Переход на микропроцессы при лептоспирозе и заболевании почек Ⅱ
May 09, 2024
4. Реакция иммунитета хозяина на Leptospira spp.
Основной путь лептоспир — прямое проникновение лептоспир через слизистые оболочки или открытые участки кожи через кровь, ткани, мочу или загрязненную воду, которое распространяется по системному кровообращению и диссеминирует в несколько органов, напримерпечень, легкие и проксимальные канальцынефрон в почках, где он может размножаться и сохраняться в течение месяца [51]. В начальной фазе зараженияврожденный иммунный ответиграет фундаментальную роль в качестве первой линии защиты при лептоспирозе, влияя на реакциюрецепторы распознавания образов, фагоцитоз макрофагов, индукция внеклеточногонакопление нейтрофилов, ивмешательство системы комплемента [52].
иммунная реакцияу человека играет важную роль вразвитие клинических признаков, как и факторы вирулентности некоторых патогенных штаммов. В большинстве случаев лептоспироз человека протекает бессимптомно или в легкой форме, и только в 10% случаев развиваются тяжелые формы с полиорганной недостаточностью и повышенным уровнем смертности, связанной с лептоспирозом.цитокиновый шторми статус иммунопаралича. Патогенные виды стимулируют гуморальный ответ в фазе бактериемии, хотя последующее поведениеиммунная реакциянеясно. В исследованиях пациентов с множественными клиническими проявлениями лептоспироза тяжесть клинической картины была связана с различными уровнями сывороточных цитокинов, таких как TNF-, IL-10 и IL-6 [53], но этот вывод остается спорным [54]. Эти условия привели к повышенному интересу к пониманию иммунного ответа в целом и биологических событий, которые происходят во время инфекции.
4.1. Лептоспира и система комплемента
Протеолитическая активность лептоспиральных протеаз против внеклеточного матрикса позволяет инфекции проникнуть в кровоток. Система комплемента в системе кровообращения является одним из основных механизмов врожденного иммунного ответа на патогенные лептоспиры. Однако Leptospira разработала стратегии, позволяющие избежать атаки системы комплемента путем связывания белков с молекулами комплемента и производства протеаз, таких как термолизин, термостабильный фермент нейтральной металлопротеиназы, который влияет на белковую цепь C3. Патогенные штаммы связывают фактор H (FH), белок 1, родственный фактору H комплемента (FHR-1), белок 1, подобный фактору H (FHL-1) и белок, связывающий C4b (C4BP), все из которых ответственны за ингибирование системы комплемента [55]. Существуют три основные стратегии уклонения от комплемента патогенными лептоспирами [55,56] посредством вмешательства регуляторов комплемента хозяина, протеазы хозяина и бактериальной протеазы. В качестве регуляторов комплемента Leptospira использует фактор H (FH; регулятор альтернативного пути комплемента) и белок, связывающий C4 (C4BP; регулятор классического и лектинового путей комплемента), чтобы ускорить распад конвертаз C3, а также действовать как кофакторы для фактора I. для расщепления C3b и C4b [57,58]. Лептоспиральный белок (LcpA) вместе с витронектином (Vn; регулятор терминального пути) связывает C9 и ингибирует его полимеризацию [59], тем самым потенциально блокируя образование мембраноактивирующего комплекса (MAC) [60]. Кроме того, патогенные Leptospira связывают несколько протеаз хозяина, таких как активатор плазминогена урокиназного типа (uPA), которые индуцируют активный плазмин [61] (сериновая протеаза) для переваривания C3b, C4b и C5 на поверхности Leptospira [62]. Более того, металлопротеазы и термолизин, эндогенная протеаза Leptospira, могут расщеплять и инактивировать несколько белков комплемента (C2, C3, C4 и фактор B) [60]. Сочетание регуляторов комплемента хозяина и патогенной лептоспиры облегчает бактериальную колонизацию в органах-мишенях хозяина [63].
4.2. Лептоспиры и нейтрофилы
Во время инфекции патогенные виды Leptospira вызывают сильную активацию нейтрофилов и провоспалительную реакцию. Нейтрофилы важны для контроля микроорганизмов, но они также способствуют повреждению тканей хозяина. Было продемонстрировано, что низкие уровни внеклеточного накопления нейтрофилов из-за низкой активности нейтрофилов в кровообращении увеличивают лептоспиремию, что указывает на то, что внутрисосудистое образование рекрутов нейтрофилов может иметь решающее значение для предотвращения раннего распространения патогенных лептоспир [64].
4.3. Лептоспиры и макрофаги
На начальной стадии заражения Leptospira макрофаги играют важную роль в элиминации спирохет. Этот эффекторный механизм вместе с эффективным цитокиновым ответом связан с фагоцитарным контролем и распространением инфекции, хотя Leptospira spp. Было показано, что индуцирует апоптоз в макрофагах по пути Fas/FasL-каспаза-8/-3 и облегчает их выживание и пролиферацию в организме хозяина за счет высвобождения митохондриального фактора, индуцирующего апоптоз и эндонуклеазу у инфицированных макрофаги [65]. Недавние исследования были проведены на микротранскриптоме макрофагов, инфицированных Leptospira, для определения эпигенетических механизмов, таких как посттранскрипционная регуляция с помощью РНК. Макрофаги, инфицированные Leptospira, показали, что микроРНК (миРНК) регулируются при заражении спирохетами, демонстрируя, что эта регуляция жизненно важна в ответе этих клеток иммунной системы на инфекцию Leptospira [66]. В макрофагах человека активация воспаления, опосредованная активными формами кислорода и лизосомальным катепсином B, генерируемая инфекцией Leptospira, имеет заметные уровни NLRP3 и IL-18, что способствует выработке IL-1 и приводит к высокому уровню возможность фагоцитоза и быстрое моделирование некоторых цитокинов коррелируют с устойчивостью к лептоспирозу [67].
4.4. Гуморальный ответ на лептоспиру
Специфический гуморальный ответ против Leptospira характеризуется выработкой антител IgM и IgG на третий день появления симптомов. Кроме того, сообщалось о продукции IgA с первого дня до девятого месяца после заражения; Фактически, повышение уровня IgM использовалось как альтернативный метод ранней диагностики лептоспироза [68]. Влияние гуморального ответа у человека, больного лептоспирозом, позволяет поставить серологический диагноз после естественного заражения [69]. Важнейшим аспектом гуморального ответа при инфекции Leptospira может быть образование защитных антител. Доступные в настоящее время вакцины против лептоспироза состоят из полных клеточных препаратов и имеют ограничения, такие как низкая эффективность, множественные побочные эффекты, низкая генерация иммунной памяти и отсутствие перекрестной защиты от различий сероваров. Таким образом, для борьбы с болезнями необходима разработка новых вакцин, и в настоящее время проводятся исследования по созданию вакцин на основе генетической иммунизации [70]. OMP лептоспир считаются антигенами с лучшей иммуногенностью по отношению к B-лимфоцитам, которые включают структурные эпитопы OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} и LipL41263-282 [71]. Эти эпитопы являются многообещающими кандидатами для разработки универсальной вакцины.
4.5. Адаптивный иммунный ответ на лептоспиру: Т-клетки и цитокины
Патогенные виды Leptospira вызывают иммунный ответ, опосредованный Т- и В-лимфоцитами, сопровождающийся экспрессией цитокинов, что может быть связано с гравитационными диаграммами. Активация Т-клеток во время заражения Leptospira инициирует воспалительную реакцию, главным образом за счет продукции цитокинов. Это имеет решающее значение для ранней ликвидации инфекции, но неконтролируемая выработка провоспалительных цитокинов может также привести к перепроизводству цитокинов с последующим состоянием иммунопаралича, что может привести к сепсису и полиорганной недостаточности. Т-лимфоциты продуцируют IL-1, IL-6, IL-12, интерферон (IFN)- и TNF-, которые действуют как хемоаттрактанты, рекрутируя лейкоциты в месте инфекции. Интересно, что in ex vivo наивные δ-Т-клетки пролиферировали в культурах мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), стимулированных антигенами Leptospira, наряду с продуцированием как IL-17, так и IFN [72]. Более того, в то время как мыши дикого типа, инфицированные лептоспирозом, демонстрировали более высокие уровни большого количества цитокинов, включая IL-4, IL-10 и IL-13, по сравнению с неинфицированными мышами, хроническая мышиная хроническая болезнь, вызванная лептоспирозом, нефрит (мыши Daf1-/-) показали более высокую экспрессию гладкомышечного актина, IL-10, IL-13, но не было различий между IL-12 и IL{{21} } уровни [73]. Таким образом, Daf1 и IL-17 могут играть решающую защитную роль в прогрессировании ХБП, являясь связующим звеном между индуцированной Leptospira ХБП у мышей и фиброзом почек [72,73]. Однако гипотеза об избирательном цитокиновом ответе при прогрессировании заболевания при лептоспирозе человека до сих пор остается неубедительной. У пациентов с тяжелым лептоспирозом и поражением легких были получены повышенные уровни IL-6, CXCL8 и IL-10 по сравнению с пациентами с легким лептоспирозом [53]. Столь высокие концентрации цитокинов у больных лептоспирозом подчеркивают их ключевую роль в развитии тяжелого лептоспироза.
У пациентов с тяжелой инфекцией обнаруживаются CD4+ Т-лимфоциты с провоспалительным профилем и продуценты IL-2 и IFN-, тогда как CD4+ CD25высокие продуценты IL-10 почти отсутствуют. Регуляция иммунного ответа, опосредованного Т-лимфоцитами, по-видимому, не предотвращает повреждение тканей, вызванное воспалительной реакцией на Leptospira. В CD4+ Т-лимфоцитах человека с тяжелой формой лептоспироза продукция TNF- и других провоспалительных цитокинов выше, чем у людей с легкой формой заболевания, что указывает на возможность использования этих цитокинов в качестве маркеров лептоспироза. тяжести в иммунологической фазе инфекции [74]. Производство IL-10 связано с риском смерти людей от лептоспироза; однако исследование, проведенное на подвергшихся воздействию и бессимптомных людях, связало выработку этого цитокина с контролем воспалительной реакции и выживаемостью [74]. При инфицировании Leptospira медиаторы воспаления и действие некоторых лейкоцитарных клеток, таких как Т-лимфоциты, у резистентных лиц быстро регулируются, в отличие от того, что происходит у лиц с тяжелыми формами лептоспироза [75].
Подводя итог, можно сказать, что иммунный ответ на инфекцию Leptospira не до конца понятен из-за клинического поведения пациентов с лептоспирозом, которые взаимодействуют с различными факторами вирулентности бактериального генома, что придает Leptospira серьезную патогенную способность.
5. Клинические проявления
Клинические проявления лептоспироза разнообразны: от легких неспецифических симптомов, таких как гриппоподобные симптомы (лихорадка, миалгия и головная боль), до тяжелых симптомов с терминальной стадией поражения органов (например, ОПП, острая печеночная недостаточность). и геморрагический диатез, также известный как синдром Вейля), острое кровохарканье в результате легочного кровотечения, острая спутанность сознания в результате асептического менингоэнцефалита и острая сердечная недостаточность в результате острого или подострого миокардита [7]. Соответственно, три индикатора подозрения на лептоспирозную инфекцию включают: (i)острое лихорадочное заболевание, (ii) желтуха и (iii)острое повреждение почек[12]. Предикторами тяжелой формы лептоспироза являются тяжелая миалгия в начале заболевания, сильная склонность к кровотечениям и выраженная желтуха. Интересно, что наличие уже существующиххроническая болезнь почек(маленький размер почек) или увеличенные, застойные почки с анурией связаны с наихудшим исходом [12]. Таким образом, пациентов с заболеванием почек, связанным с лептоспирозом, следует лечить незамедлительно.
6. Диагностика
6.1. Клинический диагноз
Диагноз лептоспироза основывается на анамнезе заражения, факторах риска и клинических проявлениях. Высокий индекс подозрительности может избежать последующего повреждения органов. Однако симптомы лептоспироза часто ошибочно принимают за другие причины острого лихорадочного синдрома, такие как инфекция денге, малярия, гепатит и активное аутоиммунное заболевание. Отсутствие патогномоничных признаков лептоспироза означает, что диагноз ориентировочно основывается на оценке лихорадки и миалгий у больных из эндемичного региона. По этой причине необходима лабораторная диагностика лептоспироза.
6.2. Лабораторная диагностика
Лептоспироз трудно диагностировать в лабораторных условиях, особенно в острой фазе. Его можно выполнить путем непосредственной идентификации спирохет или их компонентов в жидкостях или тканях организма, выделения лептоспир в культуре или обнаружения определенных антител на различных клинических этапах. Лептоспироз трудно отличить от таких заболеваний, как малярия, лихорадка денге, риккетсии, грипп, гепатит и желтая лихорадка из-за его неясной клинической картины. В результате для подтверждения диагноза необходимы лабораторные анализы. В основе этих тестов (ДНК) лежит обнаружение антител против лептоспир, самих лептоспир или их дезоксирибонуклеиновой кислоты. Современная лабораторная диагностика включает как прямую идентификацию (обнаружение спирохет Leptospira или ДНК в образцах или выделение организма из образцов), так и непрямую диагностику (серологическую диагностику или серологическое исследование для выявления лептоспиральной инфекции, основанное на обнаружении специфических антител против различных Лептоспиральные антигены) (табл. 1).
6.2.1. Прямое микроскопическое исследование, посев и обнаружение антигена
Лептоспиры представляют собой тонкие, яркие, активно подвижные спирали с характерным быстрым вращением (подергивающаяся подвижность) под обычным темнопольным микроскопом (DFM), и для обнаружения одной клетки в поле необходимо примерно 10 лептоспир/мл. При увеличении продолжительности заражения на одну неделю при выходе ДФМ умирает примерно 10% (от 100 до 90%). Для повышения чувствительности используются несколько специальных методов окрашивания; Окрашивание серебром Вартина-Старри [76] и иммуноокрашивание (иммуногистохимия, иммунофлуоресценция, захват иммуномагнитного антигена и окрашивание иммунопероксидазой [77]), которые требуют первичных антител, специфичных к серовару (изолировано или в комбинации).
Таблица 1. Лабораторные исследования для диагностики лептоспироза.
LAMP, петлевая изотермическая амплификация; ПЦР – полимеразная цепная реакция; NGS – секвенирование нового поколения; ИГА – непрямая гемагглютинация; ИФА – иммуноферментный анализ; IgM – иммуноглобулин М; МАТ – макроскопическая реакция агглютинации; MCAT – тест агглютинации микрокапсул; ДНК, дезоксирибонуклеиновая кислота; DFM, темнопольная микроскопия
Параллельно посев лептоспир из крови, мочи, спинномозговой жидкости и биоптатов возможен в течение первых нескольких дней до 10 дней после появления симптомов заболевания (стадия лептоспироза). Поскольку они медленно растут (время удвоения 6–8 часов), требовательны и склонны к контаминации, образцы культуры необходимо хранить не менее 3–4 месяцев, прежде чем их отбраковывают как отрицательные) с чувствительностью только 23%, но это необходимо. для теста на лекарственную чувствительность [6]. Таким образом, среда EMJH (Эллингхаузен-Маккаллоу-Джонсон-Харрис) (комплекс олеинового альбумина) состоит из бычьего сывороточного альбумина (фракция V), Твина 80, хлорида аммония, тиамина, монокалийфосфата, динатрийфосфата и различных питательных веществ [78]. Обычно используется более специализированная среда T80/40/LH (полисорбат 40, гидролизат лактальбумина, супероксиддисмутаза и кроличья сыворотка) для некоторых сероваров [79]. Для первичной изоляции большого и разнообразного спектра прихотливых патогенных лептоспир хорошей средой кажется среда Хорнсби-Альт-Налли (HAN) [80].
Обнаружение лептоспиральных антигенов с помощью иммунопероксидазы, иммунофлуоресценции или системы иммуномагнитного захвата антигена было разработано для образцов с низкой бактериальной нагрузкой, или темнопольная микроскопия не может быть использована, но обычно не выполняется из-за ограничения на первичные антитела [77]. Напротив, распознавание нуклеиновой кислоты с новой амплификацией ДНК; Полимеразная цепная реакция (ПЦР) (т.е. гнездовая ПЦР, количественная ПЦР [кПЦР]), петлевая изотермическая амплификация (LAMP) и секвенирование нового поколения (NGS) ценны для ранней и точной лабораторной диагностики, особенно при Выделение лептоспир с использованием инокуляции биологических сред и гибридизации ДНК (зонд ДНК) [81,82]. Для диагностики можно амплифицировать различные мишени лептоспиралей (такие как 16S рибосомальная РНК) или ДНК [83], а ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР) более чувствительна и специфична, чем стандартная ПЦР [84]. Поскольку некоторые праймеры ОТ-ПЦР могут связываться с неспецифическим сайтом, что приводит к ложноположительным результатам, самые последние анализы мультиплексной ПЦР в реальном времени были разработаны с использованием двух наборов праймеров [85]. Вложенная ПЦР также помогает обнаружить более специфичные и чувствительные участки ДНК с помощью дополнительных наборов праймеров [86,87]. Однако современные тенденции диагностики лептоспироза заключаются в использовании как серологических, так и молекулярных методов, таких как ПЦР и ИФА (более простых, чем золотой стандарт серологического MAT), для стран с ограниченными ресурсами [88,89]. Кроме того, метод LAMP [90] для обнаружения гена 16S рРНК (rrs) является экономически эффективным, быстрым и высокоэффективным методом обнаружения патогенных лептоспир в моче. В настоящее время NGS является наиболее точным, независимым от культуры методом анализа основного генома в жидкостях организма (крови и моче) [91], и будущим направлением тестов на лептоспироз будет переход к молекулярной классификации лептоспир, которая преодолевает ограничения культуральное выделение лептоспир из клинических образцов. Следовательно, ценность ПЦР в клинической диагностике лептоспироза особенно высока, и появляется несколько современных методов.
6.2.2. Обнаружение антител против лептоспир
Используются несколько серологических диагнозов; например, тесты на родоспецифичные антитела (непрямая гемагглютинация [IHA], твердофазный иммуноферментный анализ [ELISA], Lepto Dri Dot [латексная агглютинация], микрокапсульная агглютинация [MCAT]) и тесты на серовар-специфические антитела (микроскопический тест агглютинации [CAT]). МАТ]) [92,93]. Таким образом, критериями МАТ для диагностики являются (i) четырехкратное повышение титра в парных сыворотках (сероконверсия текущей инфекции) или (ii) одиночный высокий титр (больше или равен 1:400 или 1:800, выше при эпидемической инфекции). районах) (серопозитивность) (антитела могут сохраняться в течение некоторого времени после заражения или перекрестной реакции с другими заболеваниями). Кроме того, для MAT требуется живая панель всех сероваров Leptospira в регионе, а также панель локально стандартизированных сероваров [93,94] в соответствии с требованиями Всемирной организации здравоохранения животных (19 антигенов, представляющих 15 серогрупп) [95]. Поскольку антитела обнаруживаются через 5–7 дней после заражения, тест MAT может быть отрицательным (титр <1:50) в течение первых нескольких дней после заражения. Диагностика лептоспироза может быть выполнена по образцам мочи [96] с использованием как серологического, так и молекулярного обнаружения (16S рРНК), особенно у пациентов с недавней инфекцией (MAT больше или равно 1:800 или ELISA IgM-положительный или оба) [97] .
При ограниченных ресурсах оценка клинического прогноза [98] на основе соответствующего клинического анамнеза и соответствующих лабораторных тестов с оценкой по семи аспектам выглядит следующим образом: гипотония (3), желтуха (2), мышечная боль (2), ОПП (1,5). , низкий гемоглобин (3), гипокалиемия с гипонатриемией (3) и нейтрофилия (1) (пороговый суммарный балл 4 соответствует площади под кривой рабочей характеристики приемника {{10}},78 ( 95% ДИ 0,68–0,89) для диагностики лептоспироза [77]). Этот показатель вероятности Thai-Lepto при поступлении может быть диагностическим инструментом для ранней предположительной диагностики лептоспироза у пациентов с тяжелыми клиническими подозрениями на это заболевание.
