Снижение почечной консервации/реперфузионного повреждения контролируемой гипертермией во время перфузии аппарата Ex vivo

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Томас Минор1,*,† и Шарлотта фон Хорн1,†

Возможный ренопротекторный эффект контролируемой кратковременной обработки тепловым шоком при изолированной аппаратной перфузии донорских трансплантатов ex vivo передреперфузиядолжны быть исследованы в первичном исследовании in vitro.Свинойпочки(n = 14) были извлечены после 20 минут остановки сердца донора и подвергнуты 20 часам статического холодного хранения в растворе Университета Висконсина. Передреперфузия,почкиподвергали 2-часовой восстановительной перфузии машины с постепенным повышением температуры перфузии до 35°С. В половинепочки(n = 7), в период перфузии машины был реализован короткий гипертермический импульс (10 минут перфузии при 42°С). Функциональное восстановление трансплантатов наблюдалось при нормотермической реперфузии in vitro. Гипертермическое лечение приводило к 50% увеличению белка теплового шока (HSP) 70 и HSP 27 мРНК и сопровождалось ~ 50% улучшением канальцевой реабсорбции натрия и глюкозы при реперфузии по сравнению с контрольной группой. Кроме того, почечная потеря аспартатаминотрансферазы была значительно снижена до одной трети контрольной группы, как и потеря белка в моче, оцениваемая по соотношению альбумина к креатинину. Сделан вывод о том, что лечение тепловым шоком ex vivo представляется легко реализуемым и многообещающим вариантом усиления механизмов самозащиты почек отреперфузияТравмапосле сохранения это заслуживает дальнейшего исследования в доклинических моделях.

Cistanche dr vita opcочень хорошо дляпочкареперфузия

Основные моменты исследования

КАКОВЫ ТЕКУЩИЕ ЗНАНИЯ ПО ЭТОЙ ТЕМЕ?

✔ Индукция белков теплового шока (HSP) в местных тканях является хорошо известным защитным механизмом в ответ на стрессы окружающей среды. Повышение регуляции этих молекулярных шаперонов индуцирует механизмы восстановления и толерантность к последующим клеточным клеткам.Травма. Клиническийпочкатрансплантация все больше и больше опирается на использование расширенных критериев донорских органов, которые несут повышенную восприимчивость к ишемии/реперфузииТравма. Аппаратная перфузия ex vivo маргинальных трансплантатов органов обеспечивает привилегированный доступ к трансплантату и новую перспективу для легкого и контролируемого применения гипертермической стимуляции к изолированному органу, чтобы вызвать реакции теплового шока и развязать сигнальные пути, которые благоприятно влияют на последовательное обострение повреждения тканей и улучшаютпочечныйвосстановление после трансплантации.

КАКОЙ ВОПРОС БЫЛ РАССМОТРЕН В ЭТОМ ИССЛЕДОВАНИИ?

✔ Мы исследуем потенциальный защитный эффект кратковременного гипертермического стимула во время предварительной трансплантации ex vivoпочкаперфузияпо функциональному исходу при постишемииреперфузия.

ЧТО ЭТО ИССЛЕДОВАНИЕ ДОБАВЛЯЕТ К НАШИМ ЗНАНИЯМ?

✔ Это исследование дает некоторые признаки того, что гипертермическое лечение во время перфузии аппарата почек ex vivo действует как возможный новый инструмент для улучшения функциональных результатов незначительно сохраненногопочкипри постишемической реперфузии. Данные подтверждают соответствующую роль HSP в снижении клеточной деструкции и улучшении посттрансплантационной канальцевой функции почек.

КАК ЭТО МОЖЕТ ИЗМЕНИТЬ КЛИНИЧЕСКУЮ ФАРМАКОЛ

OGY ИЛИ ТРАНСЛЯЦИОННАЯ НАУКА?

✔ Добавление кратковременной контролируемой гипертермии к установленному протоколу перфузии нормотермической машины является легко реализуемым методом для клинического применения и может способствовать улучшению восстановления органов после трансплантации.

Клиническая трансплантация почки все больше и больше полагается на использование расширенных критериев донорских органов, которые были повреждены до извлечения или, вероятно, менее оптимальны.

качество. Наряду с увеличением доли тех органов, которые несут повышенную восприимчивость к повреждающим триггерам при ишемическом сохранении,1,2 изменения тканей

Связанные с ишемией / реперфузионным повреждением представляют собой серьезную проблему роста в трансплантации почек, которая вызывает клеточную дисфункцию при реперфузии.

Индукция клеточных шаперонов и запуск фенотипа защитного сигнала (например, подкритическим тепловым напряжением) является хорошо известным механизмом уменьшения изменений тканей, относящихся к более поздней стрессовой ситуации, и оспаривания гомеостаза тканей.3,4

Появление изолированной машинной перфузии в качестве альтернативы или дополнения к ишемическому холодному хранению маргинальных донорских трансплантатов открыло новую перспективу для легкого и контролируемого применения гипертермического вызова к изолированному органу, чтобы вызвать реакцию теплового шока и развязать сигнальные пути, которые благоприятно влияют на последовательное обострение повреждения тканей и улучшают восстановление почек после трансплантации.

Экспериментально доказано, что предусловливающий эффект реакции теплового шока связан с временным наднормальным увеличением циторезистенции5, а также действует через усиление механизмов вторичной клеточной пары.6 Совсем недавно было показано, что индукция белков теплового шока (HSP) может обеспечить защиту, даже если она индуцирована на ранней стадии после того, как первоначальное повреждение ткани уже имело место.7

Привилегированный доступ к изолированному органу исключает громоздкие требования к нагреванию всего тела и вызывает неблагоприятные побочные эффекты на донорские или реципиентные организмы.

Таким образом, это исследование было задумано как пилотное исследование для тщательного изучения первичных доказательств гипертермического лечения во время перфузии ex vivo почечной машины, чтобы действовать как возможный новый инструмент для улучшения функционального выхода слабо сохранившихся почек при постишемической реперфузии.

МЕТОДИКА

Все эксперименты проводились на почках, которые извлекались у мертвых самок немецких свиней ландраса (возраст: 10−12 недель, вес: 25 и 30 кг). Был принят федеральный закон о защите животных и принципах ухода за лабораторными животными (публикация Национального института здравоохранения (NIH) No 85-23, пересмотрен в 1985 году). С животными обращались по правилам и после одобрения местных властей.

Почки были удалены через 20 минут после остановки кровообращения и промыты на заднем столе гравитацией 100 см холодным (4 ° C) раствором Висконсинского университета до тех пор, пока стоки не стали прозрачными. Гепарин не давали в любое время.

Впоследствии трансплантаты хранились в течение 18 часов в стакане, заполненном раствором Университета Висконсина и температурой, регулируемой до 4 ° C с помощью криотермостата.

В контрольной группе почки затем подвергали 2 часам насыщенной кислородом (95% O2; 5% CO2) нормотермической машинной перфузии раствором Aqix RS I, дополненным 40 г/л бычьего сывороточного альбумина. Как предлагалось ранее, 8,9 на слияние начиналось при гипотермии с последующим градуированным увеличением до 35 ° C в течение первых 60 минут, контролируемым программируемым циркулирующим криотермостатом.

В экспериментальной группе в изолированную перфузию был включен короткий период контролируемой гипертермии (СН).

Ex Vivo Heat-Shock Treatment of Organ Grafts Minor и протокол фон Хорна. После достижения 35° температуру перфузата временно повышали до 43°С в течение 10 минут (рисунок 1) до продолжения перфузии при 35°С в течение оставшейся части 2-часового периода. Время и высота повышения температуры были получены из предыдущих экспериментов по инкрементному скринингу, направленных на получение последовательного эффекта.

В трех экспериментах парциальное давление кислорода в ткани контролировалось с помощью оптического датчика кислорода игольчатого типа микрофибры, подключенного к волоконно-оптическому кислородному измерителю с температурной компенсацией (Microx 4, PreSens precision sensing, Регенсбург, Германия), который одновременно регистрировал соответствующую температуру с помощью термисторного зонда.

Иглу помещали во внутреннюю кортикальную область почки, чтобы документировать адекватную оксигенацию тканей даже во время гипертермических периодов перфузии.

Модель изолированной реперфузии почек

Восстановление почек после повреждения консервацией/реперфузией оценивали с использованием установленной модели реперфузии in vitro, как описано выше.10

Короче говоря, почки холодно промывали 100 мл физиологического раствора в конце периода восстановления аппарата, а затем держали при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы имитировать второй период теплой ишемии во время хирургической имплантации in vivo. Это время также использовалось для канюляции мочеточника с большой трубкой, чтобы обеспечить сбор мочи при реперфузии.

Почки помещали в термостатически контролируемую камеру из плексигласа и перфузировали через почечную артерию при среднем пульсационном давлении 90 мм рт.ст. Венозный эф-флаент свободно сливается в резервуар. Оксигенацию перфузата проводили с 95% O2/5% CO2 с использованием термоконтролируемого оксигенатора из полого волокна. Артериальное давление поддерживалось с помощью сервоуправляемого роликового насоса в сочетании с датчиком давления, соединенным с артериальной перфузионной канюлей. Моча была собрана из ПЭ-трубки, вставленной в мочеточник, который направлялся наружу резервуара. Каждые 100 мл собранной мочи фильтровали и повторно вводили в резервуар для того, чтобы

Рисунок 1Почечныйкортикальная ткань pO2 (пунктирная линия) во время машинной перфузии ex vivo по отношению к соответствующей температуре перфусата (сплошная линия).

для поддержания постоянного электролитного состава перфузата с течением времени.

Аналитические процедуры

Парциальное давление кислорода и концентрации перфусата глюкозы и электролитов измеряли в газоанализаторе рН-крови (кислотно-щелочная лаборатория ABL 815flex, радиометр, Копенгаген).

Ферментная активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) и концентрации креатинина определялись обычным способом с помощью рефлекторной фотометрии на блоке оказания помощи Reflotron Plus (Roche Diagnostics, Мангейм, Германия).

Почечныйклиренс был рассчитан для соответствующих интервалов, когда креатинин мочи × поток мочи / креатинин перфусата.

Концентрацию альбумина во фракции мочи в конце эксперимента измеряли фотометрически с помощью красительсвязывающего анализа с бромокреслом зеленого в лабораторном центре университетской больницы и нормализовали количество белка по отношению к соответствующим концентрациям креатинина в качестве отношения альбумина к креатинину в моче.

Отфильтрованная нагрузка натрия (FL Na) рассчитывалась как

FL = СКФ × Na

FRNa = (FLNa − Na(моча) ×уриновый поток)∕FLNa

Фильтрованная нагрузка и фракционная реабсорбция глюкозы были рассчитаны соответствующим образом.

Обратная транскрипция и последующая полимеразная цепная реакция

Общая РНК была выделена из замороженных образцов тканей из внешней коры и проанализирована, как описано ранее.8

Исходные значения были рассчитаны на основе образцов тканей, которые были взяты из жизненно важных веществ.почкиex vivo. Результаты были количественно оценены с использованием метода ΔΔCt. Гены-мишени были нормализованы до глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в качестве внутреннего стандарта. Значения экспрессии генов Fold были рассчитаны для каждого отдельного образца как нормализованные по сравнению с исходными значениями.

В исследовании использовались следующие грунтовки (приобретенные у Qiagen GmbH, Хильден, Германия): глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (no. PPS00192A), HSP72 (нет. PPS00074A), HSP27 (нет. PPS01262) и HO-1 (no. ППС01191А).

Вестерн Блот

Иммуноблоттинг белка проводили из цельноклеточных лизатов из наружногопочечныйкору головного мозга путем электрофореза додецилсульфатно-полиакриламидного геля и электрофоретического переноса на нитроцеллюлозную мембрану, как описано ранее.8 Окрашивание проводили с помощью ponceau S, проверенной равномерностью загрузки и переноса белка.

Инкубацию с первичными антителами перформировали в течение ночи при 4°C (антифосфо-внеклеточная сигнально-регулируемая киназа кролика (ERK, Thermo Fisher, #MA5-15174—1:500) или анти-HSP 72 (StressMarq Bioscience, #SCM-100—1:300). После инкубации с вторичным антителом, связанным с пероксидазой хрена (1:1000) в течение 1 часа при комнатной температуре, белок был обнаружен усиленной хемилюминесценцией с использованием C-Digit Blot Scanner (Li-COR).

Количественную оценку содержания белка проводили денситометрически с помощью геля UN-SCAN-IT версии 6.1 (Silk Scientific, Orem UT) как нормализованного по отношению к экспрессии общего ERK (Thermo Fisher, #MA5-15174) или ß-актина (Thermo Fisher, #PA1-46296).

Статистика

Все значения выражены как средние ±SD для n = 7 животных в группе, а различия между группами были проверены непарным, двусторонним t-тестом с использованием поправки Уэлча для неравных дисперсий, если не указано иное. Статистическая значимость была установлена на уровне P<>

РЕЗУЛЬТАТЫ

Перфузия машины

Во время контролируемого насыщенного кислородом повторного нагрева машинных перфузированных трансплантатов временная гипертермия приводила к заметному временному падениюпочечныйкортикальная ткань pO2 (рисунок 1), которая, тем не менее, всегда оставалась выше 200 мм рт.ст. и, таким образом, четко соответствовала физиологическим требованиям во время нормотермической перфузии, которые, как сообщалось, составляли 30–50 мм рт.ст.11,12

Почечныйвысвобождение АСТ в циркулирующий перфусат было даже несколько ниже в группе гипертермии, чем в контрольных условиях (19,8 ± 12,1 против 33,3 ± 25,9 Ед/л; CH против контроля, не значимый).

Молекулярное считывание транзиторной гипертермии во время перфузии аппарата ex vivo

Сохранение и реперфузия приводят к заметной индукции HSP даже в контролируемых условиях с ~ 2-кратным, 8-кратным и даже 100-кратным увеличением транскриптов мРНК гемокси-игеназы 1, HSP 27 и HSP 72 соответственно.

Тем не менее, контролируемая транзиторная гипертермия во время машинной перфузии эффективно усиливала это увеличение индукции генов примерно на 50% во всех случаях. Было установлено, что эффект является весьма значимым для HSP 27, а также HSP 72, тогда как статистическая значимость не может быть доказана в отношении индукции гемоксигеназы 1 (рисунок 2).

Фосфорилирование ERK представляет собой быстрое, реагирующее защитное сигнальное событие, которое также может способствовать экспрессии HSP 72.13

Это было исследовано как раннее влияние теплового стресса на уровень белка. Анализы вестерн-блоттинга показали, что транзиторная гипертермия во время машинной перфузии значительно увеличивала количество фосфорилирования ЭРК в ткани по сравнению с контрольной группой (рисунок 3). Соответственно, было также обнаружено, что экспрессия белка HSP 72 значительно повышена выше значений контрола после контролируемой гипертермии во время машинной перфузии.

Транзиторная гипертермия улучшаетсяпочечныйвосстановление после консервации

Поток перфусата во время реперфузии составлял в среднем от 300 до 400 мл в минуту без каких-либо различий между ними

Группы. Производство мочи также было аналогичным в обеих группах с 897 ± 354 против 601 ± 280 мл / 90 минут (контроль против CH).

Почечныйвысвобождение АСТ принимали как параметр глобального клеточного повреждения и следовали во время реперфузии (рисунок 4). Видно, что гипертермическое лечение приводило к первоначально более низким значениям в начале реперфузии и еще больше смягчало прогрессирующее повышение во время продолжающейся перфузии.

Почечныйфункцию канальцевой клетки оценивали путем анализа реабсорбции натрия и глюкозы из ультрафильтрата (рисунок 5). Было установлено, что фракционные скорости реабсорбции отпочки, ранее подвергавшиеся контролируемой гипертермии во время машинной перфузии, значительно превосходили таковые контрольной группы на ~40%.

Для того, чтобы исключить возможность того, что контрольпочкивозможно, были заряжены абсолютно более высокими нагрузками натрия или глюкозы в ультрафильтрате, мы также определили общую фильтрационную нагрузку обоих веществ, которая, однако, не различалась между двумя группами с FL Na в размере 2,7 ± 0,7 и 2,5 ± 0,8 ммоль / мин и КЛЕЕМ FL до 24,8 ± 12,1 и 28,6 ± 9,4 мг / мин (контроль против CH, соответственно).

Скорости клубочковой фильтрации также были неоднозначными в обеих группах; значения клиренса для креатинина составляли 0,25 ± 0,06 мл/г/мин в контрольной группе и до 0,24 ± 0,08 мл/г/мин после СН.

Напротив, утечка белка в моче была значительно уменьшена впочкикоторые подвергались СН (рисунок 6).

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование машинной перфузии ex vivo представляет собой развивающуюся тенденцию в управлении сохранением трансплантата до трансплантации органов.

В последнее десятилетие гипотермическая машинная перфузия была установлена как превосходный метод консервации по сравнению с простым статическим холодным хранением14,15 и стала популярной для сохранения органов более высокого риска, а также органов по внешним критериям.14–16

Было показано, что пульсирующая стимуляция сосудистой системы во внетелесном периоде17, а также присутствие кислорода18 поддерживаютпочечныйгомеостаз и улучшениефункциональныйисходы после трансплантации.

Последние технические достижения способствовали появлению новой тенденции к нормотермической машинной перфузии в качестве более физиологической альтернативы технологиям гипотермической перфузии, которая компенсирует более высокие затраты за счет доказанного поддержания метаболического гомеостаза и более достоверной возможности оценить сохраненный трансплантат до трансплантации.19,20

Помимо этого, нормотермическая машинная перфузия представляет собой идеальную платформу для терапевтических вмешательств в изолированный орган, которые могут служить целям кондиционирования, направленным на облегчение последствий предшествующей травмы извлечения / сохранения или на предварительное условие против последующего реперфузионного повреждения после теплой ишемии и реперфузии при трансплантации.

cistanche kidney wirkung

Было обнаружено, что лечение теплового шока как терапевтический подход способствует очень эффективным механизмам защиты в почках и вызывает толерантность к специфическим повреждениям путем стабилизации структуры белка и клеточной целостности. Этот эффект в основном основан на синтезе специфических HSP, которые конститутивно экспрессируются в почках и могут быть сильно повышены в ответ на различные стрессовые состояния.4

Это исследование показывает, что кратковременный гипертермический вызов во время изолированной перфузии почек эффективно вызывает молекулярную реакцию теплового шока, о чем свидетельствует претранскрипциональный и на белковом уровне, и активирует передачу сигналов выживания через путь ERK. Описанная процедура, таким образом, не была связана с кажущейся гипоксией тканей, несмотря на изолированную перфузию без дополнительных носителей кислорода.

Ранее было установлено, что индукция HSP может начаться в пределах< 1="" hour21="" and="" that="" the="" expression="" of="" hsp="" 72="" increases="" to="" multitudes="" already="" after="" 3="" hours.22="" hsp="" 70="" is="" the="" most="" prominent="" chaperone="" responsive="" to="" hyper-thermic="" stress="" and="" plays="" a="" pivotal="" role="" in="" tissue="" protection="" by="" augmentation="" of="" the="" cellular="" self-defense="">

HSP 72 предотвращает неправильное сворачивание белков,5 облегчает удаление поврежденных белков,6 и принимает участие в рефолдировании и восстановлении белка. В поддержку клеточных процессов репарации, которые намного дешевле, чем синтез de novo. Таким образом, HSP 72 уменьшает метаболические потребности во время критической ситуации при реперфузии после повреждения клеток21 и тем самым помогаетклеточное восстановлениеот оскорбления.

Стабилизация лизосомальных мембран23 уменьшает повреждение клеток кислотными гидролазами и последовательную индукцию гибели клеток. На молекулярном уровне более ранние исследования показывают, что HSP 72 активирует путь MEK/Erk и соответствующий защитный эффект связан с фосфорилированием Raf, MEK и Erk и выживаемостью клеток.24,25 Соответственно, в нашей модели СН привел к значительному снижению общего высвобождения АСТ, которое было принято за параметр общего повреждения клеток. Кроме того, прогрессирующее повышение АСТ во время продолжающейся реперфузии также было заметно ослаблено лечением.

Наряду с этим пошло значительное смягчение последствийпочечная дисфункциябыло обнаружено, что способность к повторному поглощению трубчатых клеток увеличивается на ~ 50% по сравнению с контрольными значениями.

HSP 27 представляет собой низкомолекулярный HSP, который также оказался важным игроком в защитной реакции теплового шока в почках.4 Исследования на трубчатых клетках крыс показывают, что накопление HSP 27 в проксимальных канальцевых клетках связано с повышенной выживаемостью и регенерацией.26

Основываясь на результатах настоящего пилотного исследования, реализация краткого гипертермического вызова в протокол перфузии ex vivo машины, по-видимому, является простым способом кондиционировать незначительно сохраненные почечные трансплантаты, которые способствуют устойчивости к реперфузионному повреждению путем усиления клеточного механизма самозащиты. По-прежнему существуют споры о том, следует ли проводить машинную перфузию заранее, сразу после закупки трансплантата27, несмотря на логистические неудобства, или если короткий период конечной ишемической перфузии после транспортировки органа статическим холодным хранилищем будет достаточным и более легко реализуемым в клинической рутине.28,29 Ex vivo кондиционирование трансплантата CH было бы возможным в любом модальности.

Однако следует проявлять осторожность в отношении преждевременных окончательных выводов. Изолированная перфузированная почка (IPK) является полезным инструментом для функциональных скрининговых исследований30, а корреляции между данными IPK и клиническими исходами делают модель IPK потенциально полезным инструментом для оценки функции почек.17,31 Однако довольно постоянная функциональная емкость модели ограничена несколькими часами32, что исключает долгосрочные наблюдения.

Поскольку максимальное выражение HSP все еще может происходить после этого времени22, потенциальное дальнейшее увеличение защитного эффекта гипертермического лечения (например, с точки зрения улучшения регенерации после ишемического инсульта) не будет учитываться в нашей пилотной установке. Кроме того, из более ранних исследований в других моделях хорошо известно, что лечение тепловым шоком или лентивирусная гиперэкспрессия HSP 27 может привести к смягчению воспалительной реактивности поврежденных органов-мишеней.

наряду со значительным уменьшением нейтрофильной инфильтрации в ткани.33,34

Лейкоцитарная инфильтрация, в свою очередь, как известно, является ведущим явлением острого типа, которое вызывает вредные воспалительные реакции после почечной ишемии и реперфузии in vivo.

Однако для того, чтобы исключить сопутствующие неблагоприятные эффекты активации клеток крови на искусственных поверхностях трубок, которые были бы неизбежны в расширенной модели in vitro, фактическая трансплантация и реперфузия в физиологических условиях, включая естественную морфологию сосудов, по-видимому, являются обязательными для точного устранения клеточных воспалительных эффектов, которые поэтому не были рассмотрены в настоящем пилотном исследовании.

Наконец, недавние результаты продемонстрировали существенное значение.половые различияв транскриптах, выраженных в проксимальных клетках канальцев самцов и самок, которые могут отражать связанные с полом различия в хроническом заболевании почек или провоспалительных генных модулях.35 В нашем исследовании использовались только самки животных, что позволило обойти предполагаемые различия, связанные с полом, в реакциях теплового шока. Возможно, различное поведение мужской ткани, с другой стороны, не было рассмотрено и, следовательно, не может быть учтено в этом исследовании.

В заключение, наши данные до сих пор показывают, что краткая гипертермическая перфузия ex vivo является простым способом индукции шаперона в изолированном почечном трансплантате, который обеспечивает паренхиматозную защиту при ранней реперфузии и требует дальнейшего подтверждения с использованием моделей трансплантации in vivo с увеличенным временем наблюдения.

Подтверждения. Авторы с благодарностью отмечают ценную техническую помощь Бастиана и Регины Люер.

Финансирование. Никаких финансовых средств на эту работу получено не было.

Конфликт интересов. Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов в этой работе.

Вклад автора. Т.М. и К.В.Х. написали рукопись. Т.М. и К.В.Х. разработали исследование. T.M. и C.v.H. провели исследование. T.M. и C.v.H. проанализировали данные.