выбрали 2-ю производную [26]. Для достижения желаемого эффекта мы сгладили спектры с помощью алгоритма фильтра Савицкого-Голея (SG) перед выводом, чтобы предотвратить усиление шума. В таблице 3 представлена ​​информация о спектральной предварительной обработке и ее результатах для калибровочных моделей.

Оценка установленных моделей

Хорошая калибровочная модель БИКС должна иметь низкие значения RMSEC и RMSEP, а также высокий коэффициент корреляции (r) и небольшие различия между RMSEC и RMSEP [27–29]. Калибровочные модели шести выбранных соединений были созданы в соответствии с процедурами, упомянутыми выше (таблица 3). Значения RMSEC и r для калибровочного набора эхинакозида составили 27,6 и 0,9808 соответственно. Параметры эффективности других моделей химических соединений перечислены в таблице 3, из которой можно сделать вывод, что установленные модели дают удовлетворительные результаты прогнозирования и могут использоваться для экспресс-количественного анализа C. Tubulosa. Диаграммы рассеяния шести химических соединений показаны на рис. 4, чтобы сделать калибровочные модели более наглядными и наблюдаемыми визуально. Как показано на рисунке 4, между прогнозируемыми и измеренными значениями произошли незначительные различия, поскольку большинство точек было распределено вокруг регрессионной кривой с уравнением y=x. Таким образом, на рисунке 4 наблюдались отличные прогностические характеристики.

Материалы и методы

Базовые приготовления

С 2013 по 2015 год в префектуре Хотан автономного района Синьцзян было собрано 116 образцов C. Tubulosa. Все образцы были культивированы, но собраны на разных стадиях роста. Масса образцов в свежем виде колебалась от 20 до 1000 г. После сушки на солнце высушенные образцы измельчали ​​и просеивали через 60-сетчатое сито [3,23].

Сбор данных NIR-спектроскопии

NIR-спектры образцов были получены с интервалом 8 см-1 в спектральной области 4000–10 000 см-1 с помощью системы Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Мэдисон, США). Висконсин, США), оснащенный ручным оптоволоконным отражательным адаптером. Каждый спектр был получен путем усреднения 64 сканов. Всем образцам давали уравновеситься до комнатной температуры (25°С) перед сканированием NIR-спектров, чтобы гарантировать, что образцы анализировались при одной и той же температуре. Влажность в лаборатории поддерживалась на уровне окружающей среды.

Сбор данных ВЭЖХ

Подготовка к экстракции

Один грамм порошка C. Tubulosa экстрагировали 50 мл 50-процентного метанола в конической колбе с обработкой ультразвуком (500 Вт, 40 кГц) в течение 30 мин. Экстракт хранили при 4 ◦C. Супернатант экстракта фильтровали для получения образца для анализа ВЭЖХ [3,23].

Одновременное определение эхинакозида и вербаскозида с помощью УФ-ВЭЖХ

Жидкостно-хроматографический анализ проводили на системе УВЭЖХ Shimadzu (Shimadzu, Киото, Япония), состоящей из двух блоков подачи растворителя LC-20ADXR, насоса LC-20AD, пробоотборника SIL-20ACXRauto. , термостат колонки CTO-20AC, детектор DAD SPD-M20A, дегазатор DGU-20A3R и контроллер ICBM-20A.

Колонку Grace Prevail Carbohydrate ES (15{6}} × 2,1 мм, 2,7 мм), используемую для хроматографического разделения, поддерживали при 35°C. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила (А) и 0,1% водного раствора муравьиной кислоты (В) и подавалась в соответствии со следующей программой градиента: 0–7 мин, линейный градиент 10–20 процент А; 7–15 мин, 20% А; 15–20 мин — линейный градиент 20–10% А. Скорость сгущения подвижной фазы 0,4 мл/мин. УФ-мониторинг проводили при 330 нм.

Одновременное определение маннита, сахарозы, глюкозы и фруктозы с помощью HPLC-ELSD

ВЭЖХ выполняли на системе ЖХ Agilent серии 1100 (Пало-Альто, Калифорния, США), состоящей из дегазатора aG1322A, четырехканального насоса G1311A, автоматического пробоотборника G1311A, регулятора температуры колонки G1316A и детектора DAD G1315B.

Колонку Sigma Prevail Carbohydrate ES (4,6 × 250 мм, 5 мкм) использовали для хроматографического разделения и поддерживали при температуре колонки 25 ◦C. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила и воды (77:23, объем/объем) и подавалась изократно со скоростью 0,7 мл/мин. Сток контролировали с помощью испарительного детектора светорассеяния (ELSD) с параметрами по умолчанию [23,24].

Обработка данных

TQ Analyst (версия 8.0, Thermo Scientific, Мэдисон, Висконсин, США) использовался для разделения калибровочных и проверочных наборов, математической предварительной обработки спектров, создания калибровочных моделей и других вычислений. Для изготовления фигурок использовался Origin (версия 9.1).

Выводы

Благодарности: эта работа была поддержана Национальным проектом планирования науки и технологий Китая (2015BAD29B00-04).

Вклад автора: Xinhong Wang задумал и спроектировал эксперименты. Xinhong Wang и Xiaoguang Wang выполнили эксперименты. Синьхун Ван и Юхай Го написали статью.

Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

использованная литература

1. Цзян, Ю .; Ту, П.Ф. Анализ химических компонентов видов цистанхе. Ж. Хроматогр. 2009, 1216, 1970–1979. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

2. Сюй, Р .; Чен, Дж.; Чен, С.-Л.; Лю, Т.-Н.; Чжу, В.-К.; Xu, J. Cistanche Deserticola Ma, выращиваемая как новая культура в Китае. Жене. Ресурс. Кроп Эвол. 2008, 56, 137–142. [Перекрестная ссылка]

3. Редактирование Комитета Китайской фармакопеи. Китайская фармакопея, 2005-е изд.; Chemical Industrial Press: Пекин, Китай, 2005 г.; Том 1, с. 90.

4. Кобаяши, Х .; Комацу, Дж. Компоненты цистанховой травы (1). Якугаку Дзаси 1983, 103, 508–511. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

5. Песня, Ж; Лей, Л.; Ту, П.Ф. Успехи в исследовании фармакологической активности растений цистанхе хаффинг. Эт ссылку. Подбородок. традиц. Трава. Наркотики 2003, 34, 473–476.

6. Сюн, К.; Кадота, С .; Тани, Т .; Намба, Т. Антиоксидантное действие фенилэтаноидов из Cistanche Deserticola. биол. фарм. Бык. 1996, 19, 1580–1585. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

7. Сюань, GD; Liu, CQ Исследование влияния фенилэтаноидных гликозидов (PEG) Cistanche Deserticola на замедление старения у старых мышей, вызванное D-галактозой. Дж. Чин. Мед. Матер. 2008, 31, 1385–1388.

8. Сато, Т .; Козима, С .; Кобаяши, К.; Кобаяши, Х. Фармакологические исследования Cistanchis Herba. I. Влияние компонентов Cistanchis Herba на половое поведение и обучаемость у мышей с хроническим стрессом. Якугаку Засси 1986, 105, 1131–1144. [Перекрестная ссылка]

9. Шен, CY; Цзян, JG; Ян, Л .; Ван, Д.У.; Чжу, В. Антивозрастные активные ингредиенты трав и нутрицевтиков, используемых в традиционной китайской медицине: фармакологические механизмы и значение для открытия лекарств. бр. Дж. Фармакол. 2016, 11, 1395–1425. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

10. Ли, Н .; Ван, Дж.; Ма, Дж.; Гу, З .; Цзян, К.; Ю, Л.; Fu, X. Нейропротекторные эффекты терапии Cistanches Herba у пациентов с умеренной болезнью Альцгеймера. Эвид. Дополнение на основе. Альтерн. Мед. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]

11. Гао, JY; Цзян, Ю .; Дай, Ф .; Хан, З.Л.; Лю, HY; Бао, З .; Чжан, ТМ; Tu, PF Исследование слабительных компонентов в Cistanche Deserticola YC Ma. Мод. Подбородок. Мед. 2015, 17, 307–310.

12. Ту, ПФ; Чен, QL; Цзян, Ю .; Го, YH; Ян, Техас; Ван, XY; Айеркан, М .; Ли, XB; Ду, Ю.; Нан, ЗД; и другие. Методы культивирования Cistanche tubulosa и его хозяина Tamarix spp. Мод. Подбородок. Мед. 2015, 17, 349–358.

13. Ту, ПФ; Цзян, Ю .; Го, YH; Тянь, ЮЗ; Ли, XB; Ван, XY; Вэй, Дж .; Чен, QL; Айеркан, М. Развитие экологической индустрии цистанховых трав для развития экологической цивилизации в западном пустынном регионе. Мод. Подбородок. Мед. 2015, 17, 297–301.

14. Лу, ДЮ; Чжан, JY; Ян, З.Я.; Лю, ХМ; Ли, С .; Ву, Б.Дж.; Ма, З. Г. Количественный анализ цистанховых трав с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с детектированием на диодной матрице и масс-спектрометрии высокого разрешения в сочетании с хемометрическими методами. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef] [PubMed]Molecules 2017, 22, 843 9 из 9

15. Цзян, Ю .; Ли, СП; Ван, Ю. Т.; Чен, XJ; Ту, П.Ф. Дифференциация травянистых цистанхов по отпечаткам пальцев с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектированием на диодной матрице и масс-спектрометрии. Ж. Хроматогр. 2009, 1216, 2156–2162. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

    ---