Одновременная стабилизация актинового цитоскелета во многих нефрон-специфичных клетках защищает почку от различных повреждений

Хронические заболевания почекиострое повреждение почекмеханистическиотдельные заболевания почек. Хотя хронические заболевания почек связаны сповреждение подоцитов, острое повреждение почекпоражает эпителиальные клетки почечных канальцев. Несмотря на эти различия,кардинальная особенностьобоихострые и хронические заболевания почекпредставляет собой дисрегулированный актиновый цитоскелет. Мы показали, чтофармакологическая активация динамина ГТФазыулучшает повреждение подоцитов вмышиные модели хронических заболеваний почекксодействие полимеризации актина. Здесь мы устанавливаем роль динамина в модуляции жесткости и полярностиэпителиальные клетки почечных канальцевпутем сшивания актиновых нитей в разветвленные сети. Активация способности динамина к сшиванию низкомолекулярным агонистом стабилизирует актомиозиновую кору апикальной мембраны от повреждений, что, в свою очередь,сохраняет функцию почекв различных мышиных моделях острого повреждения почек. Примечательно, что агонист динамина одновременно ослабляет подоциты итрубчатая травмав генетической мышиной модели синдрома Альпорта. Наше исследование предоставляет доказательства осуществимости и подчеркиваетпреимущества новых целостных нефронзащитных методов лечения.

НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ УЗНАТЬ ТРАВЯНОЙ СОСТАВ ЦИСТАНША, ХОРОШЕГО ПРИ ОСТРОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПОЧЕК

Основные причины острого повреждения почек(АКИ) являютсяишемия, гипоксия, илинефротоксичность1. Хотя эту ситуацию можно обратить вспять, ОПП представляет собой серьезную проблему здравоохранения с высокой смертностью и отсутствием окончательного лечения. Независимо от этиологии ОПП в первую очередь повреждает поляризованные эпителиальные клетки почечных канальцев, апикальные микроворсинки которых образуют канальцевую щеточную кайму, которая участвует в координации транспорта незаменимых электролитов и воды2. Ранней морфологической особенностью ОПП является потеря щеточной каймы и полярности клеток из-за разрушения коры актомиозина на апикальной мембране1.

Установление и поддержание клеточной полярности включают сигнальные каскады, мембранный транспорт и динамику цитоскелета, все из которых высоко скоординированы3. Организация апикальной мембраны в значительной степени определяется архитектурой актомиозиновых сетей4, которые устанавливают жесткость коры, тем самым облегчая кластеризацию полярных белков. В то время как моторы миозина II считаются основным генератором жесткости коры5,6, архитектура актомиозина коры определяется множеством актин-связывающих белков (ABP)7.

В дополнение к известным ABP, щеточная кайма почечных канальцев сильно обогащена динамином8, ГТФазой, наиболее известной своей ролью в эндоцитозе9. Динамин имеет внутреннюю склонность образовывать множественные состояния олигомеризации, такие как димеры, тетрамеры, кольца и спирали9. Мы впервые идентифицировали прямые взаимодействия динамина и актина10 и показали, что олигомеризация динамина регулирует полимеризацию актина в подоцитах11,12, специализированных клетках, необходимых для селективности почечного фильтра. Используя мышиные модели ХБП, мы показали, что активация динамин-зависимой полимеризации актина обращает вспять повреждение подоцитов, восстанавливая их уникальную структуру и функцию12.

Здесь мы показываем, что вэпителиальные клетки почечных канальцевДинамин сшивает нитевидный актин (F-актин) в разветвленные сети. Способность Dynamin к сшиванию определяется состоянием его олигомеризации и длиной F-актина. Фармакологическая активация олигомеризации динамина противодействует ОПП путем стабилизации актиновых сетей и, следовательно, целостности клеток, что частично защищает эпителиальные клетки почек от повреждений, вызванных окислительным стрессом. Наше исследование идентифицирует актомиозиновую кору апикальной мембраны клеток почечных канальцев как мишень, поддающуюся лекарственному воздействию при ОПП, с помощью динамина в качестве прокси-сервера.

Результаты. Олигомеризация динамина устанавливает жесткость и морфологию апикальной мембраны.

Чтобы изучить роль динамин-актиновых взаимодействий в поляризованных эпителиальных клетках почечных канальцев, мы использовали Bis-T-23, аллостерический активатор актин-зависимой олигомеризации динамина в восстановленной системе13, в клетках11,13 и в весь организм12. Клеточные фенотипы оценивали в клетках почек собак Мадина-Дарби (MDCK) путем отслеживания статуса F-актина и картины окрашивания белка плотных соединений zonula occludens-1 (ZO-1), который считается биомаркером клеточной полярности. Цитохалазин D (CytoD) и латрункулин А (LatA), известные ингибиторы полимеризации актина, снижали уровни F-актина и индуцировали прерывистое окрашивание ZO-1 (дополнительный рисунок 1a). Напротив, Bis-T-23 вызывал небольшое увеличение уровней F-актина без какого-либо влияния на окрашивание ZO-1. Добавление Bis-T-23 до, но не после LatA, частично сохраняло уровни F-актина и полярность клеток. Ни носитель ДМСО, ни ингибитор динамина динол14 не проявили никакого эффекта (дополнительный рисунок 1a).

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) позволила нам визуализировать вызванные лекарственными препаратами изменения морфологии клеток с акцентом на апикальную мембрану (рис. 1а). Средняя высота клеток MDCK составляла 11 ± 2 мкм, а средняя длина микроворсинок составляла 0,63 ± 0,2 мкм (таблица 1), что находится в пределах диапазона, наблюдаемого в почках15. LatA уменьшал высоту клеток и длину микроворсинок и смещал равномерно распределенные микроворсинки в кластеры, тогда как Bis-T-23 вызывал противоположные эффекты (табл. 1, рис. 1а). При добавлении до LatA Bis-T-23 частично сохранял высоту клеток и длину микроворсинок. Поскольку микроворсинки демонстрируют четкий контроль длины, определяемый кортикальным актином в их основании16, эти данные доказывают, что Bis-T-23 модифицирует кору актомиозина на апикальной мембране.

Чтобы определить точный эффект, который Bis-T-23 оказал на кортикальный актин, мы визуализировали кору актомиозина внутри ламеллиподий с помощью электронной микроскопии платиновых реплик (PR-EM). LatA уменьшал плотность актиновых сетей, и этот эффект был частично устранен добавлением Bis-T-23 перед LatA (рис. 1b). Поскольку LatA ускоряет деполимеризацию актиновых нитей за счет секвестрации мономеров актина, мы затем исследовали, было ли наблюдаемое сохранение коры актомиозина с помощью Bis-T-23 связано с его положительным влиянием на полимеризацию актина. В отличие от мощной стимуляции полимеризации актина, наблюдаемой в экстрактах клеток подоцитов10,11, Bis-T-23 лишь незначительно увеличивает полимеризацию актина в экстракте клеток MDCK (дополнительный рисунок 1b). Аналогичным образом, иммуноистощение эндогенного динамина -2 (Dyn2) из ​​экстракта или ингибирование его активности ГТФазы с помощью динода приводило к незначительному нарушению полимеризации актина (дополнительный рисунок 1c). Хотя LatA и CytoD значительно нарушали полимеризацию актина, добавление Bis-T-23 до LatA или CytoD не смогло преодолеть их ингибирующие эффекты (дополнительный рисунок 1d, e). Джасплакинолид, препарат, который индуцирует полимеризацию актина путем стимуляции зарождения актиновых нитей17, существенно не увеличивает общий уровень полимеризации (дополнительный рисунок 1d), что позволяет предположить, что лизат клеток MDCK демонстрирует почти максимальный уровень полимеризованного актина. В совокупности эти данные показали, что эффекты Bis-T-23 на морфологию апикальной мембраны в клетках MDCK обусловлены механизмом, отличным от полимеризации актина.

Учитывая общеизвестные сведения о расширенной локализации Dyn2 и F-актина на щеточной кайме почечных эпителиальных клеток8 и роли динамина в эндоцитозе, мы затем исследовали, влияет ли Bis-T-23 на актин косвенно через изменения эндоцитоза. Как и ожидалось, и Dyn2, и F-актин совместно локализовались в коре актомиозина под апикальной мембраной, внутри микроворсинок и в ямках, покрытых клатрином (CCP), что определяется их различной формой и размером (дополнительный рисунок 1f). Мы исследовали динамику CCP с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF)18,19. Бис-Т-23, даже при самой высокой концентрации, не влиял на распределение времени жизни КПК, тогда как динол уменьшал количество продуктивных КПК (дополнительный рисунок 1g). Отсутствие корреляции между уровнем эндоцитоза и изменениями в морфологии клеток утверждает, что Bis-T- 23 нацелен на кортикальный актин, не влияя на роль динамина в эндоцитозе.

Поскольку полярность почечных клеток поддерживается архитектурой и постоянным сокращением актомиозиновых сетей, что обеспечивает жесткость клеток на апикальной мембране20, мы затем измерили жесткость клеток с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). Система Nanowizard IV и программное обеспечение для анализа JPK использовались для определения изменений модуля Юнга21 в различных экспериментальных условиях (дополнительный рисунок 2a). Обработка LatA привела к значительному снижению жесткости межклеточного контакта и жесткости апикальных клеток в клетках MDCK (рис. 1c–e). Напротив, Bis-T-23 значительно увеличивал жесткость клеток по сравнению с носителем ДМСО (рис. 1c–e), что согласуется с его положительным влиянием на высоту клеток, количество микроворсинок и плотность актиновых сетей (таблица 1 и Рис. 1б)22. Добавление Bis-T-23 перед LatA сильно уменьшало негативное влияние LatA на жесткость клеток (рис. 1c–e), что соответствует положительному влиянию Bis-T-23 на актиновые сети. и морфология апикальных клеток (табл. 1, рис. 1б).

Рис. 1. Олигомеризация динамина определяет жесткость клеток, влияя на архитектуру актина в эпителиальных клетках почек. a Репрезентативные СЭМ-изображения клеток MDCK, обработанных ДМСО (0,1%) или Bis-T-23 (30 мкМ, 0,1% ДМСО) для 1 0 мин до добавления ДМСО (0,1%) или LatA (0,2 мкМ, 0,1% ДМСО) в течение 2{{23} } мин. Увеличенные изображения вставок (области в оранжевой рамке) показывают расположение, распределение и плотность микроворсинок на апикальной мембране. b Репрезентативные PR-EM-изображения клеток MDCK, обработанных, как описано в (а). На изображениях показаны изменения в организации актомиозиновой коры клеток MDCK в указанных условиях. c Репрезентативные изображения карт модуля Юнга клеток MDCK, обработанных, как описано в (а). d, e Гистограммы, представляющие модуль Юнга, показывающий жесткость клеток, измеренную на межклеточном соединении (d) или на апикальной мембране (e). Каждый символ представляет собой среднюю жесткость одной ячейки. Результаты, показанные в d, e, были получены по меньшей мере для 10 клеток по меньшей мере из трех культуральных чашек. Столбики ошибок, среднее значение ± SD (*P Менее или равно 0,05, **P Менее или равно 0,01, ***P Меньше или равно 0,001, ****P Меньше или равно 0,0001, непарные двусторонний t-критерий). нс, не существенно.

Мы также определили жесткость клеток, используя систему BioScope II в качестве альтернативного экспериментального подхода к АСМ. В этом случае кривые силового вдавливания были получены по модели Дишера и его коллег, рассчитанной с помощью программного обеспечения Matlab23. Аналогичные тенденции в отношении жесткости клеток были зафиксированы для взаимодействия между LatA и Bis-T-23 (дополнительные рисунки 2b, 2c). Кроме того, dynode не оказывал никакого влияния на жесткость клеток, тогда как CytoD значительно уменьшал жесткость клеток (дополнительный рисунок 2d, e) в соответствии с их актиновым фенотипом (дополнительный рисунок 1a). В совокупности эти данные устанавливают корреляцию между состоянием актомиозиновой коры, жесткостью клеток, морфологией апикальной мембраны и полярностью клеток. Эти данные также убедительно демонстрируют роль олигомеризации динамина в определении механических параметров полярности эпителиальных клеток через ее влияние на кору актомиозина.

Динамин сшивает актиновые филаменты в разветвленные сети, которые лежат в основе клеточной полярности. Чтобы выяснить молекулярный механизм, с помощью которого олигомеризация динамина влияет на архитектуру коры актомиозина, мы затем исследовали влияние динамина на актиновые филаменты в восстановленной системе. Согласно современной гипотезе, длина актиновых филаментов определяет способ их сшивания6. Поскольку средняя длина кортикальных актиновых филаментов в сети на переднем крае составляет от 100 до 150 нм24, мы исследовали влияние динамина на организацию более коротких филаментов, генерируемых путем кэпирования F-актина гельзолином (Gsn-актин) (рис. 2а). Добавление Dyn2 привело к образованию крупных разветвленных сетей (рис. 2б, в). Судя по размерам и форме рекомбинантного Dyn2 (рис. 2г), сети образованы преимущественно димерами Dyn2 (Dyn2DIMER) и тетрамерами (Dyn2TETRA), которые взаимодействовали с несколькими актиновыми нитями (рис. 2д): Dyn2DIMER связывал до двух филаментов, Dyn2TETRA связывала до четырех нитей, а Dyn2RING связывала до шести нитей. Небольшое увеличение изображений показало, что динамин-зависимые сети образуют структуру из более мелких и крупных кольцевидных форм (рис. 2в).

Чтобы коррелировать наблюдения восстановленной системы с ролью динамина в клетках, мы затем определили локализацию эндогенного Dyn2 в кортикальных актиновых сетях, используя моноклональное антитело против Dyn2, а затем конъюгированное с золотом вторичное антитело (дополнительная рис. 3a-c). Как видно в восстановленной системе, динамин связан с определенным количеством F-актина внутри разветвленных сетей (рис. 2f). В совокупности эти данные идентифицируют новую активность динамина, которая заключается в сшивании F-актина в разветвленные сети.

Чтобы соотнести способность динамина к сшиванию и защитное действие Bis-T-23 на кору актомиозина и морфологию апикальной мембраны, мы затем исследовали влияние Bis-T-23 на опосредованные динамином сети в восстановленных системах (рис. 3а). Судя по контурным графикам, которые дают топографическое представление различной плотности филаментов, Bis T-23 увеличивает общую плотность сети (рис. 3а), что можно объяснить увеличением количества F-актина, связанного с динамином из-за увеличение его олигомеризации. Кроме того, динамин более эффективно сшивает более короткие филаменты, чем длинные F-актин (Рис. 3a-c), указывая тем самым, что способность динамина образовывать разветвленные сети определяется его статусом олигомеризации и длиной актиновых филаментов. Способность сшивать актиновые филаменты в сети была общей для двух изоформ динамина, повсеместно экспрессируемых Dyn2 и нейрон-специфического динамина-1 (Dyn1) (Рис. 3b, c).

Служба поддержки Wecistanche-крупнейшего экспортера цистаншей в Китае:

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Телефон:+86 15292862950

Магазин:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop