SARS‑CoV‑2: большие данные о распространенности серопозиции из Пакистана — есть ли коллективный иммунитет?

Абстрактный

Цель

Обследования серопревалентности в разных странах показали, что антитела к SARS CoV-2 ниже 20 процентов даже в наиболее неблагополучных районах, а коллективный иммунитет нельзя предсказать до тех пор, пока не заболеет более половины населения. Цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить масштабы распространения инфекции среди населения, ассоциированный иммунитет, а также перспективы и близость к «стадному сообществу».

Коллективный иммунитет - это когда достаточное количество людей в группе становятся невосприимчивыми к болезни, что вся группа защищена от этой болезни. Когда все больше и больше людей в популяции становятся невосприимчивыми к болезни, распространение болезни замедляется или останавливается, потому что патоген не может найти новых людей для заражения. Коллективный иммунитет может быть достигнут с помощью таких мер, как вакцинация, естественное заражение и изоляция. Коллективный иммунитет и индивидуальный иммунитет очень важны. Нам также необходимо повышать иммунитет в нашей повседневной жизни. Цистанхе позволяет значительно повысить иммунитет. Полисахариды в Цистанхе могут регулировать иммунный ответ иммунной системы человека. Улучшить стрессоустойчивость иммунных клеток и усилить бактерицидный эффект иммунных клеток.

Нажмите Цистанхе пустынная добавка

Методы

Исследование было проведено как кластерно-рандомизированное перекрестное общенациональное исследование. Эти крупнейшие данные о распространенности SARS-CoV-2 среди населения были собраны в период с 15 по 31 июля 2020 года в семи случайно выбранных городах, принадлежащих трем самым густонаселенным провинциям Пакистана. Для обнаружения антител к SARS-CoV-2 использовался одобренный FDA набор компании ROCHE.

Полученные результаты

Образцы сыворотки 15 390 участников были протестированы на антитела к SARS CoV-2 с общей серопревалентностью 42,4%. Серораспространенность колебалась от 31,1 до 48,1 процента в разных городах с самым высоким показателем в провинции Пенджаб (44,5 процента). При однофакторном анализе вероятность серопозитивности была выше у мужчин по сравнению с женщинами (ОШ: 1,10, 95-процентный ДИ: 1,01–1,19, P<0.05). In multivariable analysis, the risk of being seropositive was lower (OR 0.72, 95% CI: 0.60–0.87, P<0.01) in the younger group (≤ 20 years) than in those aged above 60 years.

Заключение

Исследование пришло к выводу, что, несмотря на разумную серопревалентность, страна еще не достигла базового минимума оценок коллективного иммунитета. Долговечность иммунитета, хотя и обсуждается в настоящее время, продемонстрировала очевидный осознанный сдвиг в сторону более длинной стороны.

Ключевые слова

Серопревалентность · Sars · CoV-2 · Антитела · Коллективность · Иммунитет.

Введение

Заболевание, связанное с новым коронавирусом (COVID-19), началось в Китае в декабре 2019 г., а Пакистан объявил о двух положительных случаях 26 февраля 2020 г. [1]. Всемирная организация здравоохранения объявила SARS-CoV-2 глобальной пандемией 11 марта 2020 г., и с тех пор число случаев заболевания растет во всем мире, что приводит к беспрецедентным последствиям для жизни людей [2]. Статистика ВОЗ по подтвержденным случаям COVID-19 на 31 декабря 2020 г. составила 81 533 368, в том числе 1 799 911 случаев смерти во всем мире [3]. Как и во многих других странах, в июне 2020 г. в Пакистане было зарегистрировано самое большое число новых случаев и смертей, после чего последовало резкое падение [4, 5]. Меры, принятые правительством Пакистана, и связанное с этим снижение числа случаев получили высокую оценку в мире [6, 7], но причины не могут быть полностью объяснены (из-за отсутствия подтверждающих доказательств/данных) [5]. С началом зимы произошел всплеск COVID-19, и число подтвержденных случаев увеличилось на 110 530, включая 2060 смертей с конца октября до середины декабря 2020 г. [8].

Широко распространенная инфекция затронула все провинции Пакистана: 230 718 случаев в Синде, 62 377 случаев в Хайбер-Пахтунхве, 147 292 случая в Пенджабе и 39 624 случая в столице Исламабаде [8]. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) является золотым стандартом для подтверждения инфекции SARS-CoV-2. Однако он может пропустить несколько предсимптомных и бессимптомных инфекций в латентном периоде и не дает информации об иммунитете против болезни, которая могла бы помочь проиллюстрировать состояние коллективного иммунитета в сообществе [9, 10]. В исследованиях сообщалось о случаях повторного заражения SARS CoV-2 [11–13], но некоторые другие исследования пришли к выводу, что положительный повторный ПЦР-тест может быть связан с рядом других причин, таких как заражение мутировавшим SARS Cov-2 и техническими причинами. ошибка при сборе образцов [14, 15].

Исследования серопревалентности также дают оценки населения, все еще уязвимого для инфекции [16]. В Пакистане до сих пор отсутствует настоящее исследование серопревалентности на базе сообщества, в то время как большинство проведенных исследований проводятся в больницах и с разным уровнем инфекции (11–40 процентов), учитывая тот факт, что некоторые из них были основаны на воспоминаниях [17–40]. 19].

Коллективный иммунитет до сих пор не предсказуем во многих странах мира, поскольку обследования населения по серопревалентности показывают, что антитела составляют всего 10–15 процентов [20], а коллективный иммунитет нельзя предсказать до тех пор, пока более половины населения не заболеет этим заболеванием [21]. Коллективный иммунитет против инфекционного заболевания, такого как COVID-19, может быть достигнут, когда 70–90 процентов населения становится невосприимчивым из-за массовой вакцинации или контакта с инфекцией [22]. Второй всплеск COVID-19 уже зафиксирован во многих странах, включая Пакистан [23, 24].

Это делает очень важным понимание иммунного ответа в различных популяциях, поскольку он имеет важные последствия для общественного здравоохранения и политики [25, 26]. Однако до сих пор неясно, можно ли достичь коллективного иммунитета через вакцину или перенесенную инфекцию.

Это исследование серопревалентности на уровне общин проводилось в трех основных провинциях Пакистана, в которых проживает более 90 процентов населения страны. Цель состояла в том, чтобы получить более точную оценку распространения инфекции на уровне сообщества, связанного с ним иммунитета к COVID-19 и перспектив близости к коллективному иммунитету в будущем.

Методология

Это исследование было проведено как кластерно-рандомизированное перекрестное общенациональное исследование. Семь из девяноста девяти городов были выбраны случайным образом в качестве исследовательского кластера. В каждом кластере участники набирались через передвижные кемпинги из случайно выбранных союзных советов (административная единица в пределах района с численностью населения 25,000–35,000). Кластеры включали Пешавар, Карачи, Лахор, Мултан, Мансехру, Равалпинди, Мултан и Хайдарабад из трех крупных провинций (Хайбер-Пахтунхва, Синд и Пенджаб).

Исследование проводилось с 15 по 31 июля 2020 года после одобрения Институциональным наблюдательным советом (IRB) Prime Foundation, Пакистан (номер утверждения IRB Prime/IRB/2020-248). После получения информированного согласия было взято 5 мл периферической венозной крови в контейнер с литий-гепарином. Основные демографические данные давших согласие субъектов были записаны в структурированном инструменте.

Хранение, обработка и диагностическая маркировка образцов флеботомии

Пробы доставлялись в лаборатории в специализированных контейнерах, обеспечивающих температурный режим. Сыворотку отделяли, центрифугировали при 2500 об/мин, хранили в маркированных чашках и использовали для анализа 20 мкл. Образцы анализировали с использованием иммуноанализа Elecsys® (Roche, Базель, Швейцария) Anti-SARSCoV-2. В анализе используется рекомбинантный белок, представляющий нуклеокапсидный (N) антиген, для определения антител против SARS-CoV-2.

Это иммуноанализ для качественного обнаружения in vitro антител, включающих IgG к SARS-CoV-2 в сыворотке и плазме человека [27]. Одобренный FDA набор компании ROCHE, используемый для обнаружения иммуноглобулинов против SARSCoV-2, обладает высокой специфичностью (100 процентов) и чувствительностью более 98,8 процентов, по данным производителя [28]. Тем не менее, Public Health England оценивает его специфичность в 100%, а чувствительность — в 87% [29]. Порог для значимого уровня антител был принят за 1 AU/мл в соответствии с инструкцией производителя.

статистический анализ

Данные были введены и проанализированы в SPSS версии 24.0. Средние значения, медиана и стандартные отклонения были рассчитаны для непрерывных переменных, а частоты, количество и проценты были рассчитаны для категориальных переменных. Доверительный интервал для пропорций был рассчитан с использованием точного биномиального метода. Тест хи-квадрат использовался для сравнения категориальных переменных, таких как пол, возрастная группа и местоположение. Был проведен логистический регрессионный анализ для прогнозирования вероятности серопозитивности среди разных возрастных групп. Порог статистической значимости был установлен при значении P, меньшем или равном 0,05.

Полученные результаты

Всего было протестировано 15 390 образцов сыворотки (по одному образцу на человека) на антитела к SARS-CoV-2 из трех основных провинций Пакистана в семи разных местах, как указано в приведенных выше методах. В таблице 1 представлены оценки серопревалентности по полу, возрастным группам и различным регионам. Большинство участников принадлежали к провинции Пенджаб (n=8872, 57,6 процента), за которой следуют Хайбер-Пахтунхва (n=4797, 31,2 процента) и провинция Синд (n=1721, 11,2 процента).

Из общего числа участников 12 280 (79,8%) были мужчинами и 3110 (20,2%) женщинами со средним возрастом 35,21 года (SD ± 13,29). Возрастная группа от 21 до 40 лет составила наибольшее количество участников (n=9348, 60,7%), а возрастная группа старше 60 лет - наименьшее количество участников (n=652, 4,2%).

За период исследования из общей выборки (n=15, 390) 6518 дали положительный результат на антитела к SARS COV-2 с общей серопревалентностью 42,4% (биномиальный точный 95-процентный ДИ: 41,5–43,14). ).

В разных возрастных группах самая высокая серопозитивность была отмечена в старшей возрастной группе старше 60 лет (44,6%, 95% ДИ: 40,7–48,5), в то время как самая низкая серопозитивность была оценена в младшей возрастной группе Меньше или равно до 20 (36,7%, 95% ДИ: 34,2–39,1) (таблица 1). Серораспространенность была самой высокой в ​​провинции Пенджаб (44,5 процента) (биномиальный точный 95-процентный доверительный интервал: 43,5–45,6), затем следовали Хайбер-Пахтунхва (42,2 процента) (биномиальный точный 95-процентный доверительный интервал: 41,2–44,0) и провинция Синд (31,8 процента) (биномиальный Точный 95-процентный ДИ: 29,6–34,1) со статистически значимой связью (P<0.01) when chi-square test was applied. The city-wise seroprevalence was also calculated that ranging from 31.1% (Binomial Exact 95% CI: 28.8–33.3) in Mansehra city to 48.1% (Binomial Exact 95% CI: 46.3–49.8) in Peshawar city (Fig. 1). For the remaining five locations, the seroprevalence estimates fell within this range (31.1–48.1%).

При однофакторном анализе вероятность серопозитивности была выше у мужчин по сравнению с женщинами (ОШ: 1,10, 95-процентный ДИ: 1,01–1,19, P<0.05) but was not statistically significant in multivariable analysis (P>{{0}}.05) (таблица 2). Вероятность серопозитивности в многопараметрическом анализе была низкой в ​​более молодом возрасте (менее или равно 20 годам) с ОШ: 0,72, 95-процентный ДИ: 0,60–0,87 по сравнению с возрастной группой старше 60 лет. лет и имел высоко статистически значимое значение P<0.01. Similarly, the age groups of 20–40 and 41–60 years also had a lower risk of being seropositive (OR: 0.91, 95% CI: 0.77–1.07) and (OR: 0.98, 95% CI: 0.83–1.16) respectively to the age group of above 60 years and was found to be numerically higher (P = 0.25, P=0.88) (Table 2).

Обсуждение

Во время нынешней пандемии серологическое тестирование представляется полезной стратегией для определения передачи COVID от человека к человеку-19. Использование серологических тестов у бессимптомной популяции или у тех, у кого проявляются легкие симптомы, имеет решающее значение, поскольку они редко выбирают ПЦР-тестирование [30], маскирующее фактическую скорость инфицирования населения. Различные исследования, проведенные в разных частях мира, показали, что у многих людей с положительным результатом теста на SARS-CoV-2 не было никаких симптомов [31–33].

В рамках этого исследования были проведены серологические тесты на COVID-19 среди населения трех провинций Пакистана. В нашем исследовании серопозитивность увеличивалась с увеличением возраста. В последнем обзоре, проведенном Lai и его коллегами, сообщается, что это имело место и в некоторых других исследованиях, но не было универсальным выводом, однако во всех исследованиях [34]. Более того, ни они, ни Anand et al. в обзоре больших данных в США были обнаружены какие-либо существенные различия в серопозитивности среди мужчин и женщин [34, 35]. Наше исследование многопараметрического анализа также не обнаружило каких-либо существенных различий в серопозитивности между полами.

Тем не менее, исследование показало, что общая серопревалентность составляет 42,4 процента. Зная, что когда большинство населения невосприимчиво к инфекционному заболеванию, оно обеспечивает косвенную защиту, т. е. коллективный иммунитет, для тех, кто не имеет иммунитета к заболеванию. Учитывая, что эффективная вакцинация против COVID-19 имеет множество проблем с доступностью и цепочкой поставок, особенно для развивающихся стран, в сочетании с тем фактом, что вирусы гриппа, как считается, быстро мутируют, естественное течение инфекции остается основной возможностью. для приобретения коллективного иммунитета [36].

Были подняты вопросы о продолжительности иммунитета против COVID-19. В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Science Journal, сообщалось, что иммунологическая память SARS-CoV-2 может сохраняться дольше шести месяцев, а также было показано, что спайк-IgG был относительно стабилен в течение шести с лишним месяцев, а спайк-специфические В-клетки памяти были повреждены. в шесть месяцев больше, чем в один месяц [37].

Новости о появлении вызывающего озабоченность варианта (ЛОС) бразильского происхождения в Великобритании могут представлять собой сложный сценарий с точки зрения отслеживания и контроля распространения ЛОС и понимания их воздействия на пандемию, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода. странах (СНСД). Это, а также кратковременный иммунитет, связанный с фу-подобными пандемиями, не исключают повторного заражения и проблем с достижением коллективного иммунитета [38].

Заключение

Общая серопревалентность антител SARS CoV-2 в Пакистане в этом исследовании была достаточно высокой (по состоянию на июнь 2020 г.), но все еще не достигла базового минимума для коллективного иммунитета. Распространенность серотипа различалась в разных городах Пакистана, а также в зависимости от возраста и пола. Иммунитет, хотя и зависит от ряда агентов, хозяина и факторов окружающей среды, может быть не очень кратковременным (3 месяца или около того, как считалось ранее), и с течением времени появляется все больше свидетельств, указывающих на долговечность вируса. иммунитет намного выше этого.

Ограничение

Ограничением, о котором следует помнить, может быть систематическая ошибка отбора, которая могла возникнуть из-за добровольного участия случайно выбранных UC.

Дополнительная информация

Онлайн-версия содержит дополнительные материалы, доступные по адресу https://doi.org/10.1007/s15010-021-01629-2.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить всех участников исследования, полевых и лабораторных сотрудников, участвовавших в сборе и анализе сыворотки для этого исследования.

Финансирование

Финансирование этого исследования было предоставлено Фондом здравоохранения Аль-Хидмат, а наборы антител против SARS CoV-2 были предоставлены компанией ROCHE.

Наличие данных и материалов

Данные исследования можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Декларации

Конфликт интересов

Авторы этого исследования заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этом исследовании.

Рекомендации

1. Норин Н., Дил С., Ниязи С., Навид И., Хан Н., Хан Ф. и другие. пандемия COVID-19 и Пакистан; ограничения и пробелы. Glob Biosecurity [Интернет]. 2020 г., 21 мая [цитировано 15 ноября 2020 г.]; 1(4). Доступно по адресу http://jglobalbiosecurity.com/articles/https://doi.org/10.31646/bio.63/.

2. Mahase E. Covid-19: ВОЗ объявляет пандемию из-за «тревожных уровней» распространения, серьезности и бездействия. БМЖ. 2020;м1036.

3. Информационная панель ВОЗ о коронавирусной болезни (COVID-19) [Интернет]. Covid19.who.int. 2020 [по состоянию на 13 декабря 2020 г.]. Доступно по адресу: https://covid19.who.int/?ftag=MSF0951a18.

4. Пакистанский коронавирус: 356 904 случая и 7 141 смерть — Worldometer [Интернет]. [цитировано 15 ноября 2020 г.].

5. Необъяснимое снижение числа случаев COVID-19 озадачивает экспертов в области здравоохранения [Интернет]. Thenews.com.pk.2020 [по состоянию на 18 декабря 2020 г.].

6. Бывший главный экономист ВБ хвалит действия Пакистана по борьбе с коронавирусом [Интернет]. [цитировано 15 ноября 2020 г.].

7. Dawn.com А. Глава ВОЗ хвалит Пакистан за подавление Covid-19, сохраняя при этом экономику на плаву [Интернет]. РАССВЕТ.COM. 2020 [цитировано 15 ноября 2020 г.].

8. COVID-19 Консультативная платформа по вопросам здравоохранения, разработанная Министерством национальных служб здравоохранения, постановлений и координации [Интернет]. COVID-19. правительство пк. 2020 [по состоянию на 18 декабря 2020 г.].]

9. Gao Z, Xu Y, Sun C, Wang X, Guo Y, Qiu S, et al. Систематический обзор бессимптомных инфекций COVID-19. J Microbiol Immunol Infect. 2021; 54: 12–6.

10. Могадас С., Фитцпатрик М., Сах П., Пандей А., Шукат А., Сингер Б.Х. и др. Значение бесшумной передачи для борьбы со вспышками COVID-19. Proc Natl Acad Sci. 2020;117:17513–5.

11. Ye G, Pan Z, Pan Y, Deng Q, Chen L, Li J и др. Клиническая характеристика реактивации тяжелого острого респираторного синдрома при коронавирусе 2. J заразить. 2020;80:e14–7.

12. Равиоли С., Окснер Х., Линднер Г. Реактивация пневмонии, вызванной COVID-19: отчет о двух случаях. J заразить. 2020;81:e72–3.

13. Loconsole D, Passerini F, Palmieri V, Centrone F, Sallustio A, Pugliese S, et al. Рецидив COVID-19 после выздоровления: история болезни из Италии. Инфекционное заболевание. 2020; 48: 965–7.

14. СейедАлинаги С., Олиаи С., Кианзад С., Афсахи А., МохссениПур М., Барзегари А. и др. Риск повторного заражения новым коронавирусом (CoVID-19): систематический обзор текущих данных. Мир Джей Вирол. 2020; 9: 79–90.

15. Колсон П., Фино М., Леви Н., Лажье Дж., Рауль Д. Доказательства повторного заражения SARS-CoV-2 с другим генотипом. J заразить. 2021; 82: 84–123.

16. Хан С., Куреши М., Хак И., Маджид С., Бхат А., Наби С. и др. Серопревалентность специфических IgG-антител к SARS-CoV-2 в округе Сринагар, северная Индия — перекрестное исследование. ПЛОС ОДИН. 2020;15:e0239303.

17. Юнас А., Вахид С., Хаваджа С., Имам М., Борхани М., Шамси Т. Распространенность антител к SARS-CoV-2 среди здоровых доноров крови в Карачи, Пакистан. Transf Apheresis Sci. 2020;59:102923.

18. Javed W, Baqar JB, Abidi SHB, Farooq W. Данные о распространенности серотипов в мегаполисах Пакистана: последствия для оценки распространенности COVID-19 и летальности среди густонаселенного городского работающего населения. Арка Эпидемиол. 2020;4:143.

19. Чухтай О.Р., Батул Х., Хан М.Д., Чухтай А.С. Частота выявления антител IgG к COVID-19 среди специального полицейского отряда Лахора, Пакистан. J Coll Врач Сург Пак. 2020; 30: 735–9.

20. Byambasuren O, Dobler C, Bell K, Rojas DP, Clark J, McLaws ML, et al. Сравнение серопревалентности инфекций SARS-CoV-2 с кумулятивными и предполагаемыми случаями COVID-19: систематический обзор. ПЛОС ОДИН. 2021;16:e0248946.

21. Фонтане А., Кошемес С. Коллективный иммунитет к COVID-19: где мы? Нат Рев Иммунол. 2020; 20: 583–4.

22. Роджерс Л., Хелс Дж. Что такое коллективный иммунитет и как его достичь при COVID-19? [Интернет]. Школа общественного здравоохранения Блумберга Джона Хопкинса. 2020 [по состоянию на 18 декабря 2020 г.].

23. Луи М. Ковид-19: на Европу надвигается вторая волна? БМЖ. 2020: м4113.

24. Вторая волна Covid-19 в Пакистане; есть ли еще эпизоды в будущем? [Интернет]. БМЖ. 2020 [по состоянию на 18 декабря 2020 г.].

25. Природа. 2020. Почему расшифровка иммунного ответа на COVID имеет значение для вакцин. Природа. Дата обращения: 10 августа 2020 г. Доступно по ссылке: https://www.nature.com/articles/d41586-020-02943-9

26. Природа. 2020. Почему расшифровка иммунного ответа на COVID имеет значение для вакцин. Природа. Дата обращения: 14 июня 2020 г. Доступно по адресу: https://media.nature.com/original/magazine-assets/d41586- 020-02943-9/d41586-020-02943-9.

27. Elecsys® Anti-SARS-CoV-2 [Интернет]. Диагностика. 2021 [по состоянию на 1 апреля 2021 г.]. Доступно по адресу: https://diagnostics.roche.com/global/en/products/params/elecsys-anti-sars-cov-2.html.

28. Тест на антитела к COVID-19 компании «Рош» получил разрешение FDA на экстренное использование и доступен на рынках, принимающих маркировку CE. По состоянию на 14 сентября 2020 г. Доступно по адресу: http://www.roche.com/media/releases/med-cor-2020-05-03.html.

29. Баранюк С. Тесты на антитела к Covid-19: брифинг. БМЖ. 2020;369:m2284.

30. Инфантино М., Дамиани А., Ли Гобби Ф., Гросси В., Лари Б., Маккиа Д. и др. Обзор преимуществ и ограничений серологических анализов на инфекционное заболевание SARS-COV-2. Итальянская J Lab Med. 2020;16:7–17.

31. Саттон Д., Фукс К., Д'Алтон М., Гофман Д. Универсальный скрининг на SARS-CoV-2 у женщин, госпитализированных для родов. N Engl J Med. 2020; 382: 2163–4.

32. Ли Р., Пей С., Чен Б., Сун Ю., Чжан Т., Ян В. и др. Существенная недокументированная инфекция способствует быстрому распространению нового коронавируса (SARS-CoV-2). Наука. 2020; 368: 489–93.

33. Гудбьяртссон Д.Ф., Хельгасон А., Йонссон Х., Магнуссон О.Т., Мелстед П., Норддал Г.Л. и соавт. Распространение SARS-CoV-2 среди населения Исландии. N Engl J Med. 2020; 382: 2302–15.

34. Lai C, Wang J, Hsueh P. Исследования серопревалентности антител против SARS-CoV-2 среди населения: обновленный обзор. Int J Infect Dis. 2020; 101: 314–22.

35. Ананд С., Монтез-Рат М., Хан Дж., Бозман Дж., Кершманн Р., Бейер П. и др. Распространенность антител SARS-CoV-2 в большой общенациональной выборке пациентов на диализе в США: перекрестное исследование. Ланцет. 2020; 396: 1335–44.

36. Миллс М.С., Солсбери Д. Проблемы распространения вакцин против COVID-19. Э Клин Мед. 2020;100674.

37. Дэн Дж. М., Матеус Дж., Като Ю. и др. Иммунологическая память на SARS-CoV-2 оценивалась в течение 8 месяцев после заражения. Наука. 2021;371:eabf4069.

38. Covid-19: в Великобритании обнаружен бразильский «вариант, вызывающий обеспокоенность» [Интернет]. Новости BBC. 2021 [по состоянию на 1 апреля 2021 г.].

Мохсина Хак1 · Асиф Рехман1 · Джунаид Ахмад2 · Усман Зафар3 · Суфьян Ахмед4 · Мумтаз Али Хан5 · Асиф Навид6 · Хала Раджаб1 · Фавад Мухаммад1 · Васифа Наушад1 · Мухаммад Аман1 · Хафиз Ур Рехман1 · Саджад Ахмад1 · Саид Анвар1 · Наджиб Уль Хак1

For more information:1950477648nn@gmail.com