Spike и Nsp6 являются ключевыми факторами ослабления SARS-CoV-2 Omicron BA.1

Вариант SARS-CoV-2 Omicron более устойчив к иммунитету и менее вирулентен, чем другие основные вирусные варианты, которые были обнаружены на данный момент1–12. Белок Omicron spike (S), имеющий необычно большое количество мутаций, считается основной движущей силой этих фенотипов. Здесь мы создали химерный рекомбинантный SARS-CoV-2, кодирующий ген S Омикрона (линия BA.1) в основной цепи предкового изолята SARS-CoV-2, и сравнили этот вирус с естественно циркулирующим вирусом Омикрон. вариант. Вирус, несущий Omicron S, успешно избегал гуморального иммунитета, индуцированного вакциной, главным образом из-за мутаций в мотиве связывания рецептора; однако, в отличие от встречающегося в природе Омикрона, он эффективно реплицируется в клеточных линиях и первичных клетках дистальных отделов легких. Аналогичным образом, у мышей K18-hACE2, хотя вирус-носитель Omicron S вызывал менее тяжелое заболевание, чем предковый вирус, его вирулентность не была снижена до уровня Omicron. Дальнейшие исследования показали, что мутации неструктурного белка 6 (nsp6) в дополнение к белку S было достаточно, чтобы воссоздать ослабленный фенотип Омикрона. Это указывает на то, что, хотя ускользание Омикрона от вакцины обусловлено мутациями в S, патогенность Омикрона определяется мутациями как внутри, так и вне белка S.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

По состоянию на декабрь 2022 года последовательные волны пандемии COVID-19 были вызваны пятью основными вариантами SARS-CoV-2, известными как вызывающие беспокойство варианты (VOC): Альфа (B.1.1.7). , Бета (B.1.351), Гамма (P.1), Дельта (линии B.1.617.2 и AY) и Омикрон (линии BA)13. Омикрон — это ЛОС, признанный совсем недавно. Впервые он был задокументирован в Южной Африке, Ботсване и путешественником из Южной Африки в Гонконге в ноябре 2021 года (идентификатор GISAID: EPI_ISL_7605742)14. 15. Он быстро распространился по миру, за несколько недель вытеснив ранее доминирующий вариант Дельта и составив большинство новых случаев заражения SARS-CoV-2 к январю 2022 года (ссылки 16–18). На данный момент идентифицировано как минимум пять линий Омикрона: BA.1, BA.2, BA.3, BA.4 и BA.5. BA.1 (далее именуемый «Омикрон») демонстрирует поразительное избегание гуморального иммунитета, вызванного инфекцией и вакциной3,19. Кроме того, он менее вирулентен, чем другие ЛОС, для людей и моделей инфекции in vivo4,5,7,11,12,20. Омикрон отличается от прототипа изолята SARS-CoV-2, Wuhan-Hu-1, на 59 аминокислот; 37 из этих изменений происходят в белке S, что повышает вероятность того, что S лежит в основе патогенного и антигенного поведения Омикрона.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Мутации S влияют на репликацию Омикрона в культуре клеток

Белок Omicron S содержит 3 аминокислотных замены 0, 6 делеций и одну вставку длиной 3 аминокислоты по сравнению с Wuhan-Hu-1 (расширенные данные, рис. 1). Двадцать пять из этих изменений уникальны для Омикрона по сравнению с другими ЛОС, хотя некоторые из них были зарегистрированы в сточных водах и незначительных вариантах SARS-CoV-221,22. Чтобы проверить роль белка S в фенотипе Омикрона, мы создали химерный рекомбинантный вирус, содержащий ген S Омикрона (США-lh01/2021) и все другие гены предкового SARS-CoV-2 (GISAID EPI{ {16}}ISL_2732373)23 (Расширенные данные, рис. 2a). Этот химерный вирус, получивший название Omi-S, был создан с использованием модифицированной формы реакции кольцевого полимеразного удлинения (CPER)24 (расширенные данные, рис. 2b), в результате которой были получены высококонцентрированные запасы вируса, содержащие 0,5 × 106 –5 × 106 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл из трансфицированных клеток в течение двух дней после трансфекции (расширенные данные, рис. 2c,d), что устраняет необходимость дальнейшей амплификации вируса.

Рис. 1|Влияние S на кинетику роста Омикрона in vitro. Схема вирусов. S, шип; Н, нуклеокапсид. b–e, клетки ACE2/TMPRSS2/Caco-2 (b,d) и клетки Vero E6 (c,e) были инфицированы при MOI 0.01, а процент N-положительных клеток (n=6 повторов) (b, c) и высвобождение инфекционных частиц (n=3 повторов) (d, e) определяли с помощью проточной цитометрии и анализа бляшек, соответственно. е, клетки ACE2/TMPRSS2/Caco-2 были инфицированы смесями вирусов в соотношении 1:1 для получения окончательного MOI 0.005 для каждого вируса. . Клетки фиксировали в указанные моменты времени и подвергали проточной цитометрии. Слева репрезентативный точечный график; справа — процент неинфицированных, инфицированных Omi-S/mCherry, инфицированных Omicron/mNeoGreen (Omicron/mNG) и дважды инфицированных клеток. Для компенсации использовали однократно инфицированные клетки. Столбики ошибок, среднее значение ± стандартное отклонение (n {{20}} повторов). г, Размеры бляшек. Слева репрезентативные изображения бляшек на клетках ACE2/TMPRSS2/Caco-2. Справа: диаметр бляшек представлен как среднее значение ± стандартное отклонение для 20 бляшек на вирус. ч. Эпителиальные клетки iAT2 человека инфицировали при MOI 2,5 в течение 48 или 96 часов. Апикальную сторону клеток промывали 1× фосфатно-солевым буфером (PBS) и измеряли уровни инфекционных вирусных частиц с помощью анализа бляшек. Столбики ошибок, среднее значение ± стандартное отклонение (n=4 повторяется). Эксперименты повторяли дважды, причем каждый повтор эксперимента содержал 3 (б–ж) или 4 (з) повторности. Значения P рассчитывались с помощью двустороннего непарного t-критерия с поправкой Уэлча. *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 и ****P <0,0001; НС, не существенно. Стратегия стробирования для проточной цитометрии показана на дополнительном рисунке 1.

Сначала мы сравнили эффективность заражения Omi-S с предковым вирусом, содержащим D614G (GISAID EPI_ISL_2732373; созданный CPER; далее именуемый диким типом (WT)) и изолятом Omicron. (США-lh01/2021) в культуре клеток (рис. 1а). Для этого мы инфицировали клетки ACE2- и TMPRSS2-, экспрессирующие Caco-2 (далее ACE2/TMPRSS2/Caco-2) и Vero E6, Omi-S, WT и Омикрон при множественности заражения (MOI) 0,01 и контролировал распространение вируса с помощью проточной цитометрии и анализа образования бляшек. Вирус WT и Omi-S быстро распространялись в клетках ACE2/TMPRSS2/Caco-2, давая 89% и 80% инфицированных клеток соответственно через 24 часа после заражения (HPI) (рис. 1b). Напротив, Omicron реплицировался медленнее, что привело к инфицированию 48% клеток при 24 hpi. Аналогичная картина наблюдалась в клетках Vero E6, в которых 60% и 41% клеток были положительными для WT и Omi-S соответственно при 48 hpi, в отличие от 10% для Omicron (рис. 1c). Анализ бляшек показал, что, хотя и Omi-S, и Omicron производят более низкие уровни инфекционных вирусных частиц по сравнению с WT, титр вируса Omi-S был значительно выше, чем у Omicron. В клетках ACE2/TMPRSS2/Caco-2 Omi-S продуцировал 5,1-кратный (P=0.0006) и 5,5-кратный (P {{49}) }.0312) больше инфекционных частиц, чем у Omicron при 12 hpi и 24 hpi соответственно (рис. 1d). Аналогичным образом, в клетках Vero E6 титры инфекционного вируса Omi-S были в 17-раз (P=0.0080) и 11- раз (P=0.0078) выше. чем у Омикрона при 24 и 48 г/д соответственно (рис. 1д). Разница между вирусами стала менее очевидной в более поздние моменты времени из-за более высокой цитотоксичности, вызванной Оми-С, по сравнению с Омикроном (расширенные данные, рис. 3а). Повышенная эффективность репликации Omi-S по сравнению с Omicron сохранилась при тестировании при различных значениях MOI (расширенные данные, рис. 3b). Мы также подтвердили преимущество Omi-S в фитнесе над Omicron с помощью прямого конкурентного анализа. Для этого мы сначала создали рекомбинантный Омикрон (микрон), который в наших анализах на клеточных культурах имитировал кинетику репликации природного Омикрона (расширенные данные, рис. 4). Затем мы создали Omi-S, содержащий mCherry, и Omicron, содержащий mNeonGreen, и инокулировали клетки ACE2/TMPRSS2/Caco-2 этими вирусами, смешанными в соотношении 1:1. Проточный цитометрический анализ инфицированных клеток в различные сроки заражения показал, что Omi-S/mCherry явно превосходил Omi-S/mNeonGreen с точки зрения репликации (рис. 1f). Наконец, более высокая инфекционная эффективность Omi-S также отразилась на размере бляшек; хотя вирус WT продуцировал самые большие бляшки (около 4,1 мм), размер бляшек Omi-S (около 2,2 мм) был в два раза (P <0,0001) больше, чем у бляшек Omicron (около 1,1 мм) (рис. 1g). Эти результаты показывают, что хотя мутации в белке S влияют на эффективность заражения Омикрона, они не полностью объясняют фенотип Омикрона.

Несколько доказательств показали, что белок S, включенный в Omi-S, вел себя так же, как и в природном Omicron. Например, как описано ранее20,25, Omicron S расщеплялся хуже, чем WT S; тогда как 71% S в вирионах WT находился в расщепленной форме, только 45% и 47% были расщеплены в Omi-S и Omicron соответственно (расширенные данные, рис. 5а). Такая же картина расщепления S наблюдалась в инфицированных вирусом клетках (WT, расщеплено 63%; Omi-S, расщеплено 33%; Omicron, расщеплено 42%) (расширенные данные, рис. 5b). Эти эксперименты также показали, что Omicron S неэффективно включался в вирусные частицы по сравнению с WT S (отношение S к нуклеокапсиду (N): 3,40 для вируса WT, 1,91 для Omi-S и 2,04 для Omicron) (расширенные данные, рис. 5a). Аналогично, и Omi-S, и Omicron производят меньшие синцитии по сравнению с вирусом WT, о чем ранее сообщалось для Omicron20,26 (Расширенные данные, рис. 5c). Наконец, в соответствии с опубликованной литературой25, Omi-S и Omicron продемонстрировали предпочтение катепсин-опосредованного входа, о чем свидетельствует их более высокая чувствительность к ингибитору катепсина E64d (расширенные данные, рис. 6). Затем мы сравнили кинетику репликации WT, Omi-S и Omicron в эпителиальных клетках легких, которые образуют основной сайт репликации вируса у пациентов с COVID -19 (ссылки 27,28). Соответственно, мы использовали индуцированные человеком плюрипотентные стволовые (iPS) клетки, полученные из альвеолярных эпителиальных клеток легких 2 типа (iAT2). Клетки AT2 представляют собой важную популяцию клеток в дистальных отделах легких и являются одной из основных мишеней инфекции SARS-CoV-228,29. Мы инфицировали клетки iAT2, выращенные в виде культуры с интерфейсом воздух-жидкость (ALI), при MOI 2,5 и контролировали секрецию вирусного потомства на апикальной стороне клеток при 48 hpi и 96 hp. В соответствии с результатами, полученными на клеточных линиях, вирус WT продуцировал самые высокие уровни инфекционных вирусных частиц (рис. 1h). Среди Omi-S и Omicron первый имел примерно в пять раз (P=0.0008) более высокий инфекционный титр вируса при 48 hp. Титры вируса для WT и Omi-S снизились при 96 dpi по сравнению с 48 hp из-за цитопатического эффекта (CPE) инфекции. Однако для Омикрона не наблюдалось CPE, что приводило к устойчивому производству инфекционных вирионов. В целом, эти результаты подтверждают вывод о том, что мутации в S не полностью объясняют ослабленную репликационную способность Омикрона в клеточной культуре.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Минимальная роль S в патогенности Омикрона у мышей

Чтобы проверить, демонстрирует ли Omi-S более высокую пригодность in vivo по сравнению с Omicron, мы исследовали исход заражения Omi-S по сравнению с WT SARS-CoV-2 и Omicron у мышей K18-hACE2. В соответствии с опубликованными литературными данными4,5 интраназальная инокуляция мышей (в возрасте 12–20 недель) Омикроном (104 БОЕ на мышь) не вызывала значительной потери веса, тогда как инокуляция вирусом WT вызывала быстрое снижение массы тела у всех мышей. теряют более 20% своей первоначальной массы тела через 8 дней после заражения (dpi) (рис. 2а). Примечательно, что 80% мышей, инфицированных Omi-S, также потеряли более 20% массы тела на 9 точек на дюйм (рис. 2а и расширенные данные, рис. 7а). Оценка клинических показателей (совокупный показатель потери веса, нарушения дыхания, аномального внешнего вида, снижения отзывчивости и изменения поведения) также выявила аналогичную картину; в то время как у мышей, инфицированных Омикроном, клинические признаки заболевания были незначительными или вообще отсутствовали, здоровье инфицированных WT и Omi-S быстро ухудшалось, при этом вирус WT вызывал более тяжелое заболевание (P=0.0102) (рис. 2б и расширенные данные рис. 7б). Поскольку SARS-CoV-2 вызывает смертельную инфекцию у мышей K18-hACE24, мы сравнили выживаемость мышей после вирусной инфекции. В соответствии с результатами потери массы тела и клинической оценки, WT и Omi-S вызывали уровень смертности 100% (6/6) и 80% (8/10) соответственно. Напротив, все мыши, инфицированные Омикроном, выжили (рис. 2в). Эти результаты, которые согласуются с недавней публикацией30, указывают на то, что белок S не является исключительным определяющим фактором патогенности Омикрона у мышей K18-hACE2.

Затем мы сравнили распространение Omi-S с Omicron и WT SARS-CoV-2 в легких и носовых раковинах мышей K18-hACE2. Мышам (в возрасте 12–20 недель) интраназально вводили 104 БОЕ (по семь мышей на вирус), а титры вируса в легких мышей измеряли через 2 и 4 дня на дюйм. В соответствии с результатами in vitro титр инфекционного вируса в легких мышей, инфицированных диким типом дикого типа, был выше, чем титр, обнаруженный у мышей, инфицированных двумя другими вирусами (рис. 2d). Однако примечательно, что мыши, инфицированные Omi-S, продуцировали в 30- раза (P=0.0286) больше инфекционных вирусных частиц по сравнению с мышами, инфицированными Omicron, при 2 dpi. Титр снизился на 4 дня на дюйм у мышей, инфицированных WT и Omi-S, но показал тенденцию к увеличению у мышей, инфицированных Omicron, что указывает на возможность легкой, но стойкой инфекции Omicron у мышей K18-hACE2. Все три варианта, выделенные из легких мышей, сохраняли тот же фенотип размера бляшек, что и исходный инокулят, что указывает на то, что репликация у мышей не оказывала заметного влияния на генотипы этих вирусов (данные не показаны).

Чтобы оценить патогенность вируса в легких и носовых раковинах мышей K18-hACE2, мы провели гистопатологический анализ этих тканей при 2 дпи. Как сообщалось ранее4,31, в альвеолах легких мышей, инфицированных вирусом WT, была обнаружена обширная почти диффузная иммунореактивность белка SARS-CoV-2 N (рис. 2e). Напротив, инфекция Omi-S и Omicron вызывала локализованные очаги альвеолярного окрашивания с меньшим количеством очагов для Omicron по сравнению с Omi-S. Наиболее выраженный фенотип наблюдался в бронхиолярном эпителии, в котором Omi-S вызывал выраженную, обычно периферическую инфекцию, при этом около 10–15% бронхиол были положительными на вирусный белок N на 2 дпи, тогда как только 3–5% бронхиол были N -положительный для Омикрона (рис. 2е). Вирус ДТ инфицировал около 1% бронхиол и во всех случаях включал только одну изолированную эпителиальную клетку на бронхиолу. Кроме того, бронхиолярная инфекция была связана с некрозом эпителия у мышей, инфицированных Omi-S, что было определено с помощью серийного анализа срезов гематоксилина и эозина (H&E), тогда как у мышей, инфицированных Omi-S или WT, не наблюдалось гистологических признаков повреждения дыхательных путей (расширенные данные). Рис. 8а,б). Носовые раковины мышей, инокулированных вирусами WT и Omi-S, содержали большое количество SARS-CoV-2-положительных клеток, что было связано с явными цитопатическими эффектами, тогда как Omicron продуцировал редкие, спорадические положительные клетки без видимых признаков эпителиального поражения. травма (расширенные данные, рис. 8c). В целом, эти результаты позволяют предположить, что репликация Омикрона в дыхательных путях мышей существенно ослаблена по сравнению с Оми-S, что подтверждает наш вывод о том, что мутации в S лишь частично ответственны за снижение патогенности Омикрона.

Мутации в S и nsp6 определяют ослабление Омикрона.

Помимо белка S, Омикрон имеет аминокислотные изменения в неструктурных белках 3 (nsp3), nsp4, nsp5, nsp6, nsp14, белках оболочки (E), мембране (M) и N по сравнению с вирусом WT. (Расширенные данные, рис. 9а). Чтобы идентифицировать белки без шипов, которые участвуют в ослаблении Омикрона, мы создали большую панель флуоресцентно меченных химерных вирусов, каждый из которых содержит Omicron S в сочетании с одним белком без шипов Omicron, а остальные белки происходят из вируса WT (расширенные данные). рис. 9б). Когда мы объединили Omicron S с Omicron nsp6 (Omi-S/nsp6), мы наблюдали сильное снижение репликации вируса, при этом кинетика заражения имитировала кинетику заражения Omicron в культуре клеток (рис. 3a–d); для других химерных вирусов такого снижения не наблюдалось. Низкая эффективность репликации Omi-S/nsp6 также была подтверждена нашим открытием, что восстановление с помощью CPER и Omi-S/nsp6, и Omicron заняло почти пять-шесть дней, тогда как все другие варианты были восстановлены за два дня (данные не показаны). Наконец, как и Omicron, Omi-S/nsp6 явно проигрывал Omi-S в анализе прямой конкуренции (рис. 3e).

Рис. 2|Роль S в патогенности Омикрона. a–c, самцам и самкам мышей K18-hACE2 (в возрасте 12–20 недель) интраназально инокулировали 1 × 104 БОЕ дикого типа (n=6 мыши), вирус Omi-S (n=10 мышей) или Omicron (n {{1{{40}}}} мышей). В этом эксперименте использовали два независимо созданных запаса вируса. Массу тела (а), клиническую оценку (б) и выживаемость (в) контролировали ежедневно в течение 14 дней. Мышей, потерявших 20% от первоначальной массы тела, подвергали эвтаназии. d,e, мышам K18-hACE2 интраназально инокулировали 1 × 104 БОЕ WT (n=14 мышей), Omi-S (n=14 мышей) и Omicron (n {{ 20}} мышей). Образцы легких инфицированных мышей собирали через 2 или 4 дня на дюйм для определения титра вируса (n=4 мышей) (d) или для иммуногистохимического (ИГХ) обнаружения белка N (n=3 мышей). (е). На рисунке e представлены репрезентативные изображения IHC, показывающие SARS-CoV-2 N (коричневый цвет) в альвеолах (стрелки) и бронхиолах (наконечники стрел) в легких мышей при разрешении 2 dpi. Масштабные линейки, 100 мкм. е, процент N-положительных бронхиол в легких инфицированных мышей (n=3 мышей) через 2 дпи. Каждая точка представляет собой зараженную мышь. Статистическую значимость определяли с использованием двустороннего непарного t-критерия с коррекцией Уэлча (a,b,d,f) и логрангового критерия (Мантела-Кокса) (c). *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 и ****P <0,0001; НС, не существенно.

В легких мышей K18-hACE2, тогда как Omi-S вызывал обширную бронхиальную инфекцию и повреждение, как Omicron, так и Omi-S/nsp6 показали снижение инфекции без признаков повреждения эпителия (рис. 3f). В соответствии с этими результатами, легкие мышей, инфицированных Omi-S/nsp6-, продуцировали титры вируса, эквивалентные тем, которые наблюдались для rOmicron и изолята Omicron (рис. 3g). Наконец, 71% мышей, инфицированных Omi-S/nsp6, выжили (рис. 3h) – в отличие от выживаемости только 20%, наблюдавшейся у мышей, инфицированных Omi-S (рис. 2c). В целом, эти результаты показывают, что мутаций в S и nsp6 достаточно, чтобы определить ослабленную вирулентность Омикрона. Эти наблюдения подтверждают и дополнительно расширяют результаты предыдущего исследования, показывающего, что мутации в регионе 5'-UTR-nsp12, в котором находится nsp6, способствуют ослаблению Omicron у мышей K18-hACE230.

Рис. 3|Мутации в S и nsp6 определяют патогенность Omicron.a–d, кинетика репликации указанных репортерных вирусов mNeonGreen в клетках ACE2/TMPRSS2/Caco-2 (MOI=0.01), определяемая методом потока цитометрия (n=3 повторов) (a, c) и анализ бляшек (n=3 повторов) (b, d). Эксперименты повторялись дважды. e, клетки ACE2/TMPRSS2/Caco-2 были инфицированы смесями вирусов в соотношении 1:1 для получения окончательного MOI 0.005 для каждого вируса. . Клетки фиксировали в указанные моменты времени и анализировали методом проточной цитометрии. Показан процент неинфицированных, однократно и дважды инфицированных клеток. Для компенсации использовали однократно инфицированные клетки. Отдельные точки данных нанесены на график вместе со средним значением ± стандартное отклонение (n=3 повторов). Эксперимент повторили дважды. f–h, мышам K18-hACE2 интраназально инокулировали 1 × 104 БОЕ вирусов. Образцы легких инфицированных мышей собирали через 2 дня на дюйм для ИГХ-детектирования белка N (n=3 мышей) (f) или для определения титров вируса (n=4 мышей) (g). На рисунке f на вставках показаны репрезентативные изображения окрашивания H&E N-положительных бронхиол. Некроз бронхиолярного эпителия указан стрелками. Никаких признаков некроза не наблюдалось в бронхиолах мышей, инфицированных Omicron или Omi-S/nsp6. Масштабная линейка, 100 мкм. Правый график на f показывает процент N-положительных бронхиол в легких инфицированных мышей. Каждая точка представляет собой зараженную мышь. ч. Выживаемость инфицированных мышей контролировали ежедневно в течение 14 дней. Мышей, потерявших 20% от первоначальной массы тела, подвергали эвтаназии. Статистическую значимость определяли с использованием двустороннего непарного t-критерия с коррекцией Уэлча (a–g) и логрангового критерия (Мантела-Кокса) (h). *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 и ****P <0,0001; НС, не существенно.

S-белок RBM способствует побегу вакцины Omicron

В большом объеме литературы представлены доказательства значительного выхода Омикрона из-под гуморального иммунитета, вызванного вакциной14,19. Чтобы определить S-области, которые связаны с фенотипом иммунного ускользания Омикрона, мы сначала сравнили in vitro нейтрализующую активность сывороток вакцинированных лиц против WT SARS-CoV-2 (США-WA1/20) 20), Оми-С и Омикрон. Сыворотка, собранная в течение двух месяцев после второй дозы вакцины мРНК -1273 (вакцина мРНК Moderna; n=12) или BNT162b2 (вакцина мРНК Pfizer-BioNTech; n=12) была включена (Расширенные данные) Таблица 1). Мы провели многоцикловый анализ нейтрализации, используя условия, в которых вирус и нейтрализующая сыворотка присутствовали постоянно, имитируя ситуацию у серопозитивного человека. Все сыворотки плохо нейтрализуют Омикрон, в 11,1-кратном (диапазон: от 4,4-кратного до 81,2-кратного; P < 0,0001) нижнем полумаксимальном нейтрализующем разведении (ND50). для Омикрона по сравнению с WA1 (рис. 4а,б). Фактически, около 80% образцов не полностью нейтрализовали Омикрон при самой высокой протестированной концентрации (Расширенные данные, рис. 10). Примечательно, что Omi-S продемонстрировал идентичные значения ND50 с Omicron (в 11,5- раз ниже, чем у WA1; P <0,0001) (рис. 4a,b), что позволяет предположить, что белок Omicron S при включении в WT вирус, ведет себя так же, как и в Омикроне.

Рис. 4|Роль S в иммунной резистентности к Омикрону. Значения ND50 для WA1, Omi-S и Omicron в сыворотках от лиц, получивших две инъекции вакцины Moderna (доноры 1–12) или Pfizer (доноры 13–24) (более подробная информация о сыворотках представлена ​​в расширенном разделе). Таблица данных 1; отдельные кривые показаны на рис. 1 расширенных данных 0). б, Траектории значений ND50 в зависимости от WA1, Omi-S и Omicron (данные из a нанесены на график). Указано кратное изменение значений ND50 (n=24 образцов сыворотки). в – е, Схема химерных (слева; в, г) и мутантных (слева; д, е) вирусов. Нумерация аминокислот для мутантов WA1 в e основана на последовательности WA1 S, тогда как нумерация мутантов Omicron в f основана на последовательности S Omicron. Были протестированы шесть из 24 сывороток (3 от Moderna и 3 от Pfizer). Каждый образец сыворотки представлен точкой определенного цвета. Данные представлены как кратность изменения родительского вируса. Статистическую значимость определяли с использованием двустороннего непарного t-критерия с поправкой Уэлча. *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 и ****P <0,0001; НС, не существенно.

Белок S SARS-CoV-2 состоит из двух доменов: домена S1, который взаимодействует с рецептором ACE2, и домена S2, который отвечает за слияние мембран32. Внутри домена S1 лежат N-концевой домен (NTD) и рецептор-связывающий домен (RBD), который содержит рецептор-связывающий мотив (RBM), который осуществляет прямой контакт с рецептором ACE233. NTD Omicron S имеет 11 аминокислотных замен, включая 6 делеций и одну вставку длиной 3-аминокислоты, тогда как RBD содержит 15 мутаций, 10 из которых сосредоточены в RBM (расширенная Данные рис. 1). И NTD, и RBD нейтрализуют эпитопы хозяина34–37, но RBD является иммунодоминантным и представляет собой основную мишень нейтрализующей активности, которая присутствует в иммунных сыворотках к SARS-CoV-237,38. Чтобы определить, вызван ли фенотип устойчивости к нейтрализации Омикрона мутациями в определенном домене белка S, мы создали две группы химерных вирусов. Первую группу составил вирус WA1, несущий NTD, RBD или RBM Omicron (рис. 4в), а вторую группу — вирус Omi-S, несущий NTD, RBD или RBM WA1 (рис. 4г). Анализ нейтрализации показал, что мутации в RBM были основной причиной устойчивости Омикрона к гуморальному иммунитету, индуцированному вакциной: замена RBM WA1 на Omicron снижала ND50 в 5,4-раз (P <0,0001), и, наоборот, замена RBM Omi-S на WA1 увеличила ND50 в 5,6- раз (P=0,0003) (рис. 4c,d). Тот факт, что ни один из вирусов-заменителей RBM не достиг разницы примерно в 11- раз, которая наблюдалась между WA1 и Omi-S, позволяет предположить, что мутации в других частях S также способствуют устойчивости к вакцинам.

Чтобы выяснить, приводят ли специфические мутации в Omicron RBM к ускользанию от вакцины, мы создали две дополнительные панели рекомбинантных вирусов: одна с WA1 S, несущая мутации Omicron RBM, по отдельности или в комбинации (рис. 4e), а другая с Omicron S, не обладающая такими же мутациями. набор мутаций (рис. 4е). Два мутанта WA1 - мутант 3 (с заменой E484A) и мутант 4 (несущий кластер из пяти замен Q493R, G496S, Q498R, N501Y и Y505H) - продемонстрировали умеренное, но статистически значимое снижение в 1,4-раз ( P=0.0002) и 1.8- раз (P=0.0003) в значениях ND50 соответственно по сравнению с WA1 (рис. 4e). Противоположное наблюдалось, когда эти мутации были удалены из Omicron S; мутант Omicron 3 (отсутствующий замены E484A) и мутант 4 (отсутствующий Q493R, G496S, Q498R, N501Y и Y505H) имели 1.9-кратное (P=0.0082) и 3.{{38 }}кратно (P=0.0025) более высокие значения ND50 по сравнению с Omicron (рис. 4f). Поскольку ни один из мутантов не уловил общий фенотип Омикрона, мы предполагаем, что ускользание от вакцины является кумулятивным эффектом мутаций, распределенных по длине белка S. Возможно, мутации изменяют конформацию Омикрона S таким образом, что большинство иммунодоминантных нейтрализующих эпитопов разрушаются и становятся недоступными для нейтрализации.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Обсуждение

Это исследование дает ключевую информацию о вирусных белках, которые способствуют патогенности SARS-CoV-2. Мы показываем, что S, наиболее мутированный белок в Омикроне, играет неполную роль в ослаблении Омикрона. В анализах клеточной инфекции вирус Omi-S демонстрирует промежуточную эффективность репликации между предковым вирусом и Omicron. Аналогично, у мышей K18-hACE2 Omi-S контрастирует с нефатальным Omicron и приводит к 80% смертности; предковый вирус вызывает 100% смертность у этих мышей. Примечательно, что когда мы объединили мутации S с мутациями в nsp6, вирус продемонстрировал ослабленный фенотип, во многом напоминающий фенотип Omicron, что указывает на то, что эти два белка являются основными детерминантами патогенности Omicron. Будущие исследования позволят расшифровать механизм(ы), с помощью которых мутации nsp6 влияют на репликацию вируса.

Одним из потенциальных ограничений нашего исследования является использование мышей K18-hACE2 для изучения патогенеза вместо моделей приматов, которые имеют больше сходства с людьми39. Однако следует отметить, что мыши K18-hACE2 являются хорошо зарекомендовавшей себя моделью для изучения летального фенотипа SARS-CoV-24,31. Хотя у этих мышей после заражения SARS-CoV-2 развивается патология легких, смертность связана с поражением центральной нервной системы из-за вирусной нейроинвазии и диссеминации31,40. Тот факт, что заражение мышей K18-hACE2 Omi-S, а не Omicron, вызывает неврологические симптомы (например, сгорбленную позу и отсутствие реакции), позволяет предположить, что свойство нейроинвазии сохраняется у Omi-S, вероятно, в результате его более высокой эффективности репликации и того, что детерминанты этого свойства лежат за пределами белка S. Эти результаты согласуются с предыдущим исследованием, показавшим, что хомяки, инфицированные Omi-S, выделяют значительно больше вируса и теряют больше веса, чем инфицированные Omicron, что позволяет предположить, что мутации за пределами S способствуют снижению патогенности Omicron41.

Мы обнаружили, что, хотя предковый вирус в основном реплицируется в альвеолах легких и вызывает лишь редкую инфекцию бронхиол у мышей K18-hACE2, как Omi-S, так и Omicron проявляют повышенную склонность к репликации в бронхиолярном эпителии, что указывает на то, что S белок ответственен за измененный тропизм. Механизм этого переключения неизвестен, но возможно, что Omicron S более эффективен, чем WTS S, при использовании катепсина B или катепсина L (ссылки 25,42,43), которые образуют активный путь проникновения вируса в бронхиолы и другие дыхательные пути. клетки41. Напротив, проникновение SARS-CoV-2 в альвеолярные эпителиальные клетки в основном обусловлено TMPRSS2 (ссылки 28,44), который Omicron S не может использовать25,45, что приводит к плохой инфекции этих клеток4,5. ,25,43. Эти результаты могут объяснить ослабление патологии легких, вызванной Омикроном.

Преимущества цистанхе – укрепляют иммунную систему

Omicron nsp6 имеет два измененных сайта по сравнению с прототипом изолята SARS CoV-2 Wuhan-Hu-1: делецию трех аминокислот (LSG, позиции 105–107) и замену I189V (рис. расширенных данных). 9). Описано несколько функций nsp6 в репликации коронавируса; главным из них является биогенез двухмембранных везикул (DMV), которые представляют собой место синтеза вирусной РНК46–50. Предыдущее исследование показало, что DMV SARS-CoV-2 в основном генерируются согласованным действием трех вирусных белков: nsp3, nsp4 и nsp6; хотя nsp3 и nsp4 достаточны для образования DMV, nsp6 соединяет эти DMV с эндоплазматическим ретикулумом и обеспечивает необходимую связь между этими структурами46. Влияет ли совокупность мутаций Omicron nsp6 на формирование или функции DMV, требует дальнейшего изучения. Nsp6 также активирует NLR3-зависимую выработку цитокинов и пироптоз в легких пациентов с COVID-19, выступая в качестве ключевого фактора вирулентности47. Следует отметить, что вариант nsp6, который связан с бессимптомным течением COVID-19, демонстрирует пониженную способность индуцировать пироптоз47, что дает основание предположить, что мутации в Omicron nsp6 также могут влиять на пироптоз. Для анализа влияния мутаций Омикрона на функции nsp6 потребуются детальные механистические исследования.

В настоящее время неизвестно, работают ли мутации в S и nsp6 совместно друг с другом, вызывая ослабление Омикрона. Учитывая, что Omicron S продемонстрировал более высокую склонность к бронхиолам, возможно, что S ответственен за измененный вирусный тропизм, тогда как неспайковые мутации, в том числе в nsp6-, являются всего лишь адаптацией к изменившейся тканевой среде. Стоит отметить, что, хотя nsp6, по-видимому, является основным белком без шипов, ответственным за ослабление Омикрона, нельзя полностью исключить вклад других вирусных белков. Все эксперименты in vitro по изучению роли неспайковых мутаций проводились в клетках ACE2/TMPRSS2/Caco-2. Использование других, более иммунокомпетентных типов клеток может выявить и эффект других неспайковых мутаций. Кроме того, наши химерные вирусы содержали Омикрон S в паре только с одним белком без шипов одновременно, что ограничивало долгосрочные эпистатические взаимодействия между мутациями в нескольких вирусных белках.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Наше исследование показывает, что мутации в RBM Омикрона S являются основными детерминантами ухода Омикрона от нейтрализующих антител, хотя мутации в других областях S также вносят свой вклад. В рамках RBM мы идентифицируем две горячие точки мутаций, которые придают Omicron S способность противостоять нейтрализации: одна несет замену E484A, а другая содержит кластер из пяти замен — Q493R, G496S, Q498R, N501Y и Y505H. Было показано, что замена E484A избегает нейтрализации сывороткой выздоравливающих51. Более того, структурное моделирование предполагает, что некоторые терапевтические моноклональные антитела образуют высокостабильные солевые мостики с остатком E484, полностью теряя свое связывание при замене этого остатка на A или после изменений Q493K и Y505H52. Аналогичным образом, картирование остатков RBM, которые напрямую взаимодействуют с 49 известными нейтрализующими антителами, выявило N440, G446, S477 и T478 как низкочастотные интеракторы, N501, Y505 и Q498 как среднечастотные интеракторы, а E484 и Q493 как высокочастотные интеракторы53. , в соответствии с нашими результатами анализа нейтрализации. Примечательно, что хотя потенциал связывания антител Омикрона S нарушен54, его способность связывания рецепторов остается неизменной. Фактически, RBD Omicron имеет более высокое сродство к ACE2 по сравнению с RBD Ухань-Ху-1 и Delta25. Это указывает на то, что мутации Omicron S развились таким образом, что они препятствуют связыванию антител, но сохраняют взаимодействие с рецепторами. Это открывает возможность нацеливания на консервативные и структурно ограниченные области S, которые участвуют в распознавании ACE2, для разработки вакцин широкого спектра действия для борьбы с пандемией COVID-19.

Рекомендации

1. Лю Л. и др. Поразительное уклонение от антител, проявленное вариантом Омикрон SARS-CoV-2. Природа 602, 676–681 (2022).

2. Планас Д. и др. Значительный выход SARS-CoV-2 Омикрон из-за нейтрализации антителами. Природа 602, 671–675 (2022).

3. Шмидт Ф. и др. Плазменная нейтрализация SARS-CoV-2 варианта Омикрон. Н. англ. Дж. Мед. 386, 599–601 (2022).

4. Шуай Х. и др. Ослабленная репликация и патогенность SARS-CoV-2 B.1.1.529 Омикрон. Природа 603, 693–699 (2022).

5. Хафманн П.Дж. и др. Вирус SARS-CoV-2 Омикрон вызывает ослабленное заболевание у мышей и хомяков. Природа 603, 687–692 (2022).

6. Льюнард, Дж. А. и др. Клинические исходы, связанные с инфекцией варианта SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) и субварианта BA.1/BA.1.1 или BA.2 в Южной Калифорнии. Нат. Мед. 28, 1933–1943 (2022).

7. Уолтер Н. и др. Ранняя оценка клинической тяжести варианта омикрон SARS-CoV-2 в Южной Африке: исследование связи данных. Ланцет 399, 437–446 (2022).

8. Уллоа, А.С., Бьюкен, С.А., Дейнман, Н. и Браун, К.А. Оценка тяжести варианта SARS-CoV-2 Омикрон в Онтарио, Канада. Варенье. Мед. доц. 327, 1286–1288 (2022).

9. Ураки Р. и др. Характеристика изолятов SARS-CoV-2 Omicron BA.4 и BA.5 у грызунов. Природа 612, 540–545 (2022).

10. Ураки Р. и др. Характеристика и противовирусная чувствительность SARS-CoV-2 Омикрон BA.2. Природа 607, 119–127 (2022).

11. Дайер, О. Covid-19: Омикрон вызывает больше инфекций, но меньше госпитализаций, чем Дельта, данные из Южной Африки. Бр. Мед. Дж. 375, n3104 (2021).

12. Сигал А. Легкая болезнь при применении Омикрона: вирус или уже существующий иммунитет? Нат. Преподобный Иммунол. 22, 69–71 (2022).

13. ВОЗ. Отслеживание вариантов SARS-CoV-2 https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS CoV-2-variants/ (2022 г.).

14. Селе С. и др. Омикрон в значительной степени, но не полностью избегает нейтрализации Pfizer BNT162b2. Природа 602, 654–656 (2022).

15. Гу Х. и др. Вероятная передача варианта омикрон SARS-CoV-2 в карантинном отеле, Гонконг, Китай, ноябрь 2021 г. Неотложная помощь. Заразить. Дис. 28, 460–462 (2022).

16. Юлиано А.Д. и др. Тенденции тяжести заболевания и обращения за медицинской помощью в период раннего варианта Омикрона по сравнению с предыдущими периодами высокой передачи SARS-CoV-2 — США, декабрь 2020 г. – январь 2022 г. Morb. Смертный. Еженедельный отчет 71, 146–152 (2022 г.).

17. ЦКЗ. Средство отслеживания данных о COVID https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#variant-proportions (2022 г.).

18. Тейлор, Л. Ковид-19: Компания Omicron достигает еженедельного рекордного уровня числа глобальных инфекций. Бр. Мед. Дж. 376, о66 (2022).

19. Дежнираттисай В. и др. SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 приводит к повсеместному уклонению от реакции нейтрализующих антител. Ячейка 185, 467–484 (2022 г.).

20. Сузуки Р. и др. Ослабленная фузогенность и патогенность SARS-CoV-2 варианта Омикрон. Природа 603, 700–705 (2022).

21. Смит, Д.С. и др. Отслеживание загадочных линий SARS-CoV-2, обнаруженных в сточных водах Нью-Йорка. Нат. Коммун. 13, 635 (2022).

22. Кирби А.Е. и др. Заметки с мест: ранние свидетельства наличия варианта SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Омикрон) в бытовых сточных водах - США, ноябрь – декабрь 2021 г. Morb. Смертный. Еженедельный отчет 71, 103–105 (2022 г.).

23. Херрманн А. и др. Клонирование беспассажного генома SARS-CoV-2 и мутагенез с использованием красной рекомбинации. Межд. Дж. Мол. наук. 22, 10188 (2021).

24. Лю, Г. и Гак, М.Ю. Оптимизированный метод, основанный на реакции кольцевого полимеразного удлинения, для функционального анализа SARS-CoV-2. Препринт на https://doi.org/10.1101/2022.11.26.518005 (2022).

25. Мэн Б. и др. Изменение использования TMPRSS2 SARS-CoV-2 Omicron влияет на тропизм и фузогенность. Природа 603, 706–714 (2022).

26. Уиллетт, Б.Дж. и др. SARS-CoV-2 Омикрон — это ускользающий от иммунитета вариант с измененным путем проникновения в клетки. Нат. Микробиол. 7, 1161–1179 (2022).

27. Мартинес РБ и др. Патология и патогенез SARS-CoV-2, связанного со смертельным коронавирусным заболеванием, США. Экстрен. Заразить. Дис. 26, 2005–2015 (2020).

28. Хуанг Дж. и др. Инфицирование SARS-CoV-2 альвеолярными клетками легких человека 2 типа, полученными из плюрипотентных стволовых клеток, вызывает быструю эпителиально-собственную воспалительную реакцию. Cell Stem Cell 27, 962–973 (2020).

29. Мулай А. и др. Инфекция SARS-CoV-2 первичного эпителия легких человека для моделирования COVID-19 и разработки лекарств. Cell Rep. 35, 109055 (2021).

30. Лю, С., Селварадж, П., Сангаре, К., Луан, Б. и Ван, Т.Т. Независимое от белка спайка ослабление варианта SARS-CoV-2 Omicron у лабораторных мышей. Cell Rep. 40, 111359 (2022).

31. Кароссино М. и др. Фатальная нейродиссеминация и тропизм SARS-CoV-2 у мышей K18-hACE2 лишь частично зависят от экспрессии hACE2. Вирусы 14, 535 (2022).

32. Хуанг Ю., Ян К., Сюй К.Ф., Сюй В. и Лю С.В. Структурные и функциональные свойства шиповидного белка SARS CoV-2: потенциальная разработка антивирусного препарата для лечения COVID-19 . Акта Фармакол. Грех. 41, 1141–1149 (2020).

33. Лан Дж. и др. Структура домена, связывающего шиповый рецептор SARS-CoV-2, связанного с рецептором ACE2. Природа 581, 215–220 (2020).

34. Чи, X. и др. Нейтрализующее человеческое антитело связывается с N-концевым доменом белка Spike SARS-CoV-2. Наука 369, 650–655 (2020).

35. Восс, В.Н. и др. Преобладающее, защитное и конвергентное распознавание IgG эпитопов шипов SARS-CoV-2, не относящихся к RBD. Наука 372, 1108–1112 (2021).

36. Премкумар Л. и др. Рецептор-связывающий домен вирусного шиповидного белка является иммунодоминантной и высокоспецифичной мишенью антител у пациентов с SARS-CoV-2. наук. Иммунол. 5, eabc8413 (2020).

37. Джу, Б. и др. Человеческие нейтрализующие антитела, вызванные инфекцией SARS-CoV-2. Природа 584, 115–119 (2020).

38. Пикколи Л. и др. Картирование нейтрализующих и иммунодоминантных сайтов в домене, связывающем шиповый рецептор SARS-CoV-2, с помощью структурно-ориентированной серологии высокого разрешения. Ячейка 183, 1024–1042 (2020 г.).

39. Чанг М.К., Хильд С. и Гридер Ф. Модели приматов, не относящихся к человеку, для исследования SARS-CoV-2: рассмотрите альтернативы макакам. Лаборатория Аним. 50, 113–114 (2021).

40. Кумари П. и др. Нейроинвазия и энцефалит после интраназальной инокуляции SARS CoV-2 мышам K18-hACE2. Вирусы 13, 132 (2021).

41. Пикок Т.П. и др. Измененный путь проникновения и антигенное расстояние варианта SARS-CoV-2 Omicron сопоставлены с отдельными доменами шиповидного белка. Препринт на https://doi.org/ 10.1101/2021.12.31.474653 (2022).

42. Падманабхан, П. и Диксит, Н.М. Моделирование того, как измененное использование путей проникновения в клетки вариантом SARS-CoV-2 Omicron может повлиять на эффективность и синергизм ингибиторов TMPRSS2 и катепсина B/L. Препринт на https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476267 (2022).

43. Хуэй, KPY и др. Репликация варианта SARS-CoV-2 Омикрон в бронхах и легких человека ex vivo. Природа 603, 715–720 (2022).

44. Грау-Экспозито Дж. и др. Оценка проникновения SARS-CoV-2, воспаления и новых методов лечения в клетках легочной ткани человека. PLoS Патог. 18, e1010171 (2022).

45. Чжао Х. и др. Вариант SARS-CoV-2 Omicron демонстрирует менее эффективную активность репликации и слияния по сравнению с вариантом Delta в клетках, экспрессирующих TMPRSS2-. Экстрен. Микробы заражают. 11, 277–283 (2022).

46. ​​Риккарди С. и др. Роль NSP6 в биогенезе органеллы репликации SARS-CoV-2. Природа 606, 761–768 (2022).

47. Сан, X. и др. Неструктурный белок 6 SARS-CoV-2 запускает NLRP3-зависимый пироптоз, воздействуя на ATP6AP1. Гибель клеток. Разница. 29, 1240–1254 (2022).

48. Коттам, Э.М., Велбанд, М.К. и Уайлман, Т. Коронавирус NSP6 ограничивает расширение аутофагосом. Аутофагия 10, 1426–1441 (2014).

49. Бенвенуто Д. и др. Эволюционный анализ SARS-CoV-2: как мутация неструктурного белка 6 (NSP6) может повлиять на вирусную аутофагию. Дж. Заразить. 81, с24–е27 (2020).

50. Госерт Р., Канджанахалуэтай А., Эггер Д., Биенц К. и Бейкер С.С. Репликация РНК вируса гепатита мыши происходит в двухмембранных везикулах. Дж. Вирол 76, 3697–3708 (2002).

51. Лю З. и др. Идентификация пиковых мутаций SARS-CoV-2, которые ослабляют нейтрализацию моноклональных и сывороточных антител. Клетка-хозяин Microbe 29, 477–488 (2021).

52. Шах, М. и Ву, Х.Г. Омикрон: сильно мутированный вариант SARS-CoV-2 демонстрирует более сильное связывание с ACE2 и эффективно ускользает от одобренных терапевтических антител против COVID-19. Передний. Иммунол. 12, 830527 (2021).

53. Йе Г., Лю Б. и Ли Ф. Крио-ЭМ структура эктодомена белка омикронного шипа SARS-CoV-2. Нат. Коммун. 13, 1214 (2022).

54. Каррено, Дж.М. и др. Активность реконвалесцентной и вакцинной сыворотки против SARS-CoV-2 Омикрон. Природа 602, 682–688 (2022).