Почечные CD169 плюс резидентные макрофаги имеют решающее значение для защиты от острого системного кандидоза

edmund.chen@wecistanche.com

ВведениеСистемный кандидоз является четвертой распространенной внутрибольничной инфекцией кровотока, которая, по оценкам, ежегодно поражает более 250 000 пациентов отделений интенсивной терапии, несмотря на соблюдение гигиенических норм в больницах (Delaloye & Calandra, 2014; Kullberg & Arendrup, 2015). Хотя в настоящее время для лечения этой инфекции в основном используются противогрибковые препараты, уровень смертности среди пациентов остается тревожно высоким (40–60 процентов) (Delaloye & Calandra, 2014; Bassetti et al, 2018; Lamoth et al, 2018). Тем не менее, вакцины клинически не доступны на сегодняшний день. С ростом популяции стационарных пациентов, страдающих хроническими заболеваниями, и появлением случаев устойчивости к противогрибковым препаратам понимание иммунитета хозяина против такой инфекции будет иметь важное значение при разработке иммунотерапии для улучшения или дополнения текущих противогрибковых вмешательств (Armstrong-James et al, 2017; Desai и др., 2017; Бассетти и др., 2018). Широко известные как центральные игроки инвазивного противогрибкового иммунитета, фагоциты, в частности полиморфноядерные фагоциты (нейтрофилы), используют различные механизмы в борьбе с грибковыми инфекциями, такие как фагоцитоз, высвобождение активных форм кислорода (АФК) и микробицидных белков, а также образование НЕТоза. Боррегаард, 2010; Мантовани и др., 2011). Ключевая роль нейтрофилов в иммунитете к Candida дополнительно подчеркивается клинической ассоциацией нейтропении и дефектов нейтрофилов как предрасполагающих факторов к системному кандидозу (Lehrer & Cline, 1969; Wisplinghoff et al, 2004; Pfaller & Diekema, 2007; Yapar, 2014). . Однако гораздо меньше известно о роли различных мононуклеарных фагоцитов при этой инфекции in vivo, отчасти из-за отсутствия доступных инструментов для разграничения различных субпопуляций макрофагов и дендритных клеток впочки,которые являются основными органами-мишенями системного кандидоза (Schraml et al, 2013; Gottschalk & Kurts, 2015).

Ключевые слова:почка; повреждение почек; почечная ткань; почечный грибок; поражение почек; функция почек

CISTANCHE УЛУЧШИТ ФУНКЦИЮ ПОЧЕК / ПОЧЕК

Важность макрофагов в инвазивном иммунитете к Candida, насколько нам известно, впервые была убедительно продемонстрирована Lionakis et al (2013). Воспользовавшись мышами CX3CR1gfp/gfp, у которых количествопочечныйпопуляция макрофагов значительно сократилась, Lionakis et al (2013) показали, чтопочечныйрезидентные макрофаги являются ключевыми защитниками первой линии от нападения C. Albicans (Lionakis et al, 2013). Кроме того, эти макрофаги, по-видимому, участвуют в регуляции рекрутирования нейтрофилов впочкиво время инфекции Candida (Kanayama et al, 2015). Сообщалось, что макрофаги, помимо содействия уничтожению грибков, играют роль впочечныйвосстановление тканей (Tran et al, 2015). Ранее сообщалось, что CD169, также известный как сиалоагезин или связывающий сиаловую кислоту иммуноглобулин-подобный лектин 1 (Siglec -1), является специфическим маркером, который идентифицирует резидентные в тканях макрофаги (TRM) в различных периферических органах, таких как легкие. , селезенка, печень ипочки(Пурнама и др., 2014; Карасава и др., 2015; Гупта и др., 2016; Сведова и др., 2017). Интересно,почечныйCD169 плюс макрофаги связаны с иммунорегуляцией либо в сторону прогрессирования иммунопатологии, либо в сторону иммунного разрешения, в зависимости от моделей заболевания/травмы (Chavez-Galan et al, 2015). Однако мало что известно о функциональной роли CD169 и макрофагов in vivo в системном иммунитете к Candida. Здесь мы показываем, чтопочечныйCD169 плюс макрофаги являются важными иммунными регуляторами при острой системной кандидозной инфекции. Отсутствие CD169 плюс макрофаги снижает ответ IFN и продукцию АФК нейтрофилами впочки.В результате мыши, у которых отсутствует CD169 плюс макрофаги, погибают от инфекции Candida в низких дозах, демонстрируя чрезвычайно высокую грибковую нагрузку и тяжелую форму.почечныйиммунопатология.

Полученные результаты

CD169 плюс макрофаги представляют собой субпопуляцию почечных TRM.Чтобы исследовать почечные TRM, мы использовали модель трансгенных мышей CD169-DTR, которая специфически удаляет TRM при лечении дифтерийным токсином (DT) из-за их экспрессии CD169 (Purnama et al, 2014; Gupta et al, 2016; Chen & Ruedl). , 2020). Помимо CD169, в нашем коллеге цитометрическом анализе использовался высокий уровень экспрессии F4/80 и средний уровень CD11b, чтобы отличить TRM от других субпопуляций макрофагов (Sheng et al, 2015) (рис. 1A). Интересно, что только часть населенияпочечныйМакрофаги F4/80hi CD11bint были удалены у наших трансгенных мышей CD169-DTR, получавших DT (рис. 1A и B), что свидетельствует о гетерогенности популяции макрофагов F4/80hi CD11bint впочка.Параллельно с нашим наблюдением Карасава и др. (2015) также указали, что только подмножествопочечныйTRM экспрессируют CD169 (Karasawa et al, 2015). В частности, они показали, что CD169 plus plus TRM в основном локализуются впочечныймедуллярная область, что подтверждается нашими иммунофлуоресцентными окрашиваниями (рис. 1С).

Здесь мы отметили, что аблированные CD169 плюс плюс TRM экспрессируют умеренно более низкие уровни F4/80 и CD11b (F4/80 плюс плюс CD11b плюс), тогда как неаблированные TRM экспрессируют сравнительно более высокие уровни F4/80 и CD11b (F4/80 плюс плюс плюс CD11b плюс плюс ). Однако эти две популяции TRM неразличимы у мышей дикого типа (рис. 1А). Следовательно, основываясь на аблированных и неаблированных TRM, мы в целом разделили их на фракцию I (Fr I) (CD169 плюс плюс F4/80 плюс плюс CD11b плюс) и фракцию II (Fr II) (CD169 плюс F4/80 плюс плюс плюс CD11b). плюс плюс) популяции (рис. 1А и В). Примечательно, что заметное, но незначительное снижение популяции Fr II у мышей CD169-DTR также указывает на то, что часть популяции Fr II экспрессирует CD169. Профиль абляции TRM у мышей CD169-DTR согласуется с экспрессией транскрипта CD169, где популяция Fr I экспрессирует значительно более высокий уровень CD169 по сравнению с популяцией Fr II (рис. 1D). Соответственно, более высокие уровни человеческого гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста (HB-EGF), рецептора для DT, наблюдались в Fr I по сравнению с TRM Fr II, что объясняет их чувствительность к лечению DT (рис. 1E).

CISTANCHE УЛУЧШИТ ПОЧЕЧНУЮ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ

Отсутствие почечных CD169 плюс макрофаги значительно снижает устойчивость хозяина к диссеминированному кандидозу.Чтобы оценить важность CD169 плюс макрофаги, мышам CD169-DTR и WT внутривенно вводили низкую дозу 5 × 104 КОЕ C. Albicans, и их выживаемость отслеживали в течение 18 дней. В ходе инфекции мышей непрерывно лечили DT, чтобы обеспечить постоянное удаление популяции Fr I у мышей CD169-DTR (рис. S1). Частичное снижение количества макрофагов Fr I также наблюдалось у инфицированных мышей дикого типа на 3-й день после заражения (pi) (рис. 1F), что могло быть результатом некроптоза макрофагов, события, которое, как сообщается, происходит во время патогенных инфекций (Lai et al. , 2018; Цао и др., 2019). Наоборот, полная абляция макрофагов Fr I у мышей CD169-DTR происходила преимущественно из-за апоптоза, вызванного обработкой DT. Тем не менее, количество макрофагов Fr I у мышей CD169-DTR было постоянно и значительно ниже, чем у мышей WT на протяжении всего периода инфекции. С другой стороны, общее количество макрофагов Fr II было сопоставимо между инфицированными мышами WT и CD169-DTR (рис. 1F, правая панель). Следовательно, мыши CD169-DTR, у которых отсутствуют TRM Fr I, были значительно более уязвимы, чем мыши WT, при заражении системной кандидозной инфекцией (рис. 1G).

Мышей CX3CR1gfp/gfp ранее использовали для изучения функциипочкаTRM из-за потери общегопочечныйF4/80 плюс CD11b плюс популяция (Lionakis et al, 2013). Таким образом, сравнение мышей CX3CR1gfp/gfp и CD169-DTR позволяет нам понять функциональные последствия частичной и полной потери популяции почечных TRM. Для этого мы заразили мышей CD169-DTR, CX3CR1gfp/gfp и WT 5 × 104 КОЕ C. Albicans. Подобно тому, что сообщалось ранее, у мышей CX3CR1gfp/gfp наблюдалось полное отсутствие почечных TRM (как популяции Fr I, так и II), тогда как у мышей CD169-DTR наблюдалась более выраженная потеря популяции Fr I (рис. S2A и B). ). Соответственно, отсутствие как макрофагов Fr I, так и макрофагов II делало мышей CX3CR1gfp/gfp очень восприимчивыми к системному кандидозу (рис. S2C) с чрезвычайно высокой грибковой нагрузкой на почки уже на 1-й день после заражения по сравнению с инфицированными WT и CD{{20 }} Мыши DTR (рис. S2D). Напротив, у мышей CD169-DTR смертность ниже, чем у мышей CX3CR1gfp/gfp (рис. 1G и S2C), а ихпочечныйгрибковая нагрузка была значительно выше, чем у инфицированных мышей дикого типа только на 10-й день (рис. 2А и В). Поскольку у мышей CD169-DTR и CX3CR1gfp/gfp, получавших DT, отсутствуют TRM в других органах (Hochheiser et al, 2013; Gupta et al, 2016; Lee et al, 2018), мы оценили грибковую нагрузку в нескольких периферических органах. , то есть,почка,мозг, сердце, легкие, печень и селезенка у инфицированных мышей WT, CD169-DTR и CX3CR1gfp/gfp в день 1 pi. Интересно, что у мышей CD169-DTR и CX3CR1gfp/gfp почки были единственными органами, в которых грибковая нагрузка была явно выше, чем в остальных исследованных органах (рис. S2D). Повышенное количество Candida в почках CX3CR1gfp/gfp на 1-й день подтверждает результаты, полученные Lionakis et al (2013), гдепочечныйTRM жизненно важны дляпочечныйпервая линия защиты от системной инфекции Candida (Lionakis et al, 2013).

С другой стороны,почечныйгрибковая нагрузка у мышей CD169-DTR была значительно ниже, чем у мышей CX3CR1gfp/gfp, но не намного выше, чем у инфицированных мышей дикого типа.почкив день 1 pi (рис. S2D). Поскольку популяция Fr II остается относительно интактной у мышей CD169-DTR (рис. S2A и B), мы задались вопросом, была ли повышенная резистентность, наблюдаемая у мышей CD169-DTR, по сравнению с мышами CX3CR1gfp/gfp, главным образом из-за остающихся неослабевающими почечными макрофагами Fr II, которые препятствуют проникновению большинства C. Albicans в почечные канальцы, область, где в стационарном состоянии было обнаружено очень мало иммунных клеток. С этой целью мы отслеживали грибковую нагрузку на различные органы у мышей WT и CD169-DTR в дни 1, 3, 6 и 10 pi (рис. 2). Здесь наши данные показали ограниченную почками зависимость CD169 плюс макрофаги в клиренсе грибков, поскольку все исследованные органы, кроме почек, у мышей CD169-DTR были очищены от C. Albicans к 10 дню pi (рис. 2A). . Интересно, что, несмотря на потерю субпопуляции Fr I, грибковая нагрузка у мышей CD169- DTR нарастала так же, как и у инфицированных мышей WT (день 0–6) (рис. 2А и В), что предполагает минимальную роль почечного CD169 плюс плюс макрофаги в обеспечении первой линии защиты от этой инфекции. Различия в грибковой нагрузке почек между мышами CD169-DTR и WT были обнаружены только на 10-й день pi, когда грибковая нагрузка на почки с истощением CD169-продолжала расти, тогда как у мышей WT, по-видимому, содержится или очищается (рис. 2B). Таким образом, наши данные демонстрируют незаменимую роль CD169 плюс макрофаги в почечном иммунитете к Candida, но, вероятно, с небольшим вкладом в защиту почек первой линии от такой инфекции. Поразительно, поскольку у мышей CX3CR1gfp/gfp отсутствуют как макрофаги Fr I, так и макрофаги Fr II, и они проявляют повышенную восприимчивость уже в день 1 pi (рис. S2), мы предположили, что Fr II CD169 плюс макрофаги преимущественно ответственны за критический врожденный механизм раннего почечного грибкового заболевания. контроль.

Мыши CD169-DTR страдали от необратимого прогрессирующего повреждения почек во время инфекции Candida.Поскольку почки были единственными органами, в которых C. Albicans накапливалась во время инфекции (рис. 2А), мы затем провели гистопатологическое исследование срезов, окрашенных периодической кислотой по Шиффу (рис. 2С) и H&E (рис. 3А и S3). из инфицированных почек WT и CD169-DTR на 3-й, 6-й и 10-й день пи. На 3-й день в почках CD169-DTR наблюдались признаки почечного повреждения и кровоизлияния (рис. S3A). На 6-й день инфицированные почки WT демонстрировали незначительные признаки канальцевого и эндотелиального повреждения, тогда как инфицированные почки CD169-DTR демонстрировали более серьезные кровоизлияния и канальцевый некроз (рис. S3B). Как в инфицированных почках WT, так и в почках CD169-DTR, большая часть C. Albicans накапливалась в почечной лоханке (рис. 2C). Примечательно, что наблюдалось накопление лейкоцитов in situ как в WT, так и в

CD169-DTR почек, предполагая, что неконтролируемый рост C. Albicans в CD169-DTR почках не связан с отсутствием набора лейкоцитов (рис. 2C и 4A). На 10-й день структурная целостность CD169-DTR почек ухудшилась, что сопровождалось появлением фиброзных тканей (рис. 3А и S3С). В частности, были отчетливо видны расширение пространства Боумена и заметное отторжение тубулярных эпителиальных клеток и скоплений лейкоцитов в просвете некоторых почечных канальцев CD169-DTR почек (рис. 3А). Напротив, к 10 дню большинство почечных участков в почках WT, по-видимому, оставались интактными, что указывает на выздоровление от ранней инфекции (рис. 3A и S3C). Параллельно с гистологическим анализом почек мы оценили уровень молекулы повреждения почек-1 (Kim-1) в инфицированных почках WT и CD169- DTR, тип -1 трансмембранного белка где его экспрессия увеличивается только при повреждении почечных канальцев (Ichimura et al.,

1998 год; Хан и др., 2002 г.; Бонвентре, 2009). Наши данные показали, что экспрессия Kim-1 в почках инфицированных мышей CD169-DTR была значительно выше, чем в инфицированных WT на 10-й день pi (рис. 3B). Кроме того, целостность эндотелиальной выстилки в почках мышей CD169-DTR была значительно нарушена, о чем свидетельствует большее количество синего Эвана, оставшееся в почках CD169-DTR (рис. 3C). Ранее было показано, что CD169 плюс макрофаги обладают противовоспалительным действием, при этом отсутствие этих макрофагов приводило к чрезмерному воспалению при бактериальной инфекции или ишемически-реперфузионному повреждению (Karasawa et al, 2015; Svedova et al, 2017). В соответствии с этими моделями, почки мышей CD169-DTR были связаны с более высокими уровнями воспаления (т. е. TNF-, G-CSF и M-CSF), и было обнаружено, что почечная функция резко нарушена, когда

Отсутствие почечных CD169 плюс макрофаги не нарушало привлечение эффекторных клеток во время инфекции Candida.Поскольку неэффективный клиренс Candida в почках CD{{0}}DTR может быть связан с отсутствием рекрутирования эффекторных клеток, мы отслеживали нейтрофильную и моноцитарную инфильтрацию в почках мышей WT и CD169-DTR. в день 0, 1, 3, 6 и 10 pi Подобно нашим гистологическим наблюдениям (рис. 2C), отсутствие почечных макрофагов CD169 плюс макрофаги Fr I не влияло на набор лейкоцитов во время инфекции (рис. 4A). Вместо этого почки CD169-DTR были связаны с более высокой экспрессией хемокинов, привлекающих нейтрофилы и моноциты (например, CXCL1, CXCL2 и CCL2), и молекул клеточной адгезии (например, ICAM-1) (рис. 4B). и С). Повышенный уровень хемокинов в почках CD169-DTR, потенциально обусловленный неконтролируемым ростом C. Albicans, коррелирует с повышенным количеством инфильтрации иммунных клеток с 6-го по 10-й день pi. C. Albicans в почках WT и иммунные клетки в значительной степени удалялись на 10-й день pi (рис. 2B и 4A). Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что почечный CD169 плюс макрофаги не были основными игроками в привлечении эффекторных клеток, в частности нейтрофилов, во время инфекции Candida.

Нейтрофилы в CD169-DTR почках вызывают более низкую продукцию АФКЗатем мы приступили к допросу, влияет ли отсутствие CD169 плюс макрофаги на кандидацидную реакцию хозяина в почках. С этой целью мы оценили количество нейтрофилов и моноцитов, продуцирующих АФК, в инфицированных почках WT и CD169-DTR на 6-й день pi - день, когда почки WT и CD169-DTR демонстрировали сходную грибковую нагрузку. и клеточная инфильтрация (рис. 2В и 4А). Интересно, что мы наблюдали меньшее количество АФК-продуцирующих нейтрофилов, но не моноцитов, в почках CD169-DTR по сравнению с WT (рис. 5A и B). Соответственно, эти нейтрофилы в почках CD169-DTR генерировали значительно более низкие уровни АФК, чем в почках дикого типа, что предполагает более низкую способность к уничтожению нейтрофилов (рис. 5C и D).

Затем мы попытались определить, способствовала ли сниженная кандидацидная функция в CD169-DTR почках снижение жизнеспособности нейтрофилов. Удивительно, но инфицированные почки WT и CD169-DTR показали одинаковую пропорцию PIneg аннексина V плюс апоптоз и PI плюс аннексин V плюс мертвые нейтрофилы (рис. 5E и F). Это указывает на то, что жизнеспособность нейтрофилов не является одним из факторов, способствующих нарушению их кандидацидной функции в почках CD169-DTR. Почечная экспрессия IFN была значительно ниже в отсутствие CD169 плюс макрофаги. Связь неэффективного клиренса Candida и снижения АФК. уровни в нейтрофилах почек CD169-DTR побудили нас исследовать уровень экспрессии IFN в инфицированных почках WT и CD169-DTR на 6-й день pi. Известно, что этот цитокин защищает от инвазивного кандидоза путем потенцирования кандидацидной способности нейтрофилов (Diamond et al., 1991; Kullberg et al., 1993; Stevenhagen & van Furth, 1993; Nader-Djalal & Zadeii, 1998). Интересно, что мы наблюдали снижение почечной экспрессии IFN в инфицированных CD169-DTR почках с помощью количественной ПЦР (рис. 6А), а также с помощью анализа цитометрии (рис. 6В).

IFN-продуцирующие клетки ограничены CD19int легкой каппа-цепью плюс клеточная популяция.Затем мы попытались определить тип иммунных клеток, которые продуцируют IFN на 6-й день pi (рис. 7A). К нашему удивлению, эти клетки, продуцирующие IFN, представляют собой Ly6CintLy6Glo, F4/80loCD11blo, MHCII plus CD11clo, CD49bnegCD3neg и CD8negCD4neg, что указывает на то, что они не являются Т-лимфоцитами, классическими АПК и гранулоцитами. Вместо этого эти IFN-продуцирующие клетки, количество которых в инфицированных CD169-DTR почках заметно снижено (рис. 7B), экспрессируют MHCII, легкую каппа-цепь и CD19int, что указывает на популяцию, подобную В-клеткам (рис. 7A). . Поскольку NK-клетки являются важными модуляторами для потенцирования противогрибковых механизмов фагоцитов за счет секреции IFN при инфекциях Candida (Bhatnagar et al, 2010; Costantini et al, 2010; Bar et al, 2014; Voigt et al, 2014), мы в последний раз пытались подтвердить, что NK-клетки необходимы для регуляции продукции IFN при этой инфекции. С этой целью мы провели иммунодеплецию NK-клеток in vivo и оценили уровень экспрессии IFN в инфицированных почках на 2-й и 6-й день после заражения. Наши данные показали, что истощение NK-клеток не влияло на продукцию IFN или количество клеток, продуцирующих IFN. Рис. S4A–C).

Обсуждение

TRM опосредуют важные врожденные реакции при различных инфекционных заболеваниях и обычно определяются как F4/80hi и CD11b плюс популяции. Было показано, что сиалоадгезин, также известный как CD169, экспрессируется только подмножеством TRM в почках (Karasawa et al, 2015); однако последующих сообщений о почечном CD169 плюс TRM не поступало. Наши данные подтверждают недавние выводы о том, что почечные TRM не являются однородными, и их можно в целом разделить на две подгруппы, а именно F4/80 плюс плюс

CD11b plus (CD169 plus plus) TRM и F4/80 plus plus plus CD11b plus plus (CD169 plus ) TRM. Используя мышей CX3CR1gfp/gfp и CD169-DTR, мы пришли к выводу, что как CD169 плюс TRM, так и CD169 плюс TRM необходимы для системного иммунитета к Candida, где каждое подмножество проявляет различные функции в почечном иммунитете к Candida. В частности, CD169 плюс TRM, по-видимому, имеет жизненно важное значение для контроля роста почечной C. albicans на более поздней стадии инфекции, тогда как CD169 плюс TRM, по-видимому, имеет решающее значение для защиты почек первой линии, ограничивая рост грибков на начальной стадии инфекции. Соответственно, отсутствие CD169 плюс TRM приводило к отчетливому снижению продукции АФК в нейтрофилах и почечного IFN. Требуются дальнейшие исследования, чтобы понять механизмы функции почечного CD169 плюс TRM в контроле роста грибков и продукции IFN.

Наши данные показали, что почки являются основным органом-мишенью, в котором персистирует C. albicans, и это согласуется с предыдущими отчетами, указывающими на важность почечного иммунитета при экспериментальном диссеминированном кандидозе и последующей смертности мышей (Spellberg).

и др., 2003 г.; МакКаллум и шансы, 2005 г .; Лионакис и др., 2011 г.; Наваратна и др., 2012, 2019; Хебекер и др., 2016). В частности, несмотря на удаление TRM во всех периферических органах у мышей CD169-DTR, почки оставались единственным органом с персистенцией C. Albicans, что подчеркивает особую роль TRM в почках в системном иммунитете к Candida. Хотя почки являются основным органом-мишенью, возможно, это не всегда проявляется у людей, почечный иммунитет по-прежнему считается неотъемлемой частью устойчивости хозяина к этой инфекции, поскольку у пациентов с ослабленным иммунитетом наблюдалась серьезная почечная кандидозная инфекция (Lionakis, 2014; Сюй и Шинохара, 2017 г.). Ранее считалось, что неконтролируемый рост C. albicans в почках объясняется медленным или отсроченным рекрутированием врожденных миелоидных клеток (Lionakis et al, 2011). Однако в нашей модели инфекции мы наблюдали функциональную инфильтрацию иммунных клеток в почках мышей дикого типа. Кроме того, было описано, что CXCL1 и CCL2 в инфицированных почках WT обнаруживаются уже через 12 ч после заражения, что подтверждает быстрое привлечение врожденных миелоидных клеток (MacCallum et al, 2009). Также сообщалось, что рекрутирование иммунных клеток регулируется макрофагами, дендритными клетками, эпителиальными и эндотелиальными клетками (Netea et al, 2002; Tuite et al, 2004; Tran et al, 2015). В частности, было показано, что макрофаги рекрутируют нейтрофилы на ранней стадии инфекции посредством экспрессии CXCL2 (Kanayama et al, 2015; Xu & Shinohara, 2017). Тем не менее, у мышей CD169-DTR наблюдается такое же рекрутирование клеток в почках, как и у мышей WT, что позволяет предположить, что организация клеточной инфильтрации не инициируется и не поддерживается CD169 плюс TRM.

Недавно Karasawa et al (2015) сообщили о небольшой подгруппе почечных моноцитов Ly6Clo, находящихся в сосудистой сети, которые экспрессируют CD169 (Karasawa et al, 2015) и вместе с CD169 плюс макрофаги играют решающую роль в предотвращении чрезмерного воспаления при почечной ишемии. реперфузионное повреждение. TRM, связанные с сосудами, также были описаны в других органах, таких как кишечник (Honda et al, 2020) и жировая ткань (Silva et al, 2019), где они поддерживают тонус и целостность сосудов (неопубликованные данные); следовательно, ассоциированные с сосудами моноциты/TRM потенциально могут играть аналогичную роль в почках и способствовать прогрессированию системного кандидоза. Понимание почечных макрофагов было ограничено из-за отсутствия доступных инструментов и фенотипических маркеров для определения этих мононуклеарных фагоцитов (Gottschalk & Kurts, 2015; Kurts et al, 2020). Несмотря на попытки понять почечные макрофаги с помощью исследований по отслеживанию клонов и транскрипции (Hochheiser et al, 2013; Cao et al, 2015; Munoz et al, 2019; Liu et al, 2020; Salei et al, 2020), гораздо меньше было известны функции почечных субпопуляций TRM в контексте инфекционных заболеваний. Хотя ранее было показано, что почечные макрофаги способны напрямую ограничивать рост и инвазию C. albicans в почечные канальцы, наши данные свидетельствуют о том, что субпопуляция CD169 плюс плюс TRM не участвует в этих ранних защитных механизмах (Marcil et al, 2002; Lionakis). и др., 2013; Муньос и др., 2019). Вместо этого данные мышей CX3CR1gfp/gfp предполагают, что субпопуляция CD169 плюс TRM является основной эффекторной популяцией для обеспечения начальной защиты почек от атаки C. Albicans.

Нейтрофилы являются неотъемлемыми врожденными эффекторными клетками кандидозного иммунитета (Fulurija et al, 1996; Aratani et al, 1999; Netea et al, 2015), и пациенты, страдающие нейтропенией и дефектами нейтрофилов, подвергаются более высокому риску инвазивного кандидоза (Lionakis & Netea, 2013). Важность эффекторного пути окислительного уничтожения подчеркивается данными о том, что хроническая гранулематозная болезнь и дефицит миелопероксидазы, при которых продукция АФК нарушена в нейтрофилах, нарушают уничтожение C. albicans как у пациентов, так и у мышей (Aratani et al, 1999, 2002, Lehrer & Клайн, 1969). Соответственно, отсутствие CD169 плюс плюс TRM, которые привели к значительному снижению АФК плюс нейтрофилы и, что удивительно, не моноцитов, предполагает, что неконтролируемый рост почечной C. Albicans, вероятно, был связан со сниженной способностью нейтрофилов уничтожать грибы.

CISTANCHE УЛУЧШИТ БОЛИ В ПОЧЕКАХ

Важность IFN при системном кандидозе была хорошо показана в экспериментальной мышиной модели, где дефицит IFN у мышей с нокаутом повышает их восприимчивость к этой инфекции (Balish et al, 1998; Cenci et al, 1998; Kaposzta et al, 1998). Кроме того, было продемонстрировано, что введение IFN увеличивает фагоцитарную и грибковую способность нейтрофилов и макрофагов, что, в свою очередь, повышает устойчивость пациентов к инвазивному кандидозу (Djeu et al, 1986; Malmvall & Follin, 1993; Marodi et al, 1993). ). В нашей мышиной модели с истощением TRM мы постоянно наблюдали снижение уровня почечного IFN в отсутствие CD169 плюс TRM, что предполагает участие CD169 плюс TRM либо в инициации, либо в поддержании экспрессии IFN. Хотя защитная роль IFN при диссеминированном кандидозе очевидна, защитный ответ, опосредованный IL{8}} в этой модели, в основном, вызывает споры (Balish et al, 1998; Lavigne et al, 1998; MacCallum, 2009; Kashem et al, 2015). ; Менгеша и Конти, 2017). Тем не менее, известно, что IL17-опосредованный иммунитет имеет важное значение для орального и кожного кандидоза (Conti & Gaffen, 2010; Netea et al, 2015; Mengesha & Conti, 2017). В нашей модели удаление CD169 плюс TRM не влияло на уровень экспрессии IL17. Фактически, мы не наблюдали значительной экспрессии IL17 в инфицированных почках WT (данные не показаны). Подобно нашим наблюдениям, LeibundGut-Landmann et al (2007) сообщили о значительно более высоком количестве IFN, чем IL17, у инфицированных мышей дикого типа (LeibundGut-Landmann et al, 2007), что указывает на то, что IFN-опосредованный иммунитет более выражен при системном кандидозе. Еще одним исследованием, которое подтвердило полезную роль IFN в иммунитете к Candida, была защита, вызванная адоптивным переносом клеток Th1, продуцирующих IFN, но не клеток Th17, продуцирующих IL 17-, от системного кандидоза (Kashem et al, 2015).

В качестве первого шага к раскрытию интригующей корреляции между CD169 плюс плюс TRM, IFN и нейтрофилами наш экспериментальный эксперимент стремился выявить клеточный источник IFN в нашей модели. Было показано, что NK-клетки, являющиеся ранними продуцентами IFN, способны распознавать C. albicans и усиливать уничтожение нейтрофилов грибков посредством секреции IFN и GM-CSF (Bhatnagar et al, 2010; Bar et al, 2014; Voigt et al. и др., 2014 г.; Уитни и др., 2014 г.; Домингес-Андрес и др., 2017 г.). Кроме того, было показано, что 5–10% NK-клеток продуцируют IFN в почках, инфицированных Candida (Whitney et al, 2014). К нашему удивлению, мы не наблюдали IFN плюс NK-клетки, а также не наблюдали подавления IFN в отсутствие NK-клеток в нашей модели. Это наблюдаемое несоответствие может быть связано с оценкой клеток, продуцирующих IFN, в разные моменты времени. В частности, мы оценили продукцию IFN на 6-й день pi, момент времени, который был намного позже по сравнению с группой Уитни, то есть на 16 ч pi. Следовательно, NK-клетки могут не участвовать в поддержании продукции IFN для этой инфекции. Интересно, что Murciano et al. сообщили, что убитые дрожжи C. Albicans ингибируют высвобождение IFN NK-клетками (Murciano et al., 2006). Другой вероятной причиной расхождений мог быть экспериментальный метод, использованный для исследования секреции ИФН. В этой статье монезин, ингибитор секреции белка, вводили мышам непосредственно, а клеточную продукцию IFN впоследствии оценивали без инкубации клеток ex vivo. С другой стороны, в исследовании Whitney et al (2014) до введения ИФН

анализов, почечные клетки сначала получали и инкубировали в культуре с ингибитором секреции белка в течение 7 часов (Whitney et al, 2014). Удивительно, но другие лимфоидные и миелоидные подмножества, исследованные в нашем исследовании, в частности CD169 плюс TRM, также, по-видимому, не экспрессируют IFN, несмотря на исследования, сообщающие о прямой секреции IFN макрофагами (Bogdan & Schleicher, 2006). Вместо этого наши данные предполагают, что основные производители IFN ограничены популяцией B-подобных клеток. Интересно, что аналогичная субпопуляция врожденных В-клеток, продуцирующих IFN, имеет жизненно важное значение для регуляции и инициации раннего врожденного иммунного ответа на внутриклеточные бактериальные инфекции (Bao et al, 2014; Krocova et al, 2020). Кроме того, в других предшествующих работах было показано, что зрелые В-клетки при стимуляции Т-клетками и стимуляции патогенами или лигандами TLR могут секретировать IFN (Gray et al, 2007; Lund & Randall, 2010). Хотя ось В-клетки-ИФН не является редкостью при микробных инфекциях, срочно необходимы будущие исследования, чтобы всесторонне профилировать эту популяцию почечного ИФН плюс В-клетки и определить ее связь с CD169 плюс TRM в почках. Таким образом, мы пришли к выводу, что почечные TRM можно разделить на две основные популяции на основе экспрессии CD169. Что еще более важно, эти два подмножества обладают неповторяющимися защитными функциями при диссеминированном кандидозе, что дает представление о клеточной основе защитного врожденного иммунитета хозяина против C. Albicans. Эти открытия должны быть полезны при разработке терапевтических вмешательств в будущем.

Материалы и методы

МышиТрансгенные мыши CD169-DTR были созданы в нашей лаборатории на генетическом фоне BALB/c, как описано ранее (Purnama et al, 2014), а затем скрещены с C57BL/6 в течение 10 поколений. Мыши CX3CR1gfp/gfp были приобретены в лаборатории Джексона. Трансгенных мышей CD169-DTR C57BL/6 вместе с WT C57BL/6 разводили и содержали в специфических свободных от патогенов условиях в виварии Наньянского технологического университета (NTU). Самцов мышей (возраст 7–10 недель) использовали для заражения Candida. Все эксперименты были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных под номером ARF-SBS/NIE A-0380AZ.

инфекция C. albicansКлинический изолят штамма C. Albicans SC5314 культивировали на чашке с дрожжевым экстрактом, пептоном и декстрозой (YPD) в течение 24 часов при 30°С, а затем в течение 16–18 часов в среде YPD. Суспензию C. albicans центрифугировали, промывали и подсчитывали. Для заражения каждой мыши внутривенно вводили 5×104 КОЕ C. albicans. Для лечения rIFN инфицированным мышам ежедневно вводили 10 000 U рекомбинантного IFN (R&D Systems). За мышами ежедневно наблюдали и взвешивали в течение инфекции. Опосредованную дифтерийным токсином и опосредованную антителами аблацию DT (10 нг/г массы тела) готовили в PBS с добавлением 1% мышиной сыворотки. Мышам CD169-DTR и WT внутрибрюшинно вводили DT в соответствии со схемой заражения (рис. S1).

Для истощения NK-клеток мышам ежедневно вводили внутрибрюшинно 100 мкг антимышиного NK1.1 (PK136; Invivomab) антитела.

Анализ грибковой нагрузкиМозг, сердце, легкие, печень, почки и селезенку собирали в указанные моменты времени заражения, взвешивали и измельчали ​​перед инкубацией с 1 мг/мл коллагеназы D в пищеварительной среде в течение 1 ч при 37°С. Образцы повторно ресуспендировали до исчезновения видимых агрегатов. Проводили серийное разведение и высевали на планшеты YPD. Планшеты инкубировали в течение 48 ч при 30°С. КОЕ определяли путем ручного подсчета колоний. Грибковую нагрузку выражали в КОЕ на грамм органа.

Сбор тканей, обработка и выделение суспензии одиночных клетокПочки собирали, измельчали ​​и инкубировали с 1 мг/мл коллагеназы D в среде для переваривания в течение 1 ч при 37°С. Измельченные почки многократно пипетировали вверх и вниз до тех пор, пока не исчезали видимые агрегаты. После центрифугирования при 330 g в течение 5 минут клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл 35% Percoll (GE Healthcare Life Science) и центрифугировали при 600 g в течение 15 минут. Супернатанты удаляли, а клеточные осадки ресуспендировали в буфере для лизиса эритроцитов ({9}} мл). После лизиса клеточные суспензии центрифугировали и ресуспендировали с 2% IMDM. Суспензии одиночных клеток хранили при 4 градусах до дальнейшего использования. Для подсчета клеток с помощью гемоцитометра подсчитывали небольшие аликвоты клеточных суспензий, предварительно смешанных с трипановым синим. Для сортировки клеток суспензии одиночных клеток почек инкубировали с крысиными антимышиными CD16/32 (2.4G2, 1 мг/мл), а затем с флуоресцентными антителами FL к поверхностным антигенам мыши CD45 (30F11), F4/80 (BM8), и CD11b (М1/70). Окрашенные клетки промывали один раз и пропускали через фильтр 40- мкм перед сортировкой на 4-лазерном сортировщике клеток BD FACSAria II (BD Bioscience).

Анализы проточной цитометрии. Суспензии одиночных клеток инкубировали с крысиным антимышиным CD16/32 (2,4G2, 1 мг/мл) при 4 градусах в течение 15 минут (1:1 00) в буфере FACS. (PBS с добавлением 2 процентов FCS) для блокирования рецепторов Fc. Для окрашивания поверхностных антигенов клетки инкубировали с конъюгированными с флуорохромом антителами против мышиных CD45 (30F11), F4/80 (BM8), CD11b (M1/70), Ly6G (1A8) и Ly6C (HK1.4) при 4 градусов за 20 мин. Окрашенные клетки однократно промывали и ресуспендировали в буфере FACS для регистрации на пятилазерном BD LSRFortesssa X-20 (BD Biosciences). Для обнаружения внутриклеточного цитокина IFN из мышей, получавших блокатор секреции белка монензин, готовили суспензии почечных одиночных клеток в соответствии с протоколом (Sun et al, 2009). Вкратце, каждой мыши внутривенно вводили 250 мкл PBS, содержащего 100 мкг монензина (M5273; Sigma-Aldrich), за 5 ч до выделения органов и последующего приготовления суспензий одиночных клеток почек. Клетки инкубировали с крысиным антителом против CD16/32 мыши с последующим окрашиванием флуоресцентными антителами против поверхностного антигена мыши CD45 (30F11), CD11b (M1/70), F4/80 (BM8), Ly6G (1A8), Ly6C (HK1). .4), CD3ε (145-2C11), CD49b (HMa2), CD19 (1D3), CD4 (GK1.5), CD8 (53,6–7), CD11c (N418), MHCII (M5/114.15.2 ) и легкой цепи lg κ (RMK-45). Окрашенные клетки однократно промывали FACS-буфером с последующей фиксацией (2% PFA) и пермеабилизацией (0,05% сапонина) перед инкубацией с антителом против IFN (1:500; BioLegend) в 0,05% растворе сапонина. Окрашенные клетки однократно промывали и ресуспендировали в буфере FACS для регистрации на пятилазерном BD LSRFortesssa X-20 (BD Bioscience). Для выявления клеточной гибели и апоптоза суспензии одиночных клеток почек сначала инкубировали с крысиными антимышиными антителами к CD16/32 с последующим окрашиванием флуоресцентными антителами к поверхностным антигенам мыши CD45 (30F11), CD49b (HMa2), CD3ε ({{101 }}C11), CD11b (M1/70), Ly6G (1A8) и Ly6C (HK1.4). Окрашенные клетки промывали один раз буфером FACS и 1x буфером для связывания аннексина V (BioLegend) перед инкубацией с аннексином V, конъюгированным с FITC, в соответствии с инструкциями производителя (BioLegend). Окрашенные клетки однократно промывали и ресуспендировали в 1× буфере аннексина V, содержащем йодид пропидия (PI, 1 мкг/мл), перед получением на пятилазерном анализаторе BD LSRFortessa X-20 (BD Bioscience).

Анализ обнаружения АФКСуспензии одиночных клеток промывали и инкубировали с 2,5 мкг/мл H2DFFDA, с 100 мкг/мл зимозана или без него, в течение 60 мин при 4° или 37°. Затем клетки дважды промывали IMDM 2% и окрашивали меченными флуорохромом антителами при 4 градусе в течение 20 мин. Окрашенные клетки промывали и ресуспендировали в буфере FACS, содержащем PI, для сбора данных на пятилазерном BD LSRFortessa X-20 (BD Bioscience). Данные нормализовали на основе соответствующих клеток, инкубированных при 4 градусах.

Креатинин сывороткиСыворотки крови собирали у мышей на 10-й день pi. Уровни креатинина в сыворотке определяли количественно с использованием набора ELISA для мышиного Cr (креатинина) (Elabscience) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ синего ЭвансаПроницаемость кровеносных сосудов оценивали по Radu и Chernoff (2013). Вкратце, неинфицированным и инфицированным мышам WT и CD169-DTR вводили внутривенно 200 мкл 0,5% синего Эванса/PBS. Через 30 минут мышей подвергали эвтаназии, их органы собирали, взвешивали и инкубировали в 100%-ном формамиде в микроцентрифужных пробирках в течение 48 часов. Формамид, насыщенный синим Эванса (0,5 мл), переносили в одноразовые полистироловые кюветы без переноса каких-либо кусочков ткани. Регистрировали поглощение при 610 нм, и эти значения нормализовали по массе органов.

Гистологические анализыДля иммунофлуоресцентного окрашивания собранные почки заливали смесью Optimal Cutting Temperature (OCT Tissue Tek) и хранили при температуре -80°С. Делали срезы 6- мкм и фиксировали в ацетоне в течение 10–15 мин. Срезы инкубировали с Fc-блоком в течение 20 мин, отмывали и инкубировали с флуоресцентными антителами к FL в течение 1 ч. Затем промытые срезы монтировали с помощью флуоресцентной монтажной среды DAKO FL. Изображения были получены с использованием микроскопа Nikon Eclipse 80i при 20-кратном увеличении объектива. Для окрашивания H&E и PAS выбракованных мышей перфузировали 4% PFA (Sigma-Aldrich). Собранные почки инкубировали в 4% PFA в течение 24 ч при комнатной температуре, обезвоживали и заливали в парафин (Paraplast Plus; Leica). Блоки, залитые парафином, затем разрезали на срезы размером 6- мкм. Срезы депарафинизировали в ксилоле в течение 20 мин и регидратировали. Для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) срезы окрашивали модифицированным раствором Майера гематоксилином (Abcam) и докрашивали эозином (Sigma-Aldrich). После очистки ксилолом срезы монтировали с помощью DPX Mountant (SigmaAldrich). Для окрашивания PAS срезы инкубировали с раствором периодической кислоты (Abcam), промывали и окрашивали раствором Шиффа (Abcam). После этого срезы докрашивали модифицированным раствором Майера гематоксилином (Abcam). После очистки ксилолом срезы монтировали с помощью среды DPX (Sigma-Aldrich). Изображения были получены с использованием микроскопа Eclipse 80i (Nikon) с цифровым прицелом DS-U3 (Nikon) и программным обеспечением NIS-Elements D (Nikon) при увеличении 4×10×, 20× и 100×.

Количественная ПЦР в реальном времениСобранные почки немедленно гомогенизировали в TRIzol (Thermo Fisher Scientific) с использованием гомогенизатора (CAT X360). РНК экстрагировали в соответствии с инструкциями производителя (набор RNAsimple Total RNA; Tiangen Biotech Ltd). Синтез одноцепочечной кДНК из очищенной РНК проводили в соответствии с инструкциями производителя (обратная транскриптаза Promega M-MLV). ПЦР в реальном времени проводили в соответствии с инструкциями производителя с использованием протокола Primerdesign Precision FAST (Primerdesign Ltd). Последовательности праймеров были следующими: CXCL1; Вперед: ACTGCACCCAAACCGAAGTC, ред.: TGGGGACACCTTTTAGCATCTT. CXCL2; Передний: ACAGAAGTCATAGCCACTCTC, ред.: CCTTGCCTTTGTTCAGTATC. ССL2; Передний: CATCCACGTGTTGGCTCA, ред.: GATCATCTTGCTGGTGAATGAGT. ФНО-; Передний: TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG, ред.: GGTCTGGGCCATA GAACTGA. Г-КСФ; Передний: GTGCTGCTGGAGCAGTTGT, ред.: TCGGGATCCCCAGAGAGT. ГМ-КСФ; Вперед: GCATGTAGAGGCCATCAAAGA, ред.: CGGGTCTGCACACATGTTA. М-КСФ; Вперед: GGTGGAACTGCCAGTA TAGAAAG, ред.: TCCCATATGTCTCCTTCCATAAA. ИЛ10; Передний: CAGAGCCACATGCTCCTAGA, ред.: TGTCCAGCTGGTCCTTTGTT. ИКАМ-1; Передний: AGTCCGCTGTGCTTTGAG, ред.: AGGTCTCAGCTCCACACT. VCAM-1; Передний: TCTTACCTGTGCGCTGTGAC, ред.: ACTGGATCTTCAGGGAAT GAGT. КИМ-1; Вперед: AGATACCTGGAGTAATCACACTGAAG, ред.: TGA TAGCCACGGTGCTCA. CD169; Передний: GCTGATACTGGCTTCTACTTCT, ред.: AGGTGGTCAGGTCTGGAGTAA. ИФН-; Передний: CACGGCACAGTCATTGAAAG, ред.: CCAGTTCTCCCAGATATCCAAG. -актин; Передний: AAGGCCAACCGTGAAAAGAT, ред.: CTGTGGTACGACCAGAGGCATACA. hHB-EGF; Передний: ATGACCACACAACCATCCTG, ред.: CCAGCAGACAGACAG ATGACA