Вэнь-Лан Ли, Цзин-Синь Дин, Цзин Бай, Ян Ху, Хуэй Сун, Сян-Мин Сунь, Ю-Бин Джи

Для получения более подробной информации, пожалуйста, свяжитесь с:Joanna.jia@wecistanche.com

Абстрактный

LC Technology – признанный метод, используемый во всем мире для оценки качества традиционной китайской медицины (ТКМ). Качество ТКМ напрямую влияет на его эффективность. Поэтому, чтобы досконально раскрыть, как ТКМ проявляет свою эффективность, в первую очередь необходимо понять материальную основу ее эффективности, а затем контролировать качество активных соединений. Применение метода соотношения спектр-эффект имеет решающее значение для определения фармакологической основы материала. Цель этой статьи состояла в том, чтобы исследовать лежащие в основе корреляции между химическими профилями и эстрогенной активностьюЦистанхе, чтобы выявить активные соединения. Химические профилиЦистанхерегистрировали с помощью ВЭЖХ/Q-TOF-MS/MS, а эстрогенную активность определяли с помощью теста роста матки и анализа МТТ. Затем, объединив результаты двумерного анализа, анализа основных компонентов и метода корреляционного анализа Грея, было идентифицировано пятнадцать активных соединений. Это 8-эпилогановая кислота, салидрозид, сирингалид A, 3'- -l-рамнопиранозид, цистанозид A, эхинакозид, цистанозид F, цистанозид B, цистанозид C, османтузид B, актеозид, изоактеозид, тубулозид B, 2 -ацетилактеозид и два неизвестных соединения. Это исследование закладывает основу для изучения in vivoЦистанхеи для разработки его клинического применения.

Цистанхетрубчатый

Ключевые слова:Цистанхепустынная; ЖХ/Q-TOF-МС; эстрогенная активность; анализ главных компонентов (PCA); Тест роста матки.

Сокращения

ТКМ: традиционная китайская медицина

ВЭЖХ/квадрупольно-времяпролетная масс-спектрометрия: высокоэффективная жидкостная хроматография/квадрупольная времяпролетная масс-спектрометрия

BA: двумерный анализ

PCA: анализ основных компонентов

GCAM: метод серого корреляционного анализа

МТТ: трипсин, 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, 5-дифенилтетразолийбромид

ДМСО: диметилсульфоксид

RPMI1640 Мемориальный институт Розуэлл Парк 1640

1. Введение

В последнее время ТКМ становится все более популярной в странах Азии и Запада благодаря стабильному терапевтическому эффекту и низкой токсичности в клинике. В результате необходимо разработать новые типы ТКМ и понять эффективные композиции, используемые во время их клинического применения [1-6].

Во-первых, изучается взаимосвязь спектр-эффект, чтобы выявить корреляцию между хроматографическим отпечатком пальца и фармакодинамической эффективностью. Затем, используя взаимосвязь, искать эффективные компоненты в ТКМ и формулировать стандарты контроля, отражающие их внутреннее качество. Соотношение спектр-эффект применялось во многих областях исследований ТКМ, таких как материальная основа одиночных и составных ТКМ, совместимость компонентов, механизм обработки, прогноз фармакологического эффекта и оптимизация технологии [7-12]. Соотношение спектр-эффект используется для выдвижения новых идей и методов исследования активных веществ, оптимизации формул, улучшения процессов приготовления, отслеживания и разделения целевых ингредиентов, а также для разработки новых препаратов традиционной китайской медицины [13-17].

Цистанхешироко используется для лечения сексуальной дисфункции, запоров, простатита и почечной недостаточности. Он обладает широким спектром биологической активности, включая эстрогенный эффект, омолаживающее, антиоксидантное и иммунное действие [18-19]. Как правило, фенилэтаноидные гликозиды (такие как цистанозид А, тубулозид А), лигнаны и иридоидные гликозиды считались фармакологическими составляющими и химическими маркерами для контроля качества Цистанхе и его продуктов [20-21]. Химические спектры цистанхе из разных мест регистрировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [22-23]. В этом исследовании мы выбираем тест роста матки и анализ пролиферации клеток MCF7 для оценки их эстрогенной активности. Методы анализа основных компонентов, двумерного анализа и корреляционного анализа Грея использовались для корреляции эстрогенной активности с отдельными компонентами. Это исследование было направлено на выявление биоактивных соединений цистанхе, ответственных за эстрогенные эффекты in vivo. Исследование закладывает основу для углубленного изучения Cistanche.

Все экспериментальные процедуры были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике животных Харбинского университета торговли.

ЦистанхеDeserticola (cd-20120227-005) был куплен на рынке наркотиков и идентифицирован профессором Чжан Деляном (Харбинский университет торговли). Диэтилстилбестрол был приобретен у HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 и RPMI1640 без фенолового красного были приобретены у компании HyClone (США). МТТ и ДМСО были приобретены у Sigma-Aldrich Co. LLC (Сент-Луис, США). Линия клеток рака молочной железы человека MCF7 была предоставлена ​​Исследовательским центром наук о жизни и окружающей среды (Харбинский университет торговли). Используемые стандарты были следующими: актеозид (111530- 200505), эхинакозид (111670-200503) и салидрозид (110736-200628) были получены из Национального института контроля фармацевтических и биологических продуктов (Пекин). , Китай). Ацетонитрил, метанол и муравьиная кислота имели квалификацию MS, тогда как вода была сверхчистой. Остальные реагенты имели аналитическую чистоту и были коммерчески доступны.

2 Экспериментальная процедура

2.1 Материалы

Для аналитических химических экспериментов и обработки данных использовались система ВЭЖХ Agilent 1290, квадрупольная времяпролетная система ЖХ-МС (квадрупольно-времяпролетная) Agilent 6530 и рабочие станции для химической ВЭЖХ-3D. Для приготовления образцов и стандартов использовали сверхчистую воду Milli-Q. Дополнительные инструменты включали электронные аналитические весы AR1140 (Ohaus International Ltd), считыватель микропланшетов 680 (Bio-Rad Corporation) и высокоскоростную центрифугу 64R (Beckman Coulter Allegra).

Неполовозрелых самок мышей Куньмин (около 21 дня рождения, отнятых от груди) весом (12 ± 2) г приобретали в Чанчуньском национальном центре биопромышленных лабораторных животных (Чанчунь, Китай). Мышей содержали в помещении с регулируемой температурой (22±2°С) с неограниченным доступом к пище и воде. Эксперименты на животных начинали после пяти дней акклиматизации. Перед введением тестируемых растворов мышей не кормили в течение ночи при свободном доступе к воде. Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья.

2.2 Приготовление раствора пробы

Цистанхеобразцы были собраны из десяти различных мест обитания, а именно Нэймэн, Синьцзян, Нинся, Гуйчжоу, Чайдаму, Сизан, Алашань, Цинхай, Сычуань и провинция Хубэй.

Раствор (1,0 г/мл)ЦистанхеОбразец готовили на дистиллированной воде для приема внутрь. Концентрация диэтилстилбоэстрола составляла 20мкг/мл, и его использовали в качестве положительного контрольного раствора. Раствор (1,0 г/мл) образца Cistanche готовили в 50% ацетонитриле. Актеозид, эхинакозид и салидрозид (по 2,0 мг каждого) растворяли в 10 мл 50%-ного раствора ацетонитрила. И образец, и стандартные растворы перед анализом фильтровали с использованием фильтра 0,{9}} мкм.

2.3 Условия ЖХ-МС

Для анализа образцов использовали Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 мм × 15 0 мм, 5 мкм; Waters Corporation, Милфорд, Массачусетс, США). Подвижная фаза состояла из ацетонитрила (А) и 0,2% (об./об.) водного раствора муравьиной кислоты (В) и прокачивалась насосом со скоростью потока 0,5 мл/мин. Объем инъекции каждого образца составлял 10 мкл. Программа градиентного элюирования была следующей: подвижная фаза А инициировалась при 5% и линейно повышалась до 23% через 35 мин. Затем раствор А увеличивали до 25 процентов (от 35 до 65 минут). Затем подвижную фазу А уменьшали до 5 процентов в течение последних 5 минут эксперимента (от 65 до 70 минут). Температуру колонки поддерживали на уровне 30 градусов. Хроматограммы контролировали при 254 нм. Давление газа распыления составляло 30 фунтов на квадратный дюйм, а капиллярное напряжение составляло 3,5 кВ. Скорость потока сухого газа была установлена ​​на уровне 8 л/мин при температуре 30 градусов. Масс-спектры были записаны в диапазоне сканирования 100- 3, 000 Да в режиме сканирования отрицательных ионов.

2.4 Оценка отпечатков пальцев

LC-отпечатки образцов, собранных из 10 различных партий, были установлены и сопоставлены автоматически с использованием системы оценки сходства для хроматографических отпечатков пальцев традиционной китайской медицины (версия 2012; Китайский фармакопеный комитет, Пекин, Китай). Кроме того, эталонная карта хроматограммы была создана с использованием медианного метода. Кроме того, был применен кластерный анализ для оценки качества образцов из десяти различных местообитаний.

2.5 Анализ главных компонентов (PCA)

PCA представляет собой многомерный статистический метод. Он может сохранить достаточно информации от сбора данных. В настоящем исследовании характерные пики на ЖХ-хроматограммах подвергались дальнейшему скринингу с помощью РСА и были нацелены на идентификацию активных соединений на основе соотношения спектр-эффект.

2.6 Тест роста матки

Мыши были разделены на 12 групп (10 в группе). Растворы образцов, приготовленные из цистанхе, собирали в десяти различных местообитаниях и вводили два раза в день (утром и вечером) через желудочный зонд в дозе 30 г/кг массы тела в течение четырех дней. Контрольные группы и группы положительного контроля включали равные объемы дистиллированной воды и раствора диэтилстильбэстрола и вводились два раза в день в течение четырех дней. На пятый день у анестезированных мышей брали образцы крови, содержащие лекарство. Образцы центрифугировали (5,000 об/мин, 10 мин) и отделяли супернатанты (образцы сыворотки, содержащие лекарство). Образцы сыворотки, содержащие лекарство, инактивировали нагреванием при 56°С на водяной бане в течение 30 мин и фильтровали через фильтр 0,22- мкм перед анализом МТТ. Одновременно матки мышей немедленно вырезали и взвешивали для расчета индексов веса матки. Эксперименты на животных начинали после пяти дней акклиматизации. Мыши голодали в течение ночи со свободным доступом к воде перед введением испытуемых растворов. Настоящее исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья. Все экспериментальные процедуры были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике животных Харбинского университета торговли. Все потенциально стрессовые процедуры проводились под анестезией пентобарбиталом натрия.

2.7 МТТ-анализ

Клетки MCF7 совместно культивировали с RPMI 1640 без фенолового красного (содержащим 5% CDT-FBS) в течение четырех дней. Клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2000 клеток/лунку. Была достигнута адгезионная культура, и после 72 ч культивирования клетки совместно культивировали в среде RPMI 1640, содержащей образцы сыворотки мышей, получавших Цистанхе. Опыты проводились в шести повторностях. Затем в каждую лунку добавляли по 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в PBS) и инкубировали клетки в течение 4 ч. После удаления среды добавляли 150 мкл ДМСО для получения формазана и планшеты встряхивали в темноте до полного растворения. Поглощение измеряли при 570 нм, используя микропланшетный ридер. Скорость пролиферации рассчитывали как среднее значение поглощения группы сыворотки, содержащей лекарственное средство, деленное на среднее значение поглощения контрольной группы (клетки, совместно культивированные в RPMI 1640 без сыворотки).

2.8 Статистический анализ

Стьюдентный критерий парной выборки (двухсторонний) использовали для выявления статистически значимых различий между значениями в пустой контрольной и экспериментальной группах. Различия считались значимыми при 95-процентном уровне достоверности (p <>

РСА использовали для оценки характерных площадей пиков на хроматограммах образцов из десяти различных местообитаний. Для оценки корреляции площадей пиков и их эстрогенной активности использовали двумерный анализ и корреляционный анализ Грея. Корреляцию рассчитывали с помощью статистического программного обеспечения SPSS (SPSS для Windows 21.0, SPSS Inc., США). Различия считались значимыми при 95-процентном уровне достоверности (двусторонний).

Этическое одобрение: Проведенное исследование не связано ни с использованием человека, ни с животными.

3. Результаты и обсуждение

3.1 Кластерный анализ и оценка сходства

Относительное стандартное отклонение времени удерживания и площади характерных пиков составило {{0}},58 и 0,34 процента для точности, 0,52 и {{8}. },31% для воспроизводимости и {{10}},19 и 0,13% для стабильности соответственно. Эти результаты показали, что наш метод установления отпечатков пальцев ЖХ был разумным и надежным. Сходство хроматограмм десяти образцов превышало 0,9. Общие пики для всех образцов не могли полностью отражать характерные составляющие Cistanche, так как пик мог быть потерян. Поэтому число соответствий образца было скорректировано с 26 до 20 для получения более точной карты хроматограммы. Всего было получено 26 пиков, а сумма их площадей превышала 0,8 по сравнению с общей площадью пиков в образце. Поэтому мы пришли к выводу, что эти хроматографические пики могут эффективно отражать основные химические составляющие цистанхе. Результаты кластерного анализа показаны на рис. 1. Всего десять разнообразных местообитаний были разделены на три категории следующим образом: (A) 2, Гуйчжоу; 3, Цинхай; 4, Чайдаму; 10, Нэймэн; 7, Синьцзян и 6, Сычуань. (B) 1, Сизан; 8, Нинся и 5, Алашань. (С) 9, Хубэй. Тенденция кластерного анализа показала, что ареалы лекарственных трав сходны у подножия порога. Но с повышением порога климат и условия произрастания местообитаний сближаются. Это показывает, что кластерный анализ может не только хорошо различать разнообразные места обитания, но и отражать сходство между ними.

3.2 Идентификация химических компонентов

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Чем выше абсолютное значение нагрузки Эйгена, тем выше влияние соединений на эстрогенные показатели.

Хроматограммы цистанхе и стандартных образцов сравнивали для идентификации отдельных компонентов в одинаковых условиях ЖХ-МС. Как показано в Таблице 1, всего было идентифицировано 26 компонентов на основе времени удерживания и данных МС [24-26]. Активные ингредиенты вводят перорально в виде смесей, а не мономеров, поскольку традиционная китайская медицина принимает форму смеси, играющей терапевтическую роль. Было обнаружено, что отдельное соединение после индивидуального разделения не играет никакой роли. Наша цель состоит в том, чтобы выявить соединения, обладающие эстрогенной активностью в известных компонентах цистанхе [23-30], и поэтому не выбирали ЯМР и другие технические средства для проверки их идентичности. Пик 1 указывает на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 373 (C16H22O10), что соответствует элементному составу генипозидовой кислоты. Это подтверждается потерей фрагмента глюкозы, что дает фрагментный ион с отношением m/z 211. Пик 2 указывает на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 461 (C20H30O12), который идентичен элементному составу декафеоилактеозида, и подтверждается потерей рамнозильной части, образуя фрагментацию с отношением m/z 315. Пик 4 указывает на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 375 (C16H24O10), который идентичен элементный состав 8-эпилогановой кислоты. Потеря фрагмента глюкозы, образующая фрагментацию с отношением m/z, равным 213, дополнительно подтверждает вывод. Пик 6 указывает на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 607 (C29H36O14), который идентичен элементному составу сирингалида A3'- -l-рамнопиранозида.

Потеря caff-фрагмента, образующего ион-фрагмент с отношением m/z 445, дополнительно подтверждает вывод. Пик 8 указывает на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 799 (C36H48O20), который идентичен элементному составу цистанозида А. Потеря caff-фрагмента приводит к образованию фрагмента иона с отношением m/z 637, еще больше подтвердил вывод. Пик 11 указывал на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 487 (C21H28O13), который был идентичен элементному составу цистанозида F. Это подтверждалось потерей рамнозильной части, которая давала фрагментный ион с m/z отношение 341, а потеря другого caff-фрагмента образует ион-фрагмент с отношением m/z 179, что дополнительно подтверждает вывод. Пик 12 указывал на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 813 (C37H50O20), который был идентичен элементному составу цистанозида B. Потеря фрагмента глюкозы привела к образованию фрагмента иона с отношением m/z 651, еще больше подтвердил вывод. Пик 13 указывает на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 827 (C37H48O21), который идентичен элементному составу тубулозида А. Потеря рамнозильной части приводит к фрагментации с отношением m/z 681, далее поддержал вывод. Пик 14 указывает на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 637 (C30H38O15), который идентичен элементному составу цистанозида C. Потеря рамнозильной части приводит к образованию фрагмента иона с отношением m/z 491, еще больше подтвердил вывод.

Пик 15 указывает на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 591 (C29H36O13), который идентичен элементному составу османтусида B. Потеря рамнозильной части приводит к образованию фрагмента иона с отношением m/z 445, еще больше подтвердил вывод. Пик 16 указывал на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 623 (C29H36O15), который был идентичен элементному составу актеозида. Потеря caff-фрагмента, образующего ион-фрагмент с отношением m/z 461, дополнительно подтверждает вывод. Пик 18 указывал на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 623 (C29H36O15), который был идентичен элементному составу изоактеозида. Потеря фрагмента caff, передний пик 15, указывала на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 591 (C29H36O13), который был идентичен элементному составу османтусида B. Потеря рамнозильного фрагмента приводила к образованию ионного фрагмента с отношение m/z, равное 445, дополнительно подтверждает вывод. Пик 16 указывал на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 623 (C29H36O15), который был идентичен элементному составу актеозида. Потеря caff-фрагмента, образующего ион-фрагмент с отношением m/z 461, дополнительно подтверждает вывод. Пик 17 указывал на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 623 (C29H36O15), который был идентичен элементному составу цис-актеозида. Потеря фрагмента caff, образованного фрагментом иода фрагмента иона с отношением m/z 461, дополнительно подтверждает вывод. Пик 21 указывал на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 653 (C30H38O16), который был идентичен элементному составу кампнеозида Ⅰ.

Потеря caff-фрагмента привела к образованию ионного фрагмента с отношением m/z 491, а потеря другого рамнозильного фрагмента привела к образованию ионного фрагмента с отношением m/z 345, что дополнительно подтверждает вывод. Пик 22 указывает на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 665 (C31H38O16), который идентичен элементному составу тубулозида B. Потеря фрагмента CH3CO приводит к образованию фрагмента иона с отношением m/z 623, и потеря другого caff-фрагмента привела к образованию фрагмента иона с отношением m/z 461, что еще раз подтверждает вывод. Пик 23 указывал на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 639 (C29H36O16), который был идентичен элементному составу кампнеозида. Потеря рамнозильной части с образованием фрагмента иона с отношением m/z, равным 493, дополнительно подтверждает вывод. Пик 24 указывал на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 665 (C31H38O16), который был идентичен элементному составу 2'-ацетилактеозида. Потеря фрагмента Ac привела к образованию ионного фрагмента с отношением m/z 623, а потеря другого фрагмента caff привела к образованию ионного фрагмента с отношением m/z 461, что дополнительно подтверждает вывод. Пик 25 указывает на преобладающий депротонированный ион с отношением m/z 445 (C20H30O11), который идентичен элементному составу цистанозида G. Потеря рамнозильной части приводит к образованию фрагмента иона с отношением m/z 299, еще больше подтвердил вывод. Структуры соединений перечислены на рисунке 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Эти пики были следующими: 9, 12, 14 и 15. Следовательно, эхинакозид, цистанозид В, османтузид В и актеозид, соответствующие в общей сложности 4 пикам, были выбраны в качестве репрезентативных переменных для эстрогенной активности (рис. 3).

.

3.4 Определение эстрогенной активности

Рассчитывали отношение сырой массы матки к массе тела каждой мыши (фиг. 4). Животные, подвергшиеся воздействию цистанхе из девяти мест обитания, проявляли значительную эстрогенную активность, увеличивая массу матки по сравнению с мышами в контрольной группе. На фигуре 4 дополнительно показана скорость пролиферации клеток MCF7, обработанных сывороткой мышей, получавших Цистанхе. Клетки, обработанные сывороткой мышей, которым вводили Цистанхе из десяти местообитаний, демонстрировали значительно более высокий рост по сравнению с клетками, не подвергавшимися обработке.

3.5 Двумерный анализ

В настоящем исследовании мы наблюдали, что вес матки неполовозрелых самок мышей Kunming увеличился, а пролиферация клеток рака молочной железы человека MCF7 была повышена. Эти данные подтвердили эстрогенную активность цистанхе. На рисунке 5 показаны индексы матки и скорость пролиферации клеток MCF7 этих компонентов. Коэффициент корреляции Пирсона использовали для расчета относительных площадей пиков, которые соответствовали эстрогенной активности образцов. Коэффициенты корреляции выше 0.3 считались значимыми (p < 0.05),="" тогда="" как="" коэффициенты="" корреляции="" выше="" 0.5="" считались="" высокозначимыми="" (p="">< 0,01).="" по="" результатам="" было="" показано,="" что="" цистанхе="" обладает="" эстрогенной="">

В общей сложности девять соединений значимо коррелировали с увеличением массы матки (p <{{0}},05), тогда="" как="" десять="" соединений="" значимо="" коррелировали="" с="" клеточной="" пролиферацией="" mcf7="" (p=""><0,05). соединения,="" которые="" значительно="" коррелируют="" с="" массой="" матки="" и="" пролиферацией="" клеток,="" включают="" 8-эпилогановую="" кислоту,="" салидрозид,="" сирингалид="" a3'-="" -="" 1-рамнопиранозид,="" цистанозид="" a,="" цистанозид="" b,="" цистанозид="" c,="" османтузид="" b,="" актеозид,="" изоактеозид,="" тубулозид="" b,="" 2'-ацетилактеозид="" и="" два="" неизвестных="" соединения="" (рис.="" 5).="" эти="" тринадцать="" соединений="" проявляли="" эстрогенную="">

3.6 Метод корреляционного анализа Грея

На рис. 6 показана относительная корреляция характеристических пиков 26 соединений с индексами матки, а на рис. 7 показана относительная корреляция характеристических пиков 26 соединений со скоростью их пролиферации клеток. В общей сложности три соединения показали самую высокую корреляцию с маточными индексами, а именно 8-эпилогановая кислота, цистанозид F и актеозид (рис. 6, в порядке убывания); тогда как шесть соединений, которые демонстрировали наибольшую корреляцию с пролиферацией клеток MCF7, были эхинакозид, цистанозид F, цистанозид B, османтузид B, изоактеозид и тубулозид B (рис. 7, в порядке убывания). Относительные корреляции эхинакозида, османтусида В, актеозида и изоактеозида были выше, чем 0.5.

3.7 Оптимизация условий ЖХ-МС

Для получения лучшей карты хроматограммы сравнивали метанол и ацетонитрил. Наконец, комбинация водной муравьиной кислоты (0,2 процента, об./об.) - ацетонитрил была лучшей подвижной фазой для разделения. В диапазоне 200-400нм полноволнового сканирования оптимальной была выбрана длина волны 254 нм. Кроме того, были улучшены параметры МС. Режим сканирования отрицательных ионов был выбран потому, что он улучшил значения отклика большинства ингредиентов Цистанхе.

4. Вывод

Технология LC-Q-TOF-MS использовалась для идентификации эстрогенных активных компонентов Цистанхе. Настоящее исследование показало, что 8-эпилогановая кислота, салидрозид, сирингалидA3'- -l-рамнопиранозид, цистанозид A, эхинакозид, цистанозид F, цистанозид B, цистанозид C, османтузид B, актеозид, изоактеозид, тубулозид B, 2'-ацетилактеозид и два неизвестных соединения были основными активными составляющими Цистанхе. Однако эти результаты требуют дальнейших исследований для изучения эффектов и механизма действия компонентов in vivo.

Благодарности:

Этот проект был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81073015), Научным фондом природы провинции Хэйлунцзян (ZD2017014) и Планом обучения молодых инновационных талантов Колледжа провинции Хэйлунцзян (UNPYSCT-2017209). . Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации данной статьи.

использованная литература

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Фитохимия, фармакология , контроль качества и будущие исследования Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: обзор, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Применение комплексной и глобальной псевдоцелевой стратегии метаболомики к скринингу маркеров контроля качества ТКМ цитрусовых, Anal. Биоанал. хим., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Ян Б., Ван Ю., Шань Л., Цзоу Дж., Ву Ю., Ян Ф., Чжан Ю., Ли Ю., Чжан Ю., Новый и практический хроматографический «Fingerprint-ROC-SVM». «Стратегия, применяемая к анализу качества инъекций традиционной китайской медицины: использование инъекций KuDieZi в качестве примера», Molecules., 2017, 22

(7). ИНН: E1237.[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Скрининг биоактивных маркеров контроля качества капельных таблеток QiShenYiQi на основе взаимосвязи между сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографией. и сосудисто-защитная активность, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Лю Н., Ли Дж., Ли Б.Г., Применение многомерного статистического анализа и мышления в контроле качества китайской медицины, Zhongguo. Чжун. Яо. За. жи., 2014, 39

(21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Da J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, данные характеристических компонентов, ориентированные на ВЭЖХ/qTOF-MS набор и хемометрический анализ для целостного контроля качества сложных препаратов ТКМ: на примере пилюли Niuhuang Shangqing, J. Pharm. Биомед. Анал., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, Высокая отрицательная прогностическая ценность, низкая распространенность и спектральный эффект: осторожность в интерпретации, Clin. Гастроэнтерол. Гепатол., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Лян Дж., Чен Ю., Рен Г., Донг В., Ши М., Сюн Л., Ли Дж., Донг Дж., Ли Ф., Юань Дж., Скрининг гепатотоксических компонентов в Euodia rutaecarpa. UHPLC-QTOF/MS на основе соотношения спектр-токсичность, Molecules., 2017, 22(8). ИНН: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Скрининг и идентификация гепатотоксического компонента в Evodia rutaecarpa на основе соотношения спектр-эффект и UPLC-Q-TOFMS, Biomed. . хроматогр., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Шопар Г., Пуйраво М., Бинетруи М., Мейер А., Вандель П., Маньен Э., Бергер Э., Гальмиш Дж., Мони Ф., Спектральный эффект и спектральная погрешность в эффективности скринингового теста для Амнестические легкие когнитивные нарушения: каковы клинические последствия?, Дж. Альцгеймерс. дис., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Спектрально-эффектовые отношения как системный подход к исследованиям традиционной китайской медицины: текущее состояние и перспективы на будущее, Молекулы., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Взаимосвязь спектрального эффекта между отпечатками пальцев UPLC и биологической активностью сырых вторичных корней Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) и трех продуктов его переработки на рост митохондрий в сочетании с каноническим корреляционным анализом, J. Ethnopharmacol., 2014, 153 (3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Взаимосвязь спектр-эффект между химическими отпечатками пальцев и Антибактериальные эффекты Lonicerae Japonicae Flos и Lonicerae Flos Base на UPLC и микрокалориметрию, Front. Фармакол., 2016, 7, 12.

[14] Ашер-Смит Дж. А., Шарп С. Дж., Гриффин С. Дж., Эффект спектра в тестах на прогнозирование, скрининг и диагностику риска, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Отслеживание новых гемостатических соединений из продуктов нагревания общих флавоноидов в Flos Sophorae по спектру взаимосвязь эффектов и колоночная хроматография, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Исследование зависимости спектр-эффект от Da-Huang-Fu- Zi-Tang у крыс методом УВЭЖХ-ESI-Q-TOF-MS, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Се Р.Ф., Чжоу С., Ши З.Н., Ли Ю.М., Ли З.К., Изучение взаимосвязи спектрального эффекта корневищ Rhei, коры Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus и их формулы, J. Chromatogr. наук, 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Антиостеопоротическая активность эхинакозида у крыс с овариэктомией, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Антигипергликемические и гиполипидемические эффекты Cistanche tubulosa у мышей DB/DB с диабетом 2 типа, J. ​​Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Морикава Т., Ниномия К., Имамура М., Акаки Дж., Фуджикура С., Пан Ю., Юань Д., Йошикава М., Цзя С., Ли З., Мураока О., Ацилированные фенилэтаноидные гликозиды , эхинакозид и актеозид из Cistanche tubulosa улучшают толерантность к глюкозе у мышей, J. Nat. мед., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Нан З.Д., Цзэн К.В., Ши С.П., Чжао М.Б., Цзян Ю., Ту П.Ф., Фенилэтаноидные гликозиды с противовоспалительной активностью из стеблей Cistanche Deserticola, выращенных в пустыне Тарим, Фитотерапия., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Лу Д., Чжан Дж., Ян З., Лю Х., Ли С., Ву Б., Ма З., Количественный анализ Cistanches Herba с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с детектированием на диодной матрице и высокоэффективной масс-спектрометрия с разрешением в сочетании с хемометрическими методами, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Хань Л., Боакье-Ядом М., Лю Э., Чжан Ю., Ли В., Сонг С., Фу Ф., Гао С., Структурная характеристика и идентификация фенилэтаноидных гликозидов из Cistanches Deserticola YC Ma по УВЭЖХ/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. анал., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Антипролиферативная активность фенилпропаноидов, выделенных из Lagotis brevituba Maxim, Phytother . рез., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Одновременное определение компонентов с широкой полярностью и диапазоном содержания в Cistanche tubulosa с использованием последовательно соединенной обращенно-фазовой гидрофильной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии, J. Chromatogr. А., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Применение метаболомики на основе 1H ЯМР для различения различных частей и разработки нового рабочего процесса обработки Cistanche Deserticola, Акта. фарм. Грех. Б., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Пан Ю.Н., Исследования компонентов и биологической активности свежей цистанхе трубчатой, доктор философии. диссертация, Шэньянский фармацевтический университет, Шэньян, Китай, 2011 г.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., Метаболический профиль актеозида, продуцируемого кишечными бактериями человека или крысы, или кишечного фермента in vitro с использованием UPLC. Q-TOF–MS, Фитотерапия., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Систематическая характеристика метаболитов эхинакозида и актеозида из Cistanche tubulosa в плазме, желчи, моче и фекалиях крыс на основе UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Хроматогр., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Метаболический способ исследования связанных препятствий, вызывающих плохую биодоступность при пероральной доставке изоактеозида у крыс с использованием сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии. квадрупольная времяпролетная тандемная масс-спектрометрия, Rapid. коммун. Масс-спектр., 2017(4), 371-380.