joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

IL-22-опосредованное метаболическим перепрограммированием почек через PFKFB3 для лечения повреждения почек

Вэй Чен и др.

Графическая абстракция

IL-22 затухаетпочкаранапосредством метаболического перепрограммирования почечных ТЭК, регулирует функцию митохондрий и гликолиз в поврежденных ТЭК, а также уменьшает накопление митохондриальных АФК и дисфункциональных митохондрий посредством индукции активности AMPK/AKT и PFBFK3. улучшениепочкаранаIL-22 посредством регуляции релевантной для метаболизма передачи сигналов подтверждено на животных моделях индуцированного цисплатином повреждения почек и диабетической нефропатии.

Абстрактный

Повреждение почек инициирует ухудшение метаболических состояний в клетках канальцев, что приводит к развитию терминальной стадии почечной недостаточности (ESTD). Интерлейкин-22 (IL- 22) является эффективным терапевтическим антидотом дляпочкаранапутем содействия восстановлению почек, но мало что известно о лежащих в основе молекулярных механизмах. Здесь мы сначала предоставляем доказательства того, что IL-22 ослабляетпочкаранапосредством метаболического перепрограммирования эпителиальных клеток почечных канальцев (ТЭК). В частности, наши данные свидетельствуют о том, что IL-22 регулирует функцию митохондрий и гликолиз в поврежденных TEC. Дальнейшие наблюдения показывают, что IL-22 облегчает накопление митохондриальных активных форм кислорода (АФК) и дисфункциональных митохондрий посредством индукции передачи сигналов AMPK/AKT и активности PFBFK3. У мышей улучшениепочкаранаи некроз и улучшение функций почек посредством регуляции этих сигнальных путей, соответствующих метаболизму, и митохондриальная приспособленность рекомбинантного IL-22 сертифицированы на животных моделях индуцированного цисплатином повреждения почек и диабетической нефропатии (ДН). Взятые вместе, наши результаты раскрывают новое механистическое понимание защитного действия IL-22 на почки и подчеркивают терапевтические возможности IL-22 и вовлеченных метаболических регуляторов при различных заболеваниях почек.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВАинтерлейкин-22,почкарана, метаболическое перепрограммирование, митохондриальная дисфункция

Цистанхетрубчатыйпредотвращает заболевание почек, нажмите здесь, чтобы получить образец

1. ВВЕДЕНИЕ

Острыйпочкарана(ОПП), общая проблема общественного здравоохранения, связанная с высокой смертностью и заболеваемостью, затрагивающая миллионы госпитализированных пациентов во всем мире и демонстрирующая быстрорастущую заболеваемость. эпителиальные клетки канальцев (TEC), особенно в проксимальных канальцах. 4–7 Различные виды литературы подтверждают, что их тяжелое и устойчивое повреждение часто вызывает неполное и неадекватное восстановление тканей, что приводит к воспалительной реакции, дегенерации канальцев, фиброзу почек и, в конечном итоге, к прогрессированию терминальная стадия почечной недостаточности (ESTD).8–10 К сожалению, кроме поддерживающей терапии на основе диализа, нет хорошо зарекомендовавших себя терапевтических средств дляпочкаранадоступны. Таким образом, активное лечение крайне необходимо для уменьшения страданий, которые оно причиняет пациентам, и значительного финансового бремени пациентов.почкаранак личности и обществу.

Интерлейкин-22 (IL-22), важный представитель цитокинов семейства IL-10, недавно привлек огромное внимание в качестве агента выживания при многочисленных заболеваниях, вызванных повреждением эпителия.11–13 IL -22 обеспечивает защиту тканей и гомеостаз в первую очередь за счет активации сигнального пути STAT3 и стимуляции эпителиальной пролиферации.14,15 Важно отметить, что исследования показали, что экспрессия IL-22R1 ограничивается проксимальными ТИК почек. , а лечение IL-22 может защитить от повреждения почечного эпителия и ускорить регенерацию канальцев.почкарана, мало что известно об основных механизмах восстановления TEC, индуцированных IL{0}}. Понимание молекулярной основы IL-22 важно как для изучения того, как IL-22 ингибирует ОПП или ESTD, так и для обнаружения молекулярных модификаторов, а также важнейших процессов, участвующих в предотвращении повреждения почек.

Восстановление почек после повреждения является метаболически зависимым и сложным процессом.18 Недавние данные указывают на то, что сигнатуры клеточного метаболизма могут регулировать выживаемость и пластичность почечных клеток и, таким образом, дают полезную информацию о том, как метаболические процессы контролируют восстановление тканей.19,20 В частности, эти результаты. показывают, что метаболическое перепрограммирование с помощью PGC1 или системы S-нитрозо-КоА-редуктазы защищает отпочкарана. Механически повышенный гликолиз и окислительное фосфорилирование (OXPHOS) могут способствовать росту и защитным сигнальным путям или могут обеспечивать более высокие энергетические потребности митоза и анаболического биосинтеза во время восстановления органов.19,21 Недавно наши исследования показали, что IL -22 облегчает митохондриальная дисфункция в печени, которая включает клеточные метаболические процессы.22,24 Таким образом, мы задаемся вопросом, защищает ли IL-22 от повреждения почек и апоптоза посредством регулирования их метаболических состояний. Чтобы определить механизмы восстановления почек, опосредованного IL -22, мы обрабатывали эпителиальные клетки проксимальных канальцев человека (PTEC) стрессовой стимуляцией. Мы предполагаем, что IL -22 управляет метаболическим перепрограммированием для усиления гликолиза и OXPHOS, которые предотвращают дисфункцию TEC. Далее мы демонстрируем, что IL-22 индуцирует эту программу посредством активации передачи сигналов AMPK/AKT и ее молекулярных модификаторов для облегчения митохондриальной дисфункции. Наши наблюдения проливают свет на регулирование метаболических состояний для лечения и профилактики заболеваний почек и дают новые идеи для разработки эффективных новых вмешательств при повреждении органов в целом.

Цистанхе может лечитьпочкарана

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Реагенты

Олигомицин, ротенон и цианид п-трифторметоксифенилгидразона (FCCP) были получены от Sea Horse Biosciences; рекомбинантный IL-22 был предоставлен Novoprotein (Китай); цисплатин (Crisp.), MitoTrackerGreen, LY294002, 5,5',6,6'-тетрахлор-1,1',3,3'-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианинйодид (JC-1) и соединение C. от Beyotime Biotechnology (Китай); антитела, нацеленные на Glut1, -Actin, p-AMPK, AMPK и GAPDH, были приобретены у Abcam; антитела к STAT3, p-STAT3 (Y705), AKT, p-AKT (S473), PFKFB3 и каспазе-3 были приобретены у Cell SignalingTechnology; рапамицин, пальмитиновая кислота (Palm.), Z-VAD-FMK и глюкоза были получены от Sigma-Aldrich; MitoSOX, Hoechst33342, MitoTracker Red и PKH26 были получены от Invitrogen.

2.2 Культура клеток

Эпителиальные клетки проксимальных канальцев человека (HK{{0}}) были получены из банка клеток Шанхайского института биохимии и клеточной биологии Китайской академии наук и содержались в соответствии со стандартными протоколами. HK-2 высевали в шестилуночные планшеты (1 × 106 клеток/лунку) или 96-луночные планшеты (1 × 105 клеток/лунку) и культивировали в 90-процентной среде RPMI1640 (Gibco) с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10-процентной фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Gibco). Сначала мы инкубировали HK-2 с IL-22 (0,5 мкг/мл) в течение 0,5 ч, затем 50 мМ d-глюкозы или 5 мкг/мл цисплатина, или 0,2 мМ пальмитиновой кислоты, или 4 мкМ доксорубицина (DOX ) в течение 24 часов. В некоторых случаях клетки культивировали в присутствии Z-VAD-FMK (10 мкМ), соединения C (5 мкМ), LY294002 (20 мкМ) или рапамицина (50 нМ) в течение указанного времени.

2.3 Эксперименты с морскими коньками

Мы проанализировали TEC с помощью анализатора внеклеточного потока Seahorse XF96 на предмет изменений скорости внеклеточной кислоты (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR). Вкратце, HK-2 (1 × 105) выращивали в течение ночи на 96-луночных планшетах Seahorse. Затем мы промыли клетки аналитической средой морского конька, содержащей 1 мМ пирувата, 10 мМ глюкозы и 2 мМ глутамина (или без глюкозы для тестирования ECAR) в атмосфере без CO2 при 37°C в течение {{18 }}.5 ч. Экспериментальные данные регистрировали после введения нижеперечисленных ингибиторов в оптимальной концентрации FCCP (1,0 мкМ), олигомицина (1,0 мкМ), ротенона/антимицина А (0,5 мкМ), 2-DG (50 мкМ). мМ) или глюкоза (10 мМ).

Цистанхе может лечитьповреждение почек

2.4 Модели мышей и животных

Самцов мышей BALB/c (6–8 недель) приобретали у Slaccas Experimental Animal Co. (Шанхай, Китай). Мыши Db/db и Db/m были предоставлены Исследовательским центром модельных животных Нанкинского университета (Нанкин, Китай). Все мыши содержались в помещениях, свободных от патогенов (SPF), и выращивались в соответствии со стандартными протоколами. Для модели ОПП мыши BALB/c получали цисплатин (20 мг/кг) или контрольный физиологический раствор путем внутрибрюшинной инъекции. Мышей Db/db кормили диетой с высоким содержанием жиров (HFD) в указанные моменты времени, чтобы вызвать диабетическую нефропатию (DN). В качестве контрольной группы мышей линии Db/m кормили обычным кормом. В экспериментах на животных с ОПП ИЛ -22 вводили внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг/кг/сут или 1,5 мг/кг/сут в течение 4 дней подряд. В экспериментах на животных с DN IL-22 вводили внутрибрюшинно в дозе 2,5 мг/кг два раза в неделю в течение восьми последовательных недель. Контрольные мыши получали соответствующее количество PBS. Наши экспериментальные процедуры на животных проводились в соответствии с протоколами, оцененными и одобренными Комитетом по этике ухода и использования животных Фармацевтической школы Университета Фудань. Иммуногистохимическое окрашивание, измерение потенциала митохондриальной мембраны, гистологическое окрашивание и окрашивание активных форм кислорода (АФК) срезов почек выполняли, как описано ранее.22–24.

2.5 ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК получали с помощью реагентов TRNzol (Beyotime Biotechnology, Китай) из образцов клеток или тканей, а затем транскрибировали их в кДНК с помощью набора для тестирования обратной транскриптазы MMLV (Beyotime Biotechnology). Уровень экспрессии мРНК анализировали с помощью инструментов ПЦР в реальном времени (BioRad) с использованием набора для анализа SYBR green qPCR-mix (Beyotime Biotechnology) и стандартизировали по GAPDH.

2.6 Проточная цитометрия

Клетки почек выращивали и обрабатывали, как описано выше. Окрашивание MitoSOX (митохондриальные АФК), MitoTracker Green (общая митохондриальная масса) и MitoTracker Red (потенциал митохондриальной мембраны) проводили в соответствии с инструкциями производителя и предыдущими исследованиями.22–24 Мы получили результаты с помощью проточного цитометра Beckman Coulter и Программное обеспечение CytExpert (BD Biosciences).

2.7 Поглощение глюкозы

Мы измерили концентрацию глюкозы в супернатанте клеточной культуры с помощью теста анализа поглощения глюкозы в соответствии с протоколом производителя и предыдущими исследованиями (GAHK20; Sigma). Нормализация результатов проводилась по количеству клеток.

2.8 Нокдаун генов

Мы использовали малую интерферирующую РНК (миРНК; RiboBio, Китай) для нокдауна специфических генов. Сначала Lipofectamine RNAiMAX и siRNA (100 пмоль) осторожно смешивали с помощью пипетки и инкубировали при 37°C в течение 0,5 ч. Затем мы заменили стандартную среду для культивирования клеток смесью для трансфекции и инкубировали клетки в течение 6 часов для трансфекции гена siRNA. Затем мы заменили коктейль для трансфекции на свежую среду для культивирования клеток. Через 48 ч клетки почек инкубировали с IL-22 для дальнейших исследований.

Цистанхе может лечитьповреждение почек

2.9 Вестерн-блот

Мы экстрагировали суммарные белки из клеток или тканей буфером для лизиса RIPA (Beyotime Biotechnology, Китай). Затем лизаты собирали центрифугированием при 4°С при 12 000 об/мин в течение 10 мин. Затем лизаты нагревали с буферами для образцов при 100 ◦ C в течение 15 мин, подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и электропереносом на поливинилидендифторидную (PVDF) мембрану (Millipore, Германия). Затем мембраны блокировали 5-процентным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 2 ч и совместно инкубировали с первичными антителами при 4°С в течение ночи. После трехкратной промывки мембраны инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (CST, США). Белковые пятна визуализировали с помощью системы визуализации с улучшенной хемилюминесценцией.

2.10 Иммунофлуоресценция

Клетки почек фиксировали 3-4-процентным раствором параформальдегида и пермеабилизировали с помощью 0,1% Triton X-100. Затем мы блокировали клетки 5-процентным БСА на 2 часа. Клетки инкубировали в течение ночи с антителом против GLUT1 при 4°С, четыре раза промывали и затем окрашивали PKH26. Затем клетки почек окрашивали Hoechst 33342 и помещали на предметные стекла. Данные были получены с помощью конфокальной микроскопии.

2.11 РНК-секвенирование и биоинформатика

Образцы TEC (2 × 107) лизировали и выделяли общую РНК с использованием мини-набора RNeasy в соответствии с протоколами производителя (Beyotime, Шанхай, Китай). Секвенирование эукариотической РНК было выполнено с использованием технологии секвенирования нового поколения (NGS) в системе секвенирования Illumina HiSeq, обеспечивающей 50-базовую длину считывания. Выравнивание считываний секвенирования было выполнено с использованием TopHat v2.0.12 относительно сборки UCSC mm10. Анализ дифференциальной экспрессии рассчитывали с использованием пакета DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html), а анализ статистической значимости выполняли в R (v3.1.1; http://www. .r-project.org/). Сверхпредставление путей было выполнено с использованием пакета R ReactomePA.

2.12 Статистика

Данные выражали как среднее ± стандартное отклонение (SD) и отображали с помощью GraphPad Prism 5.0. Для результатов, сравнивающих две или более групп, рассчитывали различия с использованием критерия Стьюдента или однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA): ***p < 0.00="" 1,="" **р="">< 0,01="" и="" *р=""><>

Цистанхе может лечитьповреждение почек

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 IL-22 сохраняет клеточный метаболизм в ТИК

Поскольку предполагалось, что митохондрии являются важными органеллами, интегрирующими клеточный метаболизм и процессы апоптоза, мы оценили функцию митохондрий в ТИК, которые стимулировали с помощьюпочкаранафакторам и лечили IL-22.25 Как показано на рис. 1A–D, митохондриальная базальная скорость потребления кислорода (OCR), максимальная дыхательная способность (MRC) и дыхание были существенно заблокированы в TEC в стрессовых ситуациях. Примечательно, что эти аномалии в значительной степени предотвращались лечением IL- 22. Гликолиз в поврежденных TEC, о чем свидетельствует скорость внеклеточного подкисления (ECAR), также был заметно ограничен по сравнению с IL -22 плюс стимулированные TEC (рис. 1B и E). Мы также продемонстрировали, что скомпрометированное окислительное фосфорилирование (OXPHOS) и гликолиз в поврежденных TEC не были вторичными эффектами апоптоза при совместном лечении ингибитором пан-каспазы (рис. S1). А репаративные эффекты, опосредованные ИЛ -22-, на метаболические дефекты были специфичны для почечных ТИК (рис. S2). Кроме того, IL-22 стимулировал OXPHOS и гликолиз клеток HK2 в отсутствие стимулов, что указывает на то, что эффекты IL-22 на метаболические пути не были специфичны для поврежденных TEC (рис. S3). Более того, наши результаты также показали, что IL-22 способствует экспрессии и транслокации IL-22R1. Между тем, фосфорилирование STAT3 и эффекты метаболического перепрограммирования IL-22 были полностью обезврежены нокдауном IL-22R1 (рис. S4). Эти данные свидетельствуют о том, что IL-22 восстанавливает метаболическое состояние TEC посредством непосредственной активации IL-22R1. Поскольку множество доказательств предполагало, что Glut1 играет основную роль в гликолизе и гомеостазе глюкозы, 26 мы, следовательно, спросили, влияет ли IL -22 на транслокацию или экспрессию Glut1. Как и ожидалось, мы продемонстрировали, что IL -22 не только способствует перемещению Glut1 на поверхность клеточной мембраны (PKH26) и экспрессии Glut1, но также увеличивает поглощение глюкозы (рис. 1F и G). В целом, эти наблюдения показали, что IL -22 может усиливать OXPHOS и гликолиз в поврежденных TEC.

РИСУНОК 1 IL-22 сохраняет приспособленность митохондрий и гликолиз в TEC. (A и B) Мы используем анализатор внеклеточного потока Seahorse XF96 для проверки изменений скорости внеклеточной кислоты (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR) TEC. OCR и ECAR в ТИК, инкубированных с 50 мМ глюкозы, или 5 мкг/мл цисплатина, или 0.2 мМ пальмитиновой кислоты, или 4 мкМ DOX в присутствии или отсутствии IL{{8} }. (C) Максимальная дыхательная способность (MRC) TEC, оцененная по изменениям OCR в реальном времени. (D и E) Кривые OCR и ECAR TEC после инкубации с олигомицином, FCCP, глюкозой, ротеноном и {{10}}DG. (F) Локализация и экспрессия ядер (синий), Glut1 (зеленый) и плазматической мембраны (красный) в ТИК. (G) Потребление глюкозы в ТИК после лечения IL-22 в течение 24 часов. п=3; масштабные линейки, 20 мкм; критерий Стьюдента (непарный); ***р < 0,001,="" **р="">< 0,01,="" *р=""><>

3.2 IL-22 улучшает накопление дисфункциональных митохондрий в TEC посредством активации митофагии

формирование точек LC3 в ТИК после воздействия раздражителей (рис. 2F). Затем мы истощили митофагию, чтобы оценить ее функцию в метаболизме клеток канальцев с помощью siRNA-ATG5 (рис. S6). Наши данные свидетельствуют о том, что истощение митофагии в TEC значительно ингибирует защитные эффекты IL-22 в сохранении митохондриальной приспособленности (рис. 2E), указывая на то, что IL-22 предотвращает митохондриальную дисфункцию посредством активации митофагии.

РИСУНОК 2 IL-22 ингибирует митохондриальную дисфункцию и накопление митохондриальных АФК посредством индукции митофагии. (A) Митохондриальная масса была окрашена и оценена с помощью MitoTracker Green и проточной цитометрии. Митохондриальные АФК оценивали в ТИК, окрашенных MitoSOX (B). Потенциал митохондриальной мембраны оценивали в ТИК, окрашенных MitoTracker Green и MitoTracker Red (C); накопление АФК в митохондриях оценивали с помощью MitoTracker Green и MitoSOX (D). (E) Результаты конфокального изображения свидетельствуют о продукции митохондриальных АФК, меченных MitoSOX. (F) Репрезентативные микроскопические изображения показали образование точечной LC3-GFP в присутствии или отсутствии IL-22 TEC, стимулированных как (A) в течение 24 часов. (E) OCR оценивали в присутствии или отсутствии IL-22 и siRNA-ATG5 в течение 24 часов. п=3; критерий Стьюдента (непарный); ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.3 IL-22 поддерживает митохондриальную целостность TEC посредством активации передачи сигналов AMPK/AKT

Передача сигналов AMPK как ключевого сигнального узла, связывающего выживание клеток и метаболизм, контролирует метаболизм глюкозы, синтез липидов и функцию митохондрий. В соответствии с защитным действием интерлейкина -22 на почки, опосредованным метаболическим перепрограммированием TEC, мы оценили, IL -22 регулирует целостность митохондрий посредством активации передачи сигналов AMPK. Мы обнаружили, что IL-22 увеличивает активность передачи сигналов STAT3/AMPK/AKT в поврежденных TEC, о чем свидетельствует фосфорилирование STAT3, AMPK и AKT (рис. 3А). Кроме того, эти процессы были заблокированы в канальцевых клетках, лишенных STAT3, что продемонстрировало, что IL-22 регулирует передачу сигналов AMPK/AKT через STAT3 (рис. 3B и C; рис. S7). Далее мы инкубировали TEC с соединением C и LY294002 для непосредственного ингибирования передачи сигналов AMPK/AKT, а затем оценивали их митохондриальные функции и состояние метаболизма. Результаты показали, что совместное лечение этими сигнальными ингибиторами значительно предотвращало улучшение OXPHOS и гликолитического потока, вызванное лечением IL-22 (рис. 3D-I), что позволяет предположить, что IL-22 способствует метаболизму TEC посредством активации AMPK. /AKT сигнальный путь.

РИСУНОК 3. Индукция передачи сигналов AMPK/AKT с помощью IL-22 поддерживает приспособленность митохондрий. TEC стимулировали 50 мМ глюкозой, или 5 мкг/мл цисплатином, или 0,2 мМ пальмитиновой кислотой, или 4 мкМ DOX в присутствии или в отсутствие IL-22, соединение C или LY294002 в указанное время. (A и B) Активацию сигнального пути AMPK/AKT в TEC или STAT3-WT и STAT3-KD TEC оценивали с помощью вестерн-блоттинга. (C и D) Были проанализированы изменения в OCR и ECAR TEC. (E) Активацию сигнального пути AMPK/AKT в TEC оценивали с помощью вестерн-блоттинга. (F-I) Изменения в OCR и ECAR TEC были измерены в TEC по сравнению с TEC, обработанными соединением C и LY294002. критерий Стьюдента (непарный); п=3; ***р < 0,001,="" **р="">< 0,01,="" *р=""><>

3.4 ИЛ-22 сохраняет клеточный метаболизм и митохондриальную целостность ТИК посредством индукции PFKFB3

Кроме того, чтобы изучить, как улучшилась митохондриальная приспособленность и метаболизм TEC, мы использовали анализ секвенирования РНК (RNA-seq) для оценки экспрессии генов после повреждения стимулами и лечения IL-22. Мы продемонстрировали, что несколько генов были значительно изменены в TEC после инкубации IL -22 (рис. 4A). Используя доступные базы данных, был проведен анализ обогащения набора генов этих генов с повышенной регуляцией, который показал значительное обогащение генов в сигнальном пути AMPK и в сигнальном пути мишеней MYC (рис. S8). Примечательно, что PFKFB3 в значительной степени индуцировался IL-22 среди генов во времяпочкаранафакторы стимуляции (рис. 4А). Эти наблюдения также были подтверждены конфокальными изображениями, Q-PCR и вестерн-блоттингом. Высокая экспрессия PFKFB3 зависела от передачи сигналов AMPK/AKT (рис. 4B и C; рис. S9).

Предыдущие исследования предполагали, что PFKFB3 может регулироваться многочисленными сигнальными трансдукциями для ускорения эпителиальной регенерации и восстановления после повреждения. Таким образом, мы предположили, что IL -22 индуцирует PFKFB3 для сохранения клеточного метаболизма TEC и поддержания их митохондриальной пригодности. . Мы заметили, что ингибирование передачи сигналов AMPK/AKT снижает экспрессию PFKFB3 (рис. 4D). Итак, мы заглушили PFKFB3 для дальнейшего изучения его функций в ТИК после инкубации с IL-22. Наши результаты показали, что заглушенный PFKFB3 ослаблял эффекты метаболического перепрограммирования IL -22 на восстановление ECAR и OCR (рис. 4E и F) и предотвращал поглощение глюкозы, а также дисфункцию митохондрий (рис. 4G и H). Кроме того, мы также продемонстрировали, что метаболические эффекты перепрограммирования IL-22 полностью обезвреживаются нокдауном STAT3-, в то время как сверхэкспрессия PFKFB3 может спасти эти фенотипы, предполагая, что IL-22 восстанавливает метаболическое состояние поврежденных эпителиальных клеток почек путем прямого нацеливания на передачу сигналов STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3 (рис. S10). В совокупности эти данные указывают на то, что активация PFKFB3 играет важную роль в приспособленности митохондрий и элиминации дисфункциональных митохондрий послепочкарана.

РИСУНОК 4 IL-22 поддерживает митохондриальную целостность и клеточный метаболизм TEC посредством индукции PFKFB3. (A) График вулкана для экспрессии генов в TEC, стимулированных глюкозой, цисплатином, пальмитиновой кислотой или CCl4 в присутствии или в отсутствие IL -22 в течение 24 часов. (B) Данные конфокальной микроскопии продемонстрировали сверхэкспрессию PFKFB3 в TEC после лечения IL-22, что требовало активации передачи сигналов AMPK/AKT. (C) Результаты ПЦР в реальном времени показывают, что IL-22 индуцирует сверхэкспрессию PFKFB3 в TEC, которая может ингибироваться сигнальным блоком AMPK/AKT. (D) Активация сигнального пути AMPK/AKT/PFKFB3 в ТИК после обработки соединением C и LY294002. (E и F) ECAR и OCR в ТИК в присутствии или в отсутствие IL -22 или si-PFKFB3 в течение 24 часов. (G) Потребление глюкозы в ТИК после обработки IL-22 или si-PFKFB3 в течение 24 часов. (H) Митохондриальную дисфункцию оценивали в ТИК, окрашенных MitoTracker Red и MitoTracker Green. критерий Стьюдента (непарный); п=3; ***р < 0.001,="" **р=""><0,01, *р=""><>

3.5 ИЛ-22 облегчает повреждение почек при цисплатин-индуцированном ОПП за счет подавления накопления АФК в почках и митохондриальной дисфункции

Чтобы проверить нашу гипотезу о том, что ИЛ{0}} регулирует метаболические профили почек для подавления повреждения почечных канальцев in vivo, мы первоначально оценили функцию почек у мышей, получавших ИЛ-22-, которым вводили цисплатин (рис. 5А). Через четыре дня после инъекции цисплатина IL -22 не только значительно уменьшал повреждение канальцевых клеток и кровоизлияние; их почечная дисфункция также была значительно ослаблена, что оценивалось по уровням азота мочевины в крови (BUN) и креатинина (Cr) в сыворотке (рис. 5B-D). Мы также предложили, чтобы IL-22 предотвращалпочкараназа счет усиления регенерации почек и активации передачи сигналов AMPK/AKT и PFKFB3 (рис. 5E и F; рис. S11). Затем мы использовали MitoSOX (краситель, специфичный для митохондрий ROS) и JC-1 (краситель, зависящий от потенциала митохондриальной мембраны), чтобы оценить митохондриальную дисфункцию, связанную с клеточным метаболизмом и апоптозом. В срезах почек мышей, получавших цисплатин, наблюдались сопоставимые накопления АФК. Следует отметить, что через четыре дня после лечения IL -22 уровни ROS были заметно снижены в поврежденных почках по сравнению с ROS у мышей после лечения PBS (рис. 5G). В совокупности эти наблюдения предоставили доказательства того, что IL-22 играет защитную роль в индуцированном цисплатином ОПП, контролируя приспособленность митохондрий.

РИСУНОК 5 IL-22 облегчает повреждение почек при цисплатин-индуцированном ОПП за счет ингибирования накопления почечных АФК и дисфункции митохондрий. (A) Схематическая диаграмма экспериментальных протоколов для оценки защитных эффектов IL-22 в цисплатине (20 мг/кг), индуцированном повреждении почек. PBS в качестве контрольной группы носителя и N-ацетил-1-цистеин (NAC, 15 0 мг/кг) в качестве положительной контрольной группы. (B и C) Оценивались уровни BUN в сыворотке, уровни Cr в сыворотке, масса почек и масса тела. Были представлены репрезентативные изображения HE (D), окрашивания Ki-67 (E), MitoSOX (G) и JC{{10}} (G) срезов почек. (F) Сравнение активации STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3 в экстрактах почек мышей, получавших IL-22-, оценивали с помощью вестерн-блоттинга. критерий Стьюдента (непарный); п=3; ***р < 0,001,="" **р="">< 0,01,="" *р=""><>

3.6 IL-22 улучшает вызванное диабетом повреждение почек посредством ингибирования митохондриальной дисфункции за счет активации передачи сигналов AMPK/AKT и PFKFB3

Мы и другие продемонстрировали, что ИЛ -22 может оказывать защитное действие при диабетической нефропатии (ДН), которая была основной причиной ЭСТД.31–33. Для дальнейшего изучения основных механизмов мы кормили мышей db/db высоко- жировой диеты (HFD), а затем обрабатывали их IL-22 (2,5 мг/кг, внутрибрюшинно) в течение 8 недель (рис. 6А). Когда мышей кормили только HFD, мы обнаружили фиброз и дилатацию почечных канальцев в дополнение к атрофии. Напротив, когда мышей лечили IL-22, почечный фиброз и гистопатология были значительно улучшены, а также функции почек. Улучшение функции почек также было продемонстрировано снижением уровней Cr в сыворотке, уровня азота мочевины и общего альбумина в моче/24 ч (ЭАЭ) (рис. 6B–E). Чтобы изучить, была ли эта активность связана с митохондриями, мы оценили функцию митохондрий, участвующих в клеточном метаболизме и апоптозе. Результаты показали, что повышенные уровни митохондриальных АФК и накопление дисфункциональных митохондрий значительно уменьшались при лечении IL -22 (рис. 6F и G). Для дальнейшего изучения того, были ли защитные функции IL-22 в почках опосредованы через PFKFB3, мы инъецировали мышам аденовирус кшРНК PFKFB3, чтобы сбить PFKFB3. Наши данные показали, что благотворное влияние IL-22 на вызванное HFD повреждение почек, некроз, стеатоз, митохондриальную дисфункцию и накопление ROS, а также активацию связанных сигнальных путей были значительно заблокированы нокдауном PFKFB3 (рис. 6B-G). . Повышенная экспрессия передачи сигналов AMPK/AKT также наблюдалась после лечения IL-22 (фиг. 6H). Наряду с облегчением почечной дисфункции экспрессия PFKFB3 и важных ферментов клеточного метаболизма также улучшилась в почках мышей, получавших IL-22- (рис. 6H и I). Кроме того, гистологический анализ основных органов показал отсутствие морфологических повреждений после инъекции IL-22, что позволяет предположить, что IL-22 может быть безопасным антидотом без значительных побочных эффектов или токсических реакций дляпочкаранарасстройства (рис. 12S). В целом, наши данные свидетельствуют о том, что IL- 22 облегчал повреждение почек за счет активации передачи сигналов AMPK/AKT, ингибирования накопления АФК и регуляции функции митохондрий посредством PFKFB3.

РИСУНОК 6. IL-22 уменьшает повреждение почек, вызванное диабетом, посредством передачи сигналов AMPK/AKT и ингибирования дисфункциональных митохондрий посредством активации PFKFB3. (A) Схематическая диаграмма экспериментальных протоколов для оценки защитных эффектов IL -22 при повреждении почек, вызванном диабетом. Дб/м в качестве контрольной группы транспортных средств. (B-D) Были оценены уровни BUN в сыворотке, уровни Cr в сыворотке и ОАЭ. Были представлены репрезентативные изображения HE (E), MitoSOX (F) и JC-1 (G) срезов почек. (H и I) Сравнение активации STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3 в экстрактах почек мышей, получавших IL{9}}, оценивали с помощью вестерн-блоттинга. критерий Стьюдента (непарный); п=3; ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

4. ДИСКУССИЯ

IL-22 секретируется иммунными клетками, такими как NK-клетки, нейтрофилы, врожденные лимфоидные клетки (ILC) и Т-клетки, но не влияет на эти клетки напрямую. Он преимущественно регулирует функции эпителиальных клеток благодаря ограниченной экспрессии IL-22R1 на эпителиальных клетках, включая TECs.15,34 Предыдущие исследования показали, что IL-22 может защищать от повреждения почечного эпителия и ускорять регенерацию канальцев. путем ингибирования инфламмасомы NLRP3 и активации передачи сигналов STAT3 и AKT.16,31 Однако основные механизмы этой защиты еще не выяснены. Для дальнейшего определения молекулярной основы функции IL- 22 впочкарана, мы сначала исследуем, может ли IL-22 облегчить дисфункцию клеток почек и последующий апоптоз посредством регулирования их метаболических состояний. Кроме того, мы изучаем две моделипочкараназаболеваний (ОПП и ДН) при введении ИЛ-22 и сравнить наблюдения с наблюдениями в контрольных группах. Мы указываем, что IL -22 корректирует метаболическое перепрограммирование для поддержания целостности митохондрий, уменьшает накопление митохондриальных АФК в поврежденных ТИК и облегчает прогрессирующее повреждение и некроз почек. Более того, наши результаты показывают, что IL- 22 может активировать связанные с AMPK/AKT сигнальные пути в ТИК и почках, важные медиаторы эпителиального заживления ран и выживания клеток, улучшая митохондриальную дисфункцию и ухудшающиеся метаболические профили и открывая новые поле для IL-22 опосредованного почечного защитного механизма. В целом, наши результаты показывают, что защитные эффекты IL-22 на почки опосредованы процессами метаболического перепрограммирования.

Критическая роль OXPHOS и гликолиза в защите почек была выявлена ​​в предыдущих исследованиях, где уравновешивание использования топлива путем ингибирующего S-нитрозилирования пируваткиназы M2 (PKM2) защищает отпочкарана.19 Наши результаты, предполагающие стимулирование OXPHOS и гликолиза IL-22 за счет увеличения экспрессии регуляторов метаболизма и поглощения глюкозы, демонстрируют, что IL-22 обращает вспять ухудшение метаболических состояний, связанное спочкарана. Эти наблюдения согласуются с почечными защитными функциями рекомбинантного иризина, а также согласуются с данными о гепатоцитах, где для клеточных функций необходимы и OXPHOS, и гликолиз, но если они ингибируются, то клетки первичных канальцев и гепатоциты становятся дисфункциональными.35, 36

Митохондриальная дисфункция стала ключевой молекулярной основой, объединяющей метаболические профили и гибель клеток. Здесь мы показываем, что при стимуляции факторов повреждения лечение TEC с помощью IL -22 улучшало накопление митохондриальных АФК и дисфункциональных митохондрий по сравнению со снижением целостности и функции митохондрий в контрольных группах. Важно отметить, что сигнальные пути AMPK, сенсоры критической энергии, модулируют метаболические процессы для поддержания клеточного гомеостаза и предотвращения повреждения клеток или тканей. Сигналы AMPK/AKT для демонстрации того, что IL-22 предотвращает митохондриальную дисфункцию прямым методом, что жизненно важно для поддержания дыхательной способности TEC. Кроме того, мы демонстрируем, что передача сигналов IL-22 через STAT3 оказывает прямое влияние на сохранение приспособленности митохондрий, поскольку ранее было исследовано, что индуцированное фосфорилирование STAT3 имеет решающее значение для сохранения целостности митохондрий.40,41

В различных источниках ранее указывалось, что PFKFB3 играет роль центрального модулятора клеточного метаболизма. 29–30, 42 Здесь мы впервые демонстрируем, что IL-22 способствует активации PFKFB3 посредством передачи сигналов AMPK/AKT в TEC, предполагая, что IL{ {6}} регулирует метаболические состояния посредством контроля PFKFB3. Более того, предыдущие исследования также указывают на то, что PFKFB3 важен для контроля чрезмерного OXPHOS и гликолиза во многих клетках или тканях. лечили ТИК посредством активации PFKFB3. Среди многочисленных нижестоящих модуляторов IL-22, которые были исследованы, наши данные показывают, что PFKFB3 значительно активируется после обработки IL-22 во время повреждения TEC и что ось STAT3-AMPK/AKT PFKFB3 жизненно важна для сохранения целостности митохондрий во времяпочкарана(Рисунок 7). Их еще предстоит изучить, регулирует ли IL -22 также другие метаболические регуляторы и процессы, связанные с повреждением почек, посредством активации сигнального пути STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3.

РИСУНОК 7 Наши результаты иллюстрируют важную роль IL-22 в контроле метаболизма клеток почек для лечения повреждения почек посредством активации оси STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3. Эти результаты свидетельствуют о том, что терапевтические возможности интерлейкина -22 и нацеливание на связанную с ним метаболическую сигнализацию могут быть непосредственно благоприятны для лечения или профилактики многочисленных поражений почек.

5. ВЫВОДЫ

В заключение мы продемонстрировали терапевтический потенциал и основные механизмы IL-22 при повреждении почек. IL -22 регулирует метаболизм почечных клеток посредством метаболического перепрограммирования для сохранения целостности митохондрий. Ингибирование их регуляторов (например, AMPK, Akt и PFKFB3) может привести к аномальным метаболическим профилям и потере митохондриальной приспособленности, как показано в TEC со спонтанным -22 лечением, которое увеличивало дисфункциональные митохондрии и накопление митохондриальных АФК. Что наиболее важно, повреждение почек из-за митохондриальной дисфункции и накопления АФК в моделях мышей существенно облегчалось лечением IL-22 за счет активации передачи сигналов STAT3-AMPK-AKT-PFKFB3. Таким образом, наше исследование показало, что нацеливание на связанную с ним метаболическую сигнализацию может быть непосредственно благоприятным для многих заболеваний с повреждением почек, а IL -22 является потенциальным терапевтическим средством для профилактики и лечения этих заболеваний.

Продукты Cistanche могут лечитьповреждение почек

Из: 'IL -22-опосредованное метаболическим перепрограммированием почек посредством PFKFB3 для леченияпочкарана' поВэй Чен и др.

---клин. Перевод Мед. 2021;11:e324.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Мехта Р.Л., Бурдманн Э.А., Серда Дж. и соавт. Распознавание и лечение острыхпочкаранав Международном обществе нефрологов 0by25 Global Snapshot: многонациональное кросс-секционное исследование. Ланцет. 2016;387:2017-2025.

2. Ламейр Н.Х., Багга А., Круз Д. и соавт. Острыйпочкарана: растущая глобальная проблема. Ланцет. 2013;382:170-179.

3. Мехта Р.Л., Серда Дж., Бурдманн Э.А. и соавт. Инициатива 0by25 Международного общества нефрологов по остройпочкарана(ноль предотвратимых смертей к 2025 г.): дело о правах человека в области нефрологии. Lancet. 2015;385:2616-2643.

4. Леви А.С., Джеймс М.Т. Острыйпочкарана. Ann Intern Med.2017;167:ITC66-ITC80.

5. Jansen MPB, Florquin S, Roelofs JJTH. Роль тромбоцитов в остромпочкарана. Нат Рев Нефрол. 2018;14:457-471.

6. Агарвал А., Донг З., Харрис Р. и др. Клеточные и молекулярные механизмы ОПП. J Am Soc Нефрол. 2016;27:1288-1299.

7. Linkermann A, Chen GC, Dong G, Kunzendorf U, Krautwald S, Dong Z. Регулируемая гибель клеток при ОПП. J Am Soc Nephrol.2014;25:2689-2701.

8. Ференбах Д.А., Бонвентре Дж.В. Механизмы неадекватного восстановления после ОПП, приводящие к ускоренному старению почек и ХБП. Nat Rev Nephrol. 2015;11:264-276.

9. Чавла Л.С., Эггерс П.В., Стар Р.А., Киммел П.Л. Острыйпочкаранаи хроническое заболевание почек как взаимосвязанные синдромы. N Engl J Med. 2014;371:58-66.

10. He L, Wei QQ, Liu J и соавт. ОПП при ХБП: усиленное повреждение, подавленное восстановление и лежащие в его основе механизмы. Kidney Int.2017;92:1071-1083.

11. Forbester JL, Lees EA, Goulding D, et al. Интерлейкин -22 способствует слиянию фаголизосом, вызывая защиту от сальмонеллы энтерика Typhimurium в эпителиальных клетках человека. Proc Natl Acad Sci USA. 2018;115:10118-10123.

12. Geng H, Bu HF, Liu F, et al. В воспаленных тканях кишечника и эпителиальных клетках передача сигналов интерлейкина 22 увеличивает экспрессию длинной некодирующей РНК H19, что способствует регенерации слизистой оболочки. Гастроэнтерология. 2018;155:144-155.

13. Аден К., Тран Ф., Ито Г. и др. ATG16L1 управляет передачей сигналов интерлейкина-22 в кишечном эпителии посредством cGAS-STING. J ExpMed. 2018;215:2868-2886.

14. Хубер С.Н., Гальяни Л.А., Зеневич Ф.Дж. и соавт. IL-22BP регулируется инфламмасомой и модулирует онкогенез в кишечнике. Природа. 2012;491:259-263.

15. Lindemans CA, Calafiore M, Mertelsmann AM и др. Интерлейкин -22 способствует регенерации эпителия, опосредованной стволовыми клетками кишечника. Природа. 2015;528:560-564.

16. Xu MJ, Feng D, Wang H, Guan Y, Yan X, Gao B. IL -22 улучшает почечное ишемически-реперфузионное повреждение путем нацеливания на эпителий проксимальных канальцев. J Am Soc Нефрол. 2014;25:967-977.

17. Кулкарни О.П., Харттер И., Мулай С.Р. и др. Толл-подобный рецептор, 4-индуцированный IL-22, ускоряет регенерацию почек. J Am Soc Нефрол. 2014;25:978-989.

18. Канг Х.М., Ан С.Х., Чой П. и др. Дефектное окисление жирных кислот в эпителиальных клетках почечных канальцев играет ключевую роль в развитии почечного фиброза. Нат Мед. 2015;21:37-46.

19. Чжоу Х.Л., Чжан Р., Ананд П. и др. Метаболическое перепрограммирование системой S-нитрозо-КоА-редуктазы защищает отпочкарана. Природа. 2019;565:96-100.

20. Dumesic PA, Egan DF, Gut P, ​​et al. Эволюционно законсервированная uORF регулирует PGC1 и окислительный метаболизм у мышей, мух и синего тунца. Клеточный метаб. 2019;30:190-200.

21. Ших-Чанг Н., Чжу Х., Иванка де Сойса Т. и соавт. Lin28 усиливает восстановление тканей путем перепрограммирования клеточного метаболизма. Клетка. 2013;155:778-792.

22. Чен В., Луан Дж., Вэй Г. и др. In vivo гепатоцеллюлярная экспрессия интерлейкина -22 с использованием гибридных наночастиц на основе проникновения в качестве потенциального средства против гепатита. Биоматериалы. 2018;187:66- 80.

23. Chen W, Zhang X, Fan J и др. Связывание интерлейкина-22 с аполипопротеином AI улучшает состояние мышей при повреждении печени, вызванном ацетаминофеном. Тераностика. 2017;7:4135-4148.

24. Zai W, Chen W, Wu Z, et al. Направленная доставка гена интерлейкина -22 в печень с помощью полиметформина и гибридных наночастиц на основе проникновения для лечения неалкогольной жировой болезни печени. Интерфейсы приложений ACS. 2019;11:4842-4857.

25. Хачо М., Харрис Р., Слэк Р.С. Митохондрии как центральные регуляторы судьбы нервных стволовых клеток и когнитивной функции. Нат Рев Нейроски. 2019;20:34-48.

26. Ip WKE, Hoshi N, Shouval DS, Snapper S, Medzhitov R. Противовоспалительное действие IL-10, опосредованное метаболическим перепрограммированием макрофагов. Наука. 2017;356:513-519.

27. Saito Y, Chapple RH, Lin A, Kitano A, Nakada D. AMPK защищает клетки, инициирующие лейкемию, при миелоидном лейкозе от метаболического стресса в костном мозге. Клеточная стволовая клетка. 2015;17:585- 596.

28. Михайлова ММ, Шоу Р.Дж. Сигнальный путь AMPK координирует рост клеток, аутофагию и метаболизм. Nat Cell Biol. 2011;13:1016-1023.

29. Ли Ф.Л., Лю Дж.П., Бао Р.Х. и др. Ацетилирование приводит к накоплению PFKFB3 в цитоплазме, что способствует гликолизу и защищает клетки от апоптоза, вызванного цисплатином. Нац коммун. 2018;9:508.

30. Де Бок К., Джорджиаду М., Шорс С. и др. Роль гликолиза, управляемого PFKFB3-, в прорастании сосудов. Клетка. 2013;154:651-663.

31. Дудаков Дж.А., Ханаш А.М., ван ден Бринк М.Р. Интерлейкин -22: иммунобиология и патология. Анну Рев Иммунол. 2015;33:747- 785.

32. Ван С., Ли И, Фан Дж. и др. Интерлейкин -22 облегчал повреждение почек и фиброз при диабетической нефропатии за счет ингибирования активации воспалительных процессов NLRP3. Клеточная смерть Дис. 2017;8:e2937.

33. Шэнь Ю.Л., Чен В., Хань Л. и др. Антитело VEGF-B и слитый белок интерлейкин -22 улучшают течение диабетической нефропатии за счет ингибирования накопления липидов и воспалительных реакций. Acta Pharm Sin B. 2020. https://doi.org/10.1016/j. апсб.2020.07.002.

34. Оуян В., О'Гарра А. Цитокины семейства IL-10 IL-10 и IL-22: от фундаментальной науки к клиническому применению. Иммунитет. 2019;50:871- 891.

35. Xiang X, Feng D, Hwang S, et al. Интерлейкин -22 улучшает острую хроническую печеночную недостаточность путем перепрограммирования нарушенных путей регенерации у мышей. J Гепатол. 2020;72:736-745.

36. Чен В., Зай В., Фан Дж. и др. Интерлейкин -22 управляет метаболическим адаптивным перепрограммированием для поддержания митохондриальной пригодности и лечения повреждений печени. Тераностика. 2020;10:5879-5894.

37. Пэн Х., Ван К., Лу Т. и др. Опосредованные миокинами перекрестные помехи между мышцами и почками подавляют метаболическое перепрограммирование и фиброз в поврежденных почках. Нац коммун. 2017;8:1493.

38. Saberi B, Ybanez MD, Johnson HS, Gaarde WA, Han D, Kaplowitz N. Протеинкиназа c (PKC) участвует в гепатотоксичности ацетаминофена через c-jun-n-терминальную киназу (jnk)-зависимую и -независимую сигнальные пути. Гепатология. 2014;59:1543-1554.

39. Мо Р., Лай Р., Лу Дж. и др. Усиленная аутофагия способствует защитным эффектам IL-22 от повреждения печени, вызванного ацетаминофеном. Тераностика. 2018;8:4170-4180.

40. Wegrzyn J, Potla R, Chwae YJ, et al. Функция митохондриального Stat3 в клеточном дыхании. Наука. 2009;323:793-797.

41. Chen W, Hu Y, Ju D. Генная терапия нейродегенеративных заболеваний: достижения, идеи и перспективы. Acta Pharm Sin B. 2020; 10: 1347-1359.

42. Цао Ю, Чжан С, Ван Л и др. Эндотелиальный гликолиз, опосредованный PFKFB3-, способствует легочной гипертензии. Proc Natl Acad Sci USA. 2019;116:13394-13403.

43. Доменек Э., Маэстре С., Эстебан-Мартинес Л. и др. AMPK и PFKFB3 опосредуют гликолиз и выживание в ответ на митофагию во время остановки митоза. Nat Cell Biol. 2015;17:1304- 1316.