SLC37A2, молекула, связанная с фосфором, увеличивается в клетках гладких мышц в кальцинированной аорме.

Сосудистая кальцификацияявляется основным источникомсердечно-сосудистые заболеванияу пациентов с хронической болезнью почек.Гиперфосфатемияприводит к усилению внутриклеточного притока фосфора, что приводит к увеличению количества остеобластоподобных клеток в гладкомышечных клетках сосудов. PiT-1 транспортирует фосфат в гладкомышечные клетки сосудов. Однако механизм сосудистой кальцификации до конца не изучен. В этом исследовании изучались молекулы-кандидаты, связанные с фосфором, кроме PiT-1. Мы предположили, что родственные фосфору молекулы, принадлежащие кпереносчик растворенного вещества(SLC) суперсемейство будет участвовать в сосудистой кальцификации. В результате анализа микрочипов ДНК мы сосредоточились на SLC37A2 и показали, что экспрессия мРНК этих клеток увеличивается на кальцинированных гладкомышечных клетках аорты (AoSMC). Сообщалось, что SLC37A2 транспортирует как глюкозо-6-фосфат/фосфат, так и фосфат/фосфатный обмен. Анализ in vitro показал, что воспаление на AoSMC не влияет на экспрессию SLC37A2. Экспрессия мРНК и белка SLC37A2 увеличивалась в кальцинированных AoSMC. Анализ in vivo показал, что экспрессия мРНК SLC37A2 в аортехроническая болезнь почеккрыс коррелировало с генами-маркерами остеогенности. Кроме того, SLC37A2 экспрессировался в области сосудистой кальцификации укрысы с хронической болезнью почек. В результате мы показали, что SLC37A2 является одной из молекул, количество которых увеличивается с увеличениемсосудистая кальцификацияin vitro и in vivo.

Ключевые слова: SLC37A2,сосудистая кальцификация, гладкомышечные клетки аорты,хроническая болезнь почек, гиперфосфатемия

НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ПОЛУЧИТЬ НАТУРАЛЬНЫЙ ОРГАНИЧЕСКИЙ ЭКСТРАКТ ЦИСТАНШИ С 25% ЭХИНАКОЗИДА И 9% АКТЕОЗИДА ДЛЯ ФУНКЦИИ ПОЧЕК

Служба поддержки Wecistanche - крупнейшего экспортера цистаншей в Китае:

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Телефон:+86 15292862950

Магазин для получения дополнительных технических характеристик:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Поскольку количество больных схроническая болезнь почек(ХБП) увеличивается, число больныхтребующий диализатакже увеличится. Большинство смертей среди пациентов, перенесшихдиализиз засердечно-сосудистые заболеваниятакой каксердечная недостаточность, цереброваскулярные расстройстваили инфаркт миокарда. (,2) Основной источниксердечно-сосудистые заболевания— эктопическая кальцификация () — аномалия, вызванная образованием и отложением кристаллов фосфата кальция в мягких тканях. (4 6) Различные факторы, такие как воспаление. окислительный стресс и повышение уровня кальция (Ca) и фосфора (P) в плазме участвуют в прогрессировании сосудистой кальцификации. Среди этих факторов гиперфосфатемия наиболее тесно связана с кальцификацией сосудов. (7.8) Гиперфосфатемия возникает в результате избыточного поступления фосфора на фоне снижения функции почек. Поэтому пациентам, находящимся на диализе, необходимо ограничить потребление P. (79-12). Однако сообщалось, чтососудистая кальцификацияуже прогрессирует, когда начинают диализ; это также наблюдалось у пациентов с ранней стадией ХБП, когда гиперфосфатемия не очевидна. (3) Следовательно, важно предотвратить кальцификацию сосудов у пациентов с ранней стадией ХБП для улучшения прогноза жизни.

что приводит к увеличению притока Р в гладкомышечные клетки сосудов (ГМК). Приток P осуществляется через PiT-1, транспортер на поверхности клеточной мембраны СГМК. PiT- является членом суперсемейства растворенных веществ-переносчиков (SLC), которое включает переносчик фосфата натрия, кодируемый SLC20A1.04. PiT- переносит фосфат через Na-зависимые клеточные мембраны и впоследствии минерализует матрикс из-за повышенных уровней p.s) Внутриклеточно Уровни P повышаются, VSMC начинает экспрессировать остеогенные транскрипционные факторы, такие как фактор транскрипции 2 (Runx2), связанный с рантом (16). За этим эффектом следует повышенная экспрессия специфичных для остеобластов генов, таких как остеопонтин и остеокальцин. Кроме того, снижается экспрессия специфичных для гладких мышц белков. такой как гладкомышечный белок 22-0 (SM22-0). В результате СГМК трансформируется в остеобластоподобные клетки. (1718)Недавние клинические исследования показали повышение уровня кальция в крови. Белковые частицы (КПФ), которые представляют собой коллоидные частицы фосфата кальция, увеличиваются при снижении функции почек. (19-21)Кроме того, сообщалось о корреляции с уровнями CPP и P в крови.2o2i) Вполне возможно, что CpP может вызвать прогрессирование кальцификации сосудов.22-24)

Однако кальцификация сосудов наблюдалась у пациентов с ранней стадией ХБП и нормальным уровнем фосфора в плазме. (13) Кроме того, мРНК PiT-1 экспрессируется повсеместно во всех тканях. Таким образом, другая молекула может действовать преимущественно в области сосудистой кальцификации. Есть сообщения, чтовоспалениеспособствует кальцификации сосудов. Факторы воспаления, такие как интерлейкин (IL)-1B, IL-6 и фактор некроза опухоли-альфа (TNF-a), индуцируют дифференцировку СГМК в остеобластоподобные клетки (2s26). TNF-a индуцирует кальцификацию сосудов. через путь цАМФ, который играет роль в дифференцировке остеобластов.2728) IL-6 регулирует различные пути, ведущие к сосудистой кальцификации СГМК2-31) Более того. IllB, IL-6 и TNF-a также являются факторами, связанными с усилением кальцификации сосудов, вызванным высокими уровнями p.3233) Однако. современные данные не полностью объясняют механизм сосудистой

кальцификация, вызванная этими факторами. Мы предположили, что могут существовать и другие P-родственные молекулы, такие как молекулы суперсемейства SLC, участвующие в кальцификации сосудов. Мы сосредоточились на мембранных белках суперсемейства SLC и исследовали потенциальных кандидатов, связанных с P-родственными молекулами, кроме PiT-1, на участие в сосудистой кальцификации. Кроме того, мы исследовали связь между молекулами-кандидатами и сосудистой кальцификацией на видео и in vivo.

Материалы и методы

Культура клеток. Нормальные гладкомышечные клетки аорты человека (AoSMC) получали от Lonza (Базель, Швейцария). AoSMC культивировали в соответствии с инструкциями производителя. AoSMC поддерживали в питательной среде (базальная среда гладкомышечных клеток с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), эпидермального фактора роста, инсулина, фактора роста фибробластов-B и гентамицина/амфотерицина-B). СМИ менялись через день. AoSMC выращивали во влажном инкубаторе с 5% CO при 37 градусах и поддерживали до достижения слияния, а затем использовали в экспериментах.

Кальцифицированные AoSMC. Кальцификацию AoSMC индуцировали, как описано ранее. 435) AOSMC культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла, дополненной 15% FBS и пенициллином-стрептомицином, и культивировали с 2,6 мМ P в течение 3, 6, 9, 12 и 14 дней. Концентрацию P регулировали с помощью P-буфера NaH, PO/Na и HPO. рН 7,2). Другие AoSMC не культивировали с 2,6 мМ P.

ДНК-микрочип. Использовали тотальную РНК образцов AoSMC, культивированных и не культивированных с 2,6 мМ P. Тотальную РНК 5.0 мкг анализировали с использованием ДНК-микрочипа (Agilent Technologies, Токио. Япония). SurePrint G3 Human GE 8 x 60 тыс. вер. 2. Микроматрицу использовали для исследования около 26000 генов. Соотношение рассчитывали путем деления уровня экспрессии AoSMC, культивированного с 2,6 мМ в течение 12 дней, на уровень экспрессии AoSMC, не культивированного с 2,6 мМ P.

ДНК-микрочип

Использовали тотальную РНК образцов AoSMC, культивированных и не культивированных с 2,6 мМ P. Тотальную РНК 5.0 мкг анализировали с использованием ДНК-микрочипа (Agilent Technologies, Токио. Япония). SurePrint G3 Human GE 8 x 60 тыс. вер. 2. Микроматрицу использовали для исследования около 26000 генов. Соотношение рассчитывали путем деления уровня экспрессии на AoSMC, культивированного с 2,6 мМ в течение 12 дней, на уровень экспрессии на AoSMC, не культивированного с 2,6 мМ P. Экспрессия SLC37A2 при воспалении сосудов. Чтобы вызвать воспалительную реакцию в AoSMC, клетки культивировали в ростовой среде до тех пор, пока они не достигли слияния, а затем обрабатывали 1 мкг липополисахаридов (ЛПС) (ЛПС из escherichia coli O111:B4; Sigma, Сент-Луис, Миссури) в течение 24 и 72 дней без 2,6 мМ P. Другие AoSMC не культивировали с помощью анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Тотальную РНК экстрагировали из AoSMC, обработанных ЛПС в течение 24 и 72 часов, и клеток, не обработанных ЛПС. Количественную ПЦР в реальном времени на основе SYBR green проводили с использованием синтезированной кДНК и соответствующего набора праймеров для каждого целевого гена с помощью системы ПЦР в реальном времени aStepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Последовательности праймеров были следующими: человеческий IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' и 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; человеческие SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' и 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- и 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 и уровни экспрессии мРНК SLC37A2 рассчитывали после нормализации с помощью GAPDH. Экспрессия SLC37A2 в кальцинированных AoSMC.Всего экстрагировали из клеток AoSMC, не культивированных с 2,6 мМ P, и клеток AoSMC, культивированных с 2,6 мМ P в течение 3, 6, 9, 12 и 14 дней. ПЦР в реальном времени проводили с использованием синтезированной кДНК. Последовательности праймеров были следующими: следующим образом: человеческий Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' и 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Уровни экспрессии мРНК Runx2 и SLC37A2 рассчитывали после нормализации с помощью APPH.

Вестерн-блоттинг-анализ.

Общий белок собирали из образцов AoSMC, культивированных в тех же условиях, что и для анализа ПЦР в реальном времени. Эти образцы лизировали с использованием трис-буферного физиологического раствора (рН 75), дополненного 5% NP-40 и 1% коктейлем ингибиторов протеаз. Концентрацию белка в образцах измеряли с использованием набора для анализа белка BCA (Thermo FisherScientific. Waltham, MA). и концентрацию доводили вестерн-блоттингом, 10 мкг белка отделяли в 10%-ном полиакриламидном геле с использованием электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Мембрану обрабатывали антителом SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) или антителом GAPDH (GeneTex, Ирвин, Калифорния) в качестве первичных антител, инкубировали с антителом кролика lgG, конъюгированным с пероксидазой хрена (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота) в качестве вторичного антитела. и визуализировали с помощью Amersham ECL Select (GE Healthcare, Бакингемшир, Англия) и люминесцентного анализатора изображений (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Токио, Япония). Полосу определяли количественно с помощью lmagel.

Экспериментальный

Все протоколы исследования были одобрены Этическим комитетом Школы гуманитарных наук и окружающей среды Университета Хёго. Двенадцатинедельные самцы крыс Sprague-Dawley были приобретены у Japan SLC (Сидзуока, Япония). Крыс содержали в условиях 12-света и 12-часовой темноты (09:00-21:00) и имели свободный доступ к пище и особо чистой воде.

Экспериментальные диеты включают контрольную диету P (1,0% P, 0,6Ca, 20% белка), адениновую диету (0,75% аденина). , 1.0% P, 0.6%Ca, 2,5% белка), диета с низким содержанием P (LP) (0.2% P,0 0,6% Ca, 10% белка) и диета с высоким содержанием P (HP) (1,0% P, 0,6% Ca, 10% белка), основанная на диете AIN93-G (восточная Дрожжи, Токио, Япония) с казеином в качестве источника белка.3637) Сообщалось, что диета с низким содержанием белка способствует кальцификации сосудов у крыс с аденин-индуцированной почечной недостаточностью, поэтому было проведено ограничение белка.3738) Перед группировкой всех крыс (n=23) кормили стандартной диетой MF (восточные дрожжи) в течение недели для акклиматизации. В возрасте 13 недель крысы были разделены на 2 группы: контрольную группу (n=5) и группу с аденин-индуцированной ХБП (n=18). Контрольная группа получала контрольную P-диету в течение 6 недель. . Группа с аденин-индуцированной ХБП получала адениновую диету в течение примерно 3 недель, а затем была дополнительно разделена на 2 подгруппы: группа ХБП-LP (n=8) или группа CKDHP (n=10). Крысы группы ХБП-ЛП и группы ХБП-ГП получали диету ЛП и диету ЛП в течение 3 недель соответственно, в течение экспериментального периода потребление пищи регистрировали ежедневно. Во время адениновой диеты образцы крови брали из хвостовой вены между 10:00 и 11:00 один раз в неделю до второй недели, а затем один раз каждые 2 дня для мониторинга уровней в плазме. Во время диеты LP или диеты HP образцы крови собирали один раз в неделю. Образцы мочи собирали и регистрировали объем мочи один раз в неделю. Крыс умерщвляли с применением анестезии с использованием изофлюрана (Wako Pure Chemical Industries. Осака, Япония) и лапаротомии. Для анализа были взяты образцы крови из нижней полой вены и торакоабдоминальной аорты.

Экспрессия SLC37A2 на аорте.

Примерно одну треть собранной торакоабдоминальной аорты использовали для визуализации кальцификации и проведения иммуноокрашивания. Аорту заливали в парафин и вырезали 4- срезы. Срезы окрашивали с использованием набора «Метод фон Косса для кальция» (Polysciences. Warrington, PA) в соответствии с инструкциями производителя. иммуноокрашивающий анализ проводили с серийными срезами. Срезы инкубировали с антителом SLC37A2 в течение ночи при 4 градусах, а затем обрабатывали Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Токио, Япония) в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого срезы обрабатывали набором DABsubstrate (Nichirei).

Тотальную РНК экстрагировали из остальной части замороженной торакоабдоминальной аорты. ПЦР в реальном времени проводили с использованием синтезированной кДНК. Последовательности праймеров были следующими: крысиный остеопонтин, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' и 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' и; крысиный SLC37A2, 5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' и 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Уровни экспрессии мРНК остеопонтина и мРНК SLC37A2 рассчитывали после нормализации с помощью GAPDH.

Статистический анализ.

Данные представлены как среднее значение + SE. Различия между группами анализировали с помощью t-критерия. В экспериментах с кальцинированными AoSMC, вызванными фосфатом, различия анализировали с использованием одностороннего дисперсионного анализа с последующим методом Даннетта. В экспериментах с моделью CKD различия анализировались с использованием теста Крускала-Уоллиса с последующим методом Стила-Двасса. Коэффициенты корреляции (rs) определяли с использованием рангового теста коэффициента корреляции Спирмена. Для всех тестов. двусторонние значения p<0.05 were considered statistically significant.