Как полисахарид Cistanche снижает меланогенез и уменьшает окислительный стресс?

Для получения более подробной информации, пожалуйста, свяжитесь с:Joanna.jia@wecistanche.com

Цистанхе пустынный полисахарид индуцирует меланогенез в меланоцитах и ​​снижает окислительный стресс

1Кафедра дерматологии, Третья больница Сянъя, Центральный южный университет, Чанша, Китай

2Кафедра урологии, Третья больница Сянъя, Центральный южный университет, Чанша, Китай

3Медицинский экспериментальный центр, Третья больница Сянъя, Центральный южный университет, Чанша, Китай

Цистанхепустыняимеет много эффектов, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Абстрактный: Будучи основной частью нарушений пигментации, заболевания депигментации кожи, такие как витилиго и ахромический невус, очень распространены и в настоящее время привлекают больше внимания. Патогенез депигментации включает дисфункцию и потерю меланоцитов, которые, возможно, вызваны наследственностью, аутоиммунитетом и окислительным стрессом. Среди них,окислительный стрессиграет ключевую роль; однако немногие клинические методы лечения могут справиться с окислительным стрессом. Как сообщается,Цистанхепустыня полисахарид(CDP) является эффективным антиоксидантом; на основании этого мы оценили его роль в меланоцитах и ​​дополнительно выявили механизмы. В этом исследовании мы обнаружили, что CDP может способствовать меланогенезу в эпидермальных меланоцитах человека (HEM) и клетках мышиной меланомы B16F10, а также индуцировать пигментацию у рыбок данио. Кроме того, CDP может активировать сигнальный путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), а затем повышать экспрессию фактора транскрипции, ассоциированного с микрофтальмом (MITF), и нижестоящих генов TYR, TRP1, TRP2 и RAB27A. В противном случае мы обнаружили, что CDP может ослаблять H2O2-индуцированную цитотоксичность и апоптоз в меланоцитах. Дополнительные данные показали, что CDP может усиливать антиоксидантный путь NRF2/HO-1 и очищать внутриклеточные АФК. Таким образом, CDP может способствовать меланогенезу и предотвращать повреждение меланоцитов окислительным стрессом, предполагая, что CDP помогает поддерживать нормальный статус меланоцитов. Таким образом, ЦДФ может быть новым лекарственным средством для лечения заболеваний депигментации.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА:

Цистанхе пустынная полисахарид, болезнь депигментации, меланоцит, меланогенез, NRF2,окислительный стресс

1. ВВЕДЕНИЕ

Заболевания кожи с депигментацией, такие как витилиго и ахромический невус, характеризуются пятнистой или обширной депигментацией кожи.1 Хотя поражения кожи редко вызывают серьезные физические травмы, они влияют на внешний вид пациента и создают серьезное психологическое бремя, вплоть до психических расстройств.2 основные патологические изменения при депигментации включают дисфункцию и потерю меланоцитов, что сильно влияет на синтез и транспорт меланина, что приводит к недостаточному накоплению меланина в коже.

Механизмы, участвующие в депигментации, в настоящее время неизвестны, но исследования выявили некоторые связанные факторы. С одной стороны, функция меланоцитов частично зависит от фактора транскрипции, связанного с микрофтальмом (MITF), который, как хорошо известно, способствует экспрессии генов, связанных с меланогенезом, включая тирозиназу (TYR), родственный тирозиназе белок 1 (TRP1), родственный тирозиназе белок 1 (TRP1). белок 2 (TRP2), родственный ras белок Rab-27a (RAB27A) и белок 1, связывающий актин с фасцином (FSCN1).4 Среди этих генов TYR играет ключевую роль в синтезе меланина посредством окисления l-допа в допахинон.5 С другой стороны, исследования предполагают сочетание нескольких факторов, которые могут быть ответственны за потерю меланоцитов, включая наследственность, окружающую среду, аутоиммунитет и окислительный стресс.6-9 Среди этих факторов окислительный стресс считается наиболее важным. .

Механизмыокислительный стрессчастично выявлены причины депигментации; Перегрузка активных форм кислорода (АФК) является одним из ключевых факторов.10 Перегрузка АФК при депигментации связана с дисбалансом между про- и антиоксидантной системами.11 Одним из элементов, которые участвуют в этом дисбалансе, является ядерный фактор, связанный с эритроидом 2- нарушение антиоксидантного пути фактора 2/антиоксидантного ответа (NRF2/ARE)12. Путь состоит из NRF2 и антиоксидантных ферментов, таких как гемоксигеназа-1 (HMOX-1, HO-1) , каталаза (CAT), глутатионпероксидаза 1 (GPX1) и NAD(P)H хинондегидрогеназа 1 (NQO1). экспрессия антиоксидантных ферментов. Однако при некоторых заболеваниях, связанных с депигментацией, таких как витилиго, нарушенный антиоксидантный путь NRF2/ARE не может эффективно удалять АФК. Клинические методы лечения, обычно используемые при депигментации, включают местные или системные кортикостероиды, ингибиторы кальциневрина, узкополосный ультрафиолет B (NBUVB; 311 нм). , 308-нм эксимерный свет, аутологичная эпидермальная трансплантация и терапия традиционной китайской медицины (ТКМ). Кортикостероиды и ингибиторы кальциневрина могут снижать аномальную иммунную активацию,15 в то время как фототерапия используется в качестве лечения первой линии; в частности, NBUVB стимулирует пролиферацию меланоцитов и разрушение Т-клеток,16 в то время как 308-нм эксимерный свет индуцирует апоптоз Т-клеток.17 Кроме того, эффекты терапии ТКМ связаны со стимулированием меланогенеза.18 В определенной степени эти методы помогают улучшить депигментацию, но контроль прогрессирования заболевания остается сложной задачей. Необходимо разработать новые методы лечения, особенно для окислительного стресса, которым раньше пренебрегали.

Цистанхе пустыннаяизвестен как «пустынный женьшень».19 Его компоненты полезны при поражении печени, вызванном этанолом, и воспалительной гиперплазии кишечника; его также можно использовать в качестве средства против усталости, противовоспалительного и противоопухолевого реагента.20-22 Недавно Guo et al. сообщили, чтоЦистанхе пустынная полисахарид(ЦДФ), один из его основных компонентов, обладал антиоксидантной и гепатопротекторной активностью20; еще два исследования определили его роль в защите клеток от повреждения при кислородно-глюкозной депривации/реперфузии и в условиях остеопороза.23,24 Однако роль CDP в заболеваниях, связанных с депигментацией, не выяснена. Здесь мы стремились подтвердить, может ли CDP cокислительный стрессможет влиять на меланогенез и защищать меланоциты от окислительного стресса.

2.|МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1|Химические вещества и антитела

Цистанхе пустыннаяполисахарид(CDP) и l-dopa были приобретены у Yuanye Biotec (чистота выше или равна 98 процентам; Шанхай, Китай). Перекись водорода (H2O2), диметилсульфоксид (ДМСО), NaOH, тритон X-100, 4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолия бромид ( МТТ) и набор для обнаружения апоптоза аннексина V-FITC были приобретены у Sigma-Aldrich. 4-процентный нейтральный параформальдегид был приобретен у Biosharp (Хефэй, Китай); набор для иммунофлуоресцентного окрашивания (Alexa Fluor 488) и 2,7-дихлорфлуоресцеин-диацетат (DCFH-DA) были приобретены у Beyotime Biotec (Шанхай, Китай). Набор для окрашивания Фонтана-Массона и набор для экстракции нуклеоплазматического белка были приобретены у Sloarbio (Пекин, Китай). Добавка для роста меланоцитов человека (HMGS), модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM) и среда 254 были приобретены у Gibco. Фетальную бычью сыворотку (FBS) приобретали у BI (кибуц Бейт-Хаемек, Израиль). Первичные антитела к -актину, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2 и HO-1 были приобретены в Cell Signaling Technology, первичное антитело к MITF было приобретено в St John's Laboratory, первичное антитело к p-MITF было приобретено в Affinity Biosciences, первичное антитело для GAPDH было приобретено у Bioworld, а первичное антитело для TRP1 было приобретено у EMD Millipore.

2.2| Культура клеток и лечение

Клетки мышиной меланомы B16F10 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 1% смеси антибиотиков пенициллин-стрептомицин. Эпидермальные меланоциты человека (HEM) отделяли от крайней плоти человека (см. наше предыдущее исследование25) и культивировали в среде 254 с добавлением HMGS, 5% FBS и 1% смеси антибиотиков пенициллин-стрептомицин. Все клетки культивировали во влажном инкубаторе при 37°С с 5% СО2. ЦДФ растворяли в ДМСО и разбавляли

со средой перед использованием конечная концентрация ДМСО была ниже 0,1 процента. H2O2 разбавляли средой перед использованием.

2.3|Выращивание и лечение рыбок данио

Эмбрионы рыбок данио и среда были приобретены у EzeRinka Biotech. Экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по этике Центрального Южного университета. Рыбок данио культивировали в 12-луночных планшетах при температуре 37 градусов от света и обрабатывали различными концентрациями CDP. Инвертированный микроскоп использовался для ежедневного наблюдения и регистрации меланинов в головах и хвостах рыбок данио. После наблюдения мы изменили среду и повторно добавили CDP. Плотность меланина в хвостах рыбок данио была измерена с помощью изображения J, и значения представлены в виде интегральной оптической плотности (IOD).

2,4|Жизнеспособность клеток

Жизнеспособность клеток измеряли с использованием анализа МТТ. Для исследования цитотоксичности CDP клетки HEM и B16F10 имплантировали в 96-луночные планшеты с плотностью 2 × 1{{30}}}3 клеток/лунку и культивировали до клетки прикрепляли к пластинам. Затем клетки обрабатывали различными концентрациями (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 и 320 мкг/мл) CDP в течение 24, 48 или 72 часов. Перед измерением в каждую лунку добавляли по 20 мкл МТТ и планшеты инкубировали при 37°С в течение 4 часов. После этого отбрасывали супернатант и добавляли в каждую лунку по 160 мкл ДМСО для растворения кристаллов формазана. Величину поглощения при 490 нм измеряли с помощью многорежимного планшет-ридера (PerkinElmer). Для исследования действия ЦДФ в условиях индуцированной H2O 2- цитотоксичности HEM и клетки B16F10 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 4 × 103 клеток/лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями CDP (0, 20, 40 или 80 мкг/мл) в течение 24 часов, после чего в каждую лунку добавляли H2O2 (конечная концентрация: 500 мкМ для HEM и 1,0 мМ для клеток B16F10). и инкубировали клетки еще 24 часа. Мы создали группы, получавшие CDP, и группы отрицательного контроля (NC). Этапы обнаружения были такими же, как описано ранее.

2,5|NaOH анализ содержания меланина

Клетки культивировали в чашках Петри {{0}} мм и обрабатывали CDP в различных концентрациях (0, 20, 40 и 80 мкг/мл) в течение 48 часов, затем расщепляли трипсином и собирали в 1. 5-пробирки мл. Мы дважды промывали клетки бидистиллированной водой, ресуспендировали их в 1 мл этанола и встряхивали для высвобождения меланина. Затем центрифугировали (200 g, 5 минут) смесь и удаляли супернатант, добавляли в каждую пробирку по 1 мл 10%-ного ДМСО (разбавленного 1 мМ раствором NaOH) и суспендировали осадок. Суспензию инкубировали на водяной бане при температуре 80 градусов в течение 1 часа для растворения меланина. Наконец, мы перенесли 200 мкл жидкости в 96-луночный планшет и использовали многорежимный планшет-ридер для измерения значения поглощения при 470 нм.

2,6|Измерение активности тирозиназы

Клетки культивировали в чашках Петри {{0}}мм и обрабатывали CDP перед измерением, расщепляли трипсином и собирали в пробирки на 1,5-мл и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). ). Мы переместили 106 клеток из каждого образца в новую пробирку и удалили супернатант после центрифугирования, затем добавили 1 мл 0,5% Triton X-100 к осадку клеток и сохранили смеси при 0 градусах в течение 15 минут. После этого в качестве субстрата добавляли 1 мл леводопы (1 мМ, разбавленной 0.1 М фосфатным буфером) и перемешивали раствор, переносили 200 мкл смеси в 96-луночный планшет. немедленно и измерили значение поглощения (А0) при 475 нм с помощью многорежимного планшетного ридера, повторив измерение через 10 минут (А10). Активность тирозиназы рассчитывали по формуле (A10-A0)/105, а результаты выражали в процентах (%) по сравнению с отрицательным контролем.

2,7|Окрашивание меланина по Фонтана-Массону

Клетки культивировали в 12-луночных планшетах до достижения 50-процентной плотности. После обработки клетки фиксировали 4-процентным нейтральным параформальдегидом в течение 30 минут и промывали дистиллированной водой. Затем в каждую лунку добавляли по 500 мкл раствора аммиака и серебра Fontana и хранили планшеты в темноте в течение 16 часов для окрашивания меланина. Далее клетки промывали дистиллированной водой пять раз (каждый раз по 1 минуте) и замачивали в 500 мкл гипосульфита на 5 минут; наконец, мы удаляли гипосульфит и снова промывали клетки дистиллированной водой в течение 1 минуты. Затем мы использовали инвертированный микроскоп для наблюдения и записи меланинов.

2,8|Экстракция РНК и количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

Клетки культивировали в 6-луночных планшетах. После обработки клетки расщепляли трипсином и собирали в пробирки объемом 1,5- мл. Мы дважды промывали клетки PBS, затем добавляли 1 мл буфера для лизиса, встряхивали смесь и помещали пробирки на лед на 5 минут для полного лизиса клеток. РНК экстрагировали с использованием набора Total RNA Kit (Omega Bio-Tek) и подвергали обратной транскрипции (RT) с использованием ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ПЦР) проводили с использованием KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). Реакционный объем смеси RT составлял 20 мкл, а реакционный объем смеси для ПЦР составлял 20 мкл (кДНК 1-8 мкл, MIX 10 мкл, праймер F 1 мкл, праймер R 1 мкл, добавить DEPC H2O к 20 мкл ). Эксперименты проводились согласно протоколам. Последовательности праймеров перечислены в таблице S1.

2.9|Экстракция белков и вестерн-блоттинг/иммунофлуоресценция

Клетки культивировали в чашках Петри 100- мм. После обработки клетки расщепляли трипсином и собирали в пробирки объемом 1,5- мл. Мы дважды промывали клетки PBS, затем добавляли 500 мкл лизирующего буфера RIPA (Thermo Fisher) с добавлением 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (Thermo Fisher) и смеси ингибиторов фосфатазы, разбавленной 1:100 (Roche). Ядерный и цитоплазматический белок экстрагировали с использованием набора для выделения нуклеоплазматического белка в соответствии с протоколом производителя. Мы помещали пробирки на лед на 30 минут и встряхивали их каждые 5 минут для полного лизиса клеток. Мы центрифугировали клетки (200 g, 4 градуса, 15 минут), переносили супернатант в новую пробирку и измеряли концентрацию общего белка с помощью набора для анализа белка BCA (KeyGEN Biotec). Мы кипятили белки с 5-кратным загрузочным буфером (Beyotime Biotec, Китай) при 100 градусах в течение 10 минут, затем хранили их при -80 градусах. В Вестерн-блоттинге использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE), и 20 мкг белка каждой группы отделяли и переносили на поливинилиденфторидную мембрану. После блокирования антигена мы инкубировали мембрану в разбавленном 1:1000 первичном антителе в течение 16 часов при 4 градусах, затем промывали мембрану PBST и инкубировали во вторичном антителе, разбавленном 1:10 000, в течение 1 часа при 37 градусах. . Интенсивность флуоресценции определяли с помощью системы визуализации Odyssey CLx (LI-COR). Иммунофлуоресценцию проводили с использованием набора для окрашивания иммунофлуоресценции (Alexa Fluor

488) с первичным антителом в разведении 1:100.

2.10|Измерение клеточного апоптоза

Клетки культивировали в чашках Петри {{0}} мм и обрабатывали различными концентрациями (0, 20, 40 и 80 мкг/мл) ЦДФ в течение 24 часов и добавляли H2O2 ( конечные концентрации: 500 мкМ для HEM, 1,0 мМ для клеток B16F10) в каждую лунку и инкубируют еще 24 часа. Мы также создали группы, получавшие CDP, и группы NC. После обработки мы переваривали клетки трипсином без ЭДТА и собирали их в пробирки, затем дважды промывали клетки PBS и ресуспендировали в 100 мкл PBS. Клетки окрашивали с помощью набора для обнаружения апоптоза Annexin V-FITC в соответствии с протоколом и выявляли с помощью проточной цитометрии (FCM). Программное обеспечение FlowJo использовалось для анализа скорости апоптоза.

2.11| Внутриклеточное измерение АФК

Клетки культивировали в {{0}}луночных планшетах и ​​обрабатывали различными концентрациями (0, 20, 40 и 80 мкг/мл) CDP в течение 24 часов, к которым мы добавляли H2O2 (конечные концентрации: 500 мкг/мл). мкм для ВЭУ,

1,0 мм для клеток B16F10) в каждую лунку, инкубировали их для другой

24 часа и настроить группы, получавшие CDP, и группы NC. После обработки мы дважды промывали клетки PBS, чтобы удалить всю среду и FBS, затем разбавляли зонд DCFH-DA средой до 1:1000 и добавляли его в каждую лунку. Клетки инкубировали при 37°С в течение 30 мин и трижды промывали их бессывороточной средой. Мы использовали

инвертированный флуоресцентный микроскоп для наблюдения и записи флуоресценции, затем использовал ImageJ для измерения интенсивности флуоресценции.

2.12|Статистика и анализ

Данные в этой работе представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD), а статистический анализ был выполнен с использованием GraphPad Prism (версия 7.0) или SPSS (версия 22.0) и Стьюдента. Стьюдентный критерий или однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) использовали для сравнения нескольких групп. Значение серого для полос белка WB стандартизировали с помощью GAPDH или -актина. Значения P < 0,05="" считались="" значимыми.="" все="" опыты="" повторяли="" не="" менее="" трех="">

3|ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1|CDP-индуцированный меланогенез в клетках HEM и B16F10

Прежде чем мы начали, мы использовали анализ МТТ для исследования потенциальной цитотоксичности CDP в отношении HEM и клеток мышиной меланомы B16F10. Клетки обрабатывали ЦДФ в различных концентрациях в течение 24, 48 или 72 часов. Тестирование жизнеспособности HEM показало, что при концентрациях ниже 320 мкг/мл CDP не влиял на жизнеспособность клеток; однако жизнеспособность значительно снижалась, когда концентрация достигала 320 мкг/мл через 24, 48 и 72 часа (P <0,05; рис.="" 1а).="" жизнеспособность="" клеток="" b16f10="" также="" снижалась="" через="" 48="" и="" 72="" часа,="" когда="" cdp="" достигал="" 320="" мкг/мл="" (p=""><0,01), но="" никаких="" изменений="" не="" наблюдалось="" при="" более="" низких="" концентрациях="" (рис.="" 1b).="" затем="" мы="" предварительно="" изучили="" роль="" цдф="" в="" меланогенезе="" и="" сравнили="" его="" эффекты="" с="" эффектами="" -меланоцитостимулирующего="" гормона="" (-мсг;="" концентрации:="" 20,="" 100="" и="" 400="" нм)="" и="" дмсо="" (0,1%)="" в="" гэм.="" результаты="" окрашивания="" меланина,="" активности="" тирозиназы="" и="" анализа="" содержания="" меланина="" показали,="" что="" цдф="" был="" сопоставим="" с="" -мсг="" для="" стимуляции="" меланогенеза,="" в="" то="" время="" как="" обработка="" 0,1%="" дмсо="" не="" имела="" никакого="" значения="" (рис.="">

Соответственно, мы усовершенствовали наше исследование. ГЭМ обрабатывали ЦДФ в различных концентрациях (20, 40 и 80 мкг/мл) в течение 48 часов; были проведены анализы окрашивания меланина, содержания меланина и активности тирозиназы, и все они показали значительное увеличение после лечения CDP в зависимости от концентрации, которое достигло пика в группе 80 мкг/мл (P < 0,05,="" рис.="" 2a-c).="" .="" затем="" мы="" измерили="" уровни="" мрнк="" и="" белков="" генов,="" связанных="" с="" меланогенезом="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" и="" fscn1).="" cdp="" значительно="" увеличивал="" уровни="" мрнк="" этих="" генов="" в="" hem="" (p=""><0,05; рисунок="" s2a).="" кроме="" того,="" увеличились="" уровни="" белков="" mitf,="" tyr,="" trp1="" и="" rab27a,="" а="" также="" отношение="" фосфорилированного="" mitf="" к="" общему="" mitf="" (p=""><0,05), тогда="" как="" trp2="" и="" fscn1="" не="" показали="" различий="" (рис.="" 2d,="" e).="" результаты="" показали,="" что="" cdp="" может="" способствовать="" меланогенезу="" и="" усиливать="" экспрессию="" генов,="" связанных="" с="" меланогенезом,="" в="" меланоцитах="">

Кроме того, мы еще раз проверили влияние CDP на клетки B16F10 и обнаружили, что содержание меланина в клетках B16F10 значительно увеличилось (P <0,01; рисунок="" s2b).="" кроме="" того,="" cdp="">

3.2|CDP способствовал меланогенезу у рыбок данио

Чтобы выяснить, может ли CDP продвигатьмеланогенезin vivo использовали эмбрионы рыбок данио. Эмбрионы рыбок данио делили на четыре группы и непрерывно обрабатывали только средой (NC) или CDP в различных концентрациях (20, 40 и 80 мкг/мл); плотность и распределение гранул меланина наблюдали и регистрировали каждый день. По мере роста эмбрионов рыбок данио мы обнаружили, что плотность меланина постепенно увеличивалась в головах и хвостах. На 3-й день межгрупповые различия были различимы, и разница продолжала увеличиваться, пока мы не закончили эксперимент на 6-й день (рис. 3А). Мы использовали изображение J для измерения плотности меланина в хвостах рыбок данио; плотность меланина в группах, получавших CDP, была значительно выше, чем в контрольной группе (P <0,05; рис.="">

3.3|CDP активировал сигнальный путь MAPK в клетках HEM и B16F10

Выявить механизмы, с помощью которых CDP продвигалмеланогенез, мы обработали ГЭМ ЦДФ в разных концентрациях (20, 40 и

80 мкг/мл) в течение 48 часов, а затем исследовали фосфорилированные и общие уровни белков ERK, JNK и p38 в сигнальном пути MAPK. По данным Вестерн-блоттинга уровни p-ERK, p-JNK и p-p38 повышались после обработки CDP (P <0,05), в="" то="" время="" как="" их="" общие="" уровни="" не="" менялись="" (рис.="" 4a,="" b).="" эксперименты="" были="" повторены="" с="" клетками="" b16f10,="" и="" уровни="" фосфорилирования="" белков="" erk,="" jnk="" и="" p38="" были="" повышены="" (p=""><0,05), но="" общие="" уровни="" mapk="" не="" изменились="" (рис.="" 4c,="" d),="" что="" согласуется="" с="" результатами="" в="" hem.="">

3.4|CDP ослабленный H2O2-индуцированный

цитотоксичность и апоптоз в клетках HEM и B16F10

Мы использовали H2O2 для имитацииокислительный стресссреде и дополнительно исследовали роль CDP в меланоцитах подокислительный стресс. Конечная концентрация H2O2, используемая в HEM, составляла 500 мкМ, а в клетках B16F10 - 1,0 мМ. Чтобы исследовать влияние CDP на цитотоксичность, индуцированную H2O2-, мы предварительно обработали HEM и клетки B16F10 CDP в различных концентрациях (20, 40 и 80 мкг/мл) в течение 24 часов, затем добавили H2O2 и продолжили обработку. за 24 часа до проведения наблюдения и МТТ-анализа.

H2O2 вызывала явное вздутие мембраны и сморщивание клеток в HEM, в группах, предварительно обработанных CDP, ситуация была облегчена. Лечение только CDP не имело эффекта (фиг. 5А). Анализ MTT показал аналогичный результат в том, что обработка H2O2 снижала жизнеспособность HEM, тогда как CDP значительно уменьшала это вредное воздействие.

3,5|Очищенный от CDP H2O2-индуцированный внутриклеточный ROS в клетках HEM и B16F10

Чтобы исследовать механизмы CDP для снижения H2O2-индуцированной цитотоксичности и апоптоза, мы дополнительно обнаружили внутриклеточные АФК в HEMs и клетках B16F10, используя флуоресценцию DCFH-DA.

4|ОБСУЖДЕНИЕ И ВЫВОДЫ

В этом исследовании мы исследовали роль CDP в клетках HEM и B16F10. Впервые мы обнаружили, что CDP может способствоватьмеланогенезв меланоцитах и ​​способствуют пигментации у рыбок данио. Последующий эксперимент показал, что сигнальный путь MAPK активируется при лечении CDP. Далее мы исследовали его роль вокислительный стресси обнаружили, что CDP может ослаблять индуцированную H2O2- цитотоксичность и апоптоз в меланоцитах; между тем, CDP может активировать антиоксидантный путь NRF2/HO-1 и очищать внутриклеточные АФК приокислительный стрессусловия.

Активируемая митогеном протеинкиназа является важным механизмом, участвующим в регуляции MITF, ключевого фактора транскрипции, который способствует экспрессиимеланогенезродственные гены и впоследствии влияет на синтез и транспорт меланина.26,27 В нашем исследовании активация ERK, JNK и p38 в меланоцитах была значительно увеличена после обработки CDP; между тем, экспрессия MITF/p-MITF и MITF-управляемых TYR, TRP1, TRP2 и RAB27A

соответственно были усилены. Таким образом, мы предполагаем, что CDP может

продвигатьмеланогенезпутем активации пути MAPK, но как CDP активирует MAPK, остается неизвестным. Согласно недавним исследованиям, толл-подобный рецептор 4 (TLR4) в высокой степени экспрессируется в меланоцитах и ​​участвует в меланогенезе.28,29 TLR4 является важным трансмембранным белком, который может специфически связывать липополисахарид (ЛПС)30; исследования показали, что ЛПС может индуцировать меланогенез.29 Интересно, что несколькополисахаридыСообщается, что извлеченные из растений или грибов активируют TLR и нижестоящие сигнальные пути, такие как MAPK и ядерный фактор каппа-бета (NF-kB).31,32 Таким образом, мы подозреваем, что CDP может распознаваться и связываться TLR, а затем активирует нижестоящие сигнальные пути MAPK. путь и способствуетмеланогенез. Кроме того, известно, что нуклеотид-связывающие рецепторы, подобные домену олигомеризации (NLR), распознают внутриклеточные лиганды и управляют активацией сигнальных путей MAPK и NF-kB. Как сообщалось, полисахариды, экстрагированные из Ganoderma lucidum и Astragalus, могут проникать в клетки. и воздействовать на NLRs.35,36 Таким образом, вполне возможно, что CDP может проникать в меланоциты и регулировать сигнальный путь MAPK через NLRs. Однако для проверки этой гипотезы необходимы дальнейшие исследования.

В некоторых исследованиях на сегодняшний день сообщалось о применении травяныхполисахаридыв меланогенезе, чтобы ингибировать выработку меланина.37,38 Однако в этом исследовании CDP способствовал меланогенезу в

меланоциты, и этот эффект был дополнительно подтвержден после сравнения с -МСГ. CDP также является своего родаполисахаридизвлеченных из трав, мы подозреваем, что противоположный эффект ЦДФ может быть связан со структурными различиями между ЦДФ и другимиполисахариды. Полисахариды образуются в результате полимеризации моносахаридов, но различаются по типу моносахаридов, составу моносахаридов, гликозидной связи, структуре боковой цепи и молекулярной массе39,40; эти факторы, как полагают, определяют их биологические функции. 41 Существующие исследования предложили структуру CDP и предположили, что структура CDP впоследствии влияет на его функцию. 42 Таким образом, необходимы дополнительные доказательства, чтобы полностью понять CDP и подтвердить нашу гипотезу.

Меланогенез является важным защитным механизмом сопротивления

ультрафиолетовое повреждение и поддержание гомеостаза организма43; в то же

со временем меланоциты легко подвергаются воздействию неблагоприятных условий, таких как перегрузка АФК.11 Известно, что АФК участвуют в продвижениимеланогенез, одним из механизмов является активация МАРК.44 Но исследования также показали, что этот эффект существует только в пределах определенного уровня АФК, в то время как перегрузка АФК значительно ухудшает меланогенез.45 Взаимосвязь между АФК, МАРК и меланогенезом варьирует в разных условиях, таким образом, баланс между про- и антиоксидантными системами, очевидно, важен. При заболеваниях с депигментацией, таких как витилиго, несбалансированная антиоксидантная система и неконтролируемая перегрузка АФК повреждают меланоциты и снижают жизнеспособность клеток. H2O2, чем клетки B16F10. Когда меланоциты подвергались обработке H2O2, их жизнеспособность и скорость апоптоза ухудшались, но

Предварительная обработка CDP может частично изменить эту тенденцию. В то же время ROS был очищен. Как сообщалось, активация антиокислительного пути NRF2/ARE является основным методом удаления АФК в клетках кожи.14 В наших экспериментах уровни белка NRF2 и HO-1 в меланоцитах повышались после обработки H2O2 без ЦДФ; это означает, что H2O2-индуцированныйокислительный стрессможет активировать путь NRF2/HO-1, но этого недостаточно для поддержания окислительно-восстановительного баланса и защиты клетки от повреждения. Тем не менее, предварительная обработка CDP усиливала антиоксидантный путь NRF2/HO-1 и восстанавливала баланс. Таким образом, мы предполагаем, что CDP может защищать меланоциты от повреждения окислительным стрессом посредством активации пути антиоксидантного действия NRF2/HO-1 и удаления АФК.

Мы обнаружили, что лечение CDP само по себе не влияет на ROS или NRF2/HO-1 в меланоцитах. Этот результат предполагает, что CDP может влиять на окислительно-восстановительный баланс при окислительном стрессе, но не в нормальных условиях. Кроме того, сообщается, что антиокислительный путь NRF2/HO-1 регулируется сигнальными путями PI3K, NF-κB и MAPK.47,48 В нашем исследовании CDP был способен активировать сигнальный путь MAPK. Вполне возможно, что CDP может активировать путь NRF2/HO-1 посредством повышающей регуляции MAPK. Как сообщил Сломински, меланоциты являются сенсорами стресса, участвующими в регуляторной сети, и их функции могут быстро меняться в ответ на воздействие окружающей среды. системе в нормальных условиях, но восстановить окислительно-восстановительный баланс приокислительный стрессусловия. Следовательно, функция и выживание меланоцитов могут поддерживаться двумя различными способами с помощью CDP. CDP помогает меланоцитам поддерживать гомеостаз, что также является важной функцией меланогенеза.50,51

В заключение, CDP может способствоватьмеланогенезмеланоцитов

через активацию сигнального пути МАРК. CDP может улучшить выживаемость меланоцитов за счет активации антиоксидантного пути NRF2/HO-1 и удаления внутриклеточных АФК в условиях окислительного стресса. Наши результаты значимы, поскольку они демонстрируют, что CDP может способствоватьмеланогенези защитить меланоциты отокислительный стресстравма, которая, возможно, ответственна за дисфункцию и потерю меланоцитов. Результаты этого исследования показывают, что ЦДФ может быть новым препаратом для лечения заболеваний, связанных с депигментацией.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81703101), проектами New Xiangya Talent Projects третьей больницы Xiangya Центрального южного университета (№ JY201623 и № 20170301), Фондом естественных наук провинции Хунань ( № 2018JJ3788 и № 2018JJ3793) и Проект комиссии здравоохранения провинции Хунань (№ C2019173). Доктор Ибо Ху выполнил основную часть исследования и написал рукопись; Профессор Цзин Чен и Цинхай Цзэн разработали исследование и руководили написанием рукописи; Профессора Цзиньхуа Хуан, Лихуа Хуан и Хун Сян оказали техническую поддержку и проанализировали данные; Доктор Исяо Ли, Лин Цзян, Юцзе Оуян, Юмэн Ли, Лун Ян и Сяоцзяо Чжао участвовали в части экспериментов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы подтверждают отсутствие конфликта интересов.

ЗАЯВЛЕНИЕ О НАЛИЧИИ ДАННЫХ

Данные, подтверждающие результаты этого исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Блюэль Р., Эберлейн Б. Терапевтическое лечение витилиго. J Dtsch Dermatol Ges. 2018;16:1309-1313.

2. Тайеб А., Меуран Дж.М. Должны ли мы отдавать приоритет психологическим вмешательствам в лечении витилиго? J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018;32:2053-2054.

3. Пикардо М., Делл'Анна М.Л., Эззедин К. и соавт. Витилиго. Праймеры Nat Rev Dis. 2015;1:15011.

4. Сломински А., Тобин Д., Шибахара С., Вортсман Дж. Пигментация меланина в коже млекопитающих и ее гормональная регуляция. Physiol Rev. 2004; 84: 1155-1228.

5. Сломински А., Змиевски М.А., Павелек Дж. L-тирозин и L-дигидроксифенилаланин как гормоноподобные регуляторы функций меланоцитов. Пигментно-клеточная меланома Res. 2012;25:14-27.

6. Спритц Р.А. Общие генетические отношения, лежащие в основе генерализованного витилиго и аутоиммунного заболевания щитовидной железы. Щитовидная железа. 2010;20:745-754.

7. Линь С., Тан Л.И., Фу В.В., Кан К.Ф. Детское витилиго в Китае: клинические профили и иммунологические данные в 620 случаях. Am J Clin Дерматол. 2011;12:277-281.

8. Бенке В.Х., Брембилла, Северная Каролина. Аутореактивные Т-лимфоциты при воспалительных заболеваниях кожи. Фронт Иммунол. 2019;10:1198.

9. Яннелла Г., Греко А., Дидона Д. и др. Витилиго: патогенез, клинические варианты и подходы к лечению. Аутоиммунная версия, 2016; 15:335-343.

10. Форрестер С.Дж., Кикучи Д.С., Эрнандес М.С. и соавт. Активные формы кислорода в метаболической и воспалительной передаче сигналов. Цирк рез. 2018;122:877-902.

11. Денат Л., Кадекаро А.Л., Маррот Л. и соавт. Меланоциты как зачинщики и жертвы окислительного стресса. Джей Инвест Дерматол. 2014;134:1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Окислительный стресс и витилиго: Nrf2-ARE

подключение сигнализации. Джей Инвест Дерматол. 2014;134:2074-2076.

13. Хейс Д.Д., Динкова-Костова А.Т. Регуляторная сеть Nrf2 обеспечивает интерфейс между окислительно-восстановительным и промежуточным метаболизмом. Тенденции биохимических наук. 2014;39:199-218.

14. Маррот Л., Джонс С., Перес П., Менье Дж. Р. Значение Nrf2

пути (фото)-окислительного стрессового ответа в меланоцитах и ​​кератиноцитах эпидермиса человека. Пигментно-клеточная меланома Res. 2008;21:79-88.

15. van Geel N, Speeckaert R, Mollet I, et al. Модель индукции и терапии витилиго in vivo: двойное слепое рандомизированное клиническое исследование. Пигментно-клеточная меланома Res. 2012;25:57-65.

16. Николаиду ​​Э., Антониу С., Стратигос А., Кацамбас А.Д. Узкополосная фототерапия ультрафиолетом В и 308-нм эксимерный лазер в лечении витилиго: обзор. J Am Acad Дерматол. 2009;60:470-477.

17. Новак З., Бонис Б., Балтас Э. и др. Ультрафиолетовый лазер B на хлориде ксенона

более эффективен при лечении псориаза и индукции апоптоза Т-клеток, чем узкополосный ультрафиолет B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002;67:32-38.

18. Сюй П., Су С., Тан С. и др. Влияние водных экстрактов Eclipse herba, препарата кореньев Polygoni multiflora и препарата кореньев Rehmanniae на меланогенез и миграцию меланоцитов человека. J Этнофармакол. 2017;195:89-95.

19. Ван Т, Чжан С, Се В.Цистанхе пустыннаяYC Ma, "Пустынный женьшень": обзор. Am J Chin Med. 2012;40:1123-1141.

20. Guo Y, Cao L, Zhao Q, et al. Предварительная характеристика антиоксидантной и гепатопротекторной активностиполисахаридизЦистанхе пустынная. Int J Биол Макромоль. 2016;93:678-685.

21. Цай Р.Л., Ян М.Х., Ши Ю. и др. Противоусталостная активность богатого фенилэтаноидами экстракта изЦистанхе пустынная. Фитотер Рез. 2010;24:313-315.

22. Чжан Х., Сян З., Дуань Х. и др. Противоопухолевое и противовоспалительное действие олигосахаридов изЦистанхе пустыннаяэкстракт при травме спинного мозга. Int J Биол Макромоль. 2019;124:360-367.

23. Лю Ю, Ван Х, Ян М и др.Цистанхе пустынная полисахаридызащищают клетки PC12 от повреждений, вызванных OGD/RP. Биомед Фармаколог. 2018;99:671-680.

24. Песня Д., Цао З., Лю З. и др.Цистанхе пустынная полисахаридослабляет остеокластогенез и резорбцию кости за счет ингибирования передачи сигналов RANKL и производства активных форм кислорода. J Cell Physiol. 2018;233:9674-9684.

25. Фу С., Чен Дж., Лу Дж. и др. Подавление TUG1 способствует меланогенезу и меланогенезу, индуцированному UVB. Опыт Дерматол. 2019;28:730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F, et al. Программа клонирования меланоцитов придает устойчивость к ингибированию пути киназы MAP. Природа. 2013;504:138-142.

27. Вахтенхейм Дж., Боровански Дж. «Транскрипционная физиология» образования пигмента в меланоцитах: центральная роль MITF. Опыт Дерматол. 2010;19:617-627.

28. Ю Н, Чжан С, Цзо Ф и др. Культивируемые меланоциты человека экспрессируют функциональные toll-подобные рецепторы 2–4, 7 и 9. J Dermatol Sci. 2009;56:113-120.

29. Ан Дж. Х., Пак Т. Дж., Джин С. Х., Кан ХИ. Меланоциты человека экспрессируют функциональный Toll-подобный рецептор 4. Exp Dermatol. 2008;17:412-417.

30. Рид С.Г., Картер Д., Каспер С. и др. Корреляты активности адъювантов семейства GLA. Семин Иммунол. 2018;39:22-29.

31. Guo MZ, Meng M, Feng CC, et al. Романполисахаридполученный из Craterellus cornucopioides, усиливает иммуномодулирующую активность в моделях иммуносупрессивных мышей посредством регуляции пути TLR4-NF-kappaB. Функц. питания 2019;10(8):4792-4801.

32. Вэй В., Сяо Х.Т., Бао В.Р. и др. TLR-4 может опосредовать сигнальные пути астрагалаполисахаридRAP индуцировал экспрессию цитокинов в клетках RAW264.7. J Этнофармакол. 2016;179:243-252.

33. Чен Х., Ян Д., Хань Ф. и др. Бактериальный эффектор T6SS EvpP предотвращает активацию воспаления NLRP3 путем ингибирования Ca(2 plus)-зависимого пути MAPK-Jnk. Клеточный микроб-хозяин. 2017;21:47-58.

34. Леви М., Шапиро Х., Тайсс К.А., Элинав Э. NLRP6: многогранный иммунный датчик в нате. Тренды Иммунол. 2017;38:248-260.

35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. Противовоспалительное и гепатопротекторное действие Ganoderma lucidum.полисахаридыпротив повреждения печени, вызванного четыреххлористым углеродом, у мышей Куньмин. Фармакология. 2019;103:143-150.

36. Тянь З., Лю Ю., Ян Б. и др. Астрагалполисахаридослабляет колит у мышей за счет ингибирования инфламмасомы NLRP3. Планта Мед. 2017;83:70-77.

37. Цзян Л., Хуан Дж., Лу Дж. и др. Ганодерма лакированнаяполисахаридуменьшает меланогенез, ингибируя паракринные эффекты кератиноцитов и фибробластов через путь IL-6/STAT3/FGF2. J Cell Physiol. 2019;234:22799-22808.

38. Цай З.Н., Ли В., Мехмуд С. и соавт. ЭффектполисахаридFMP-1 из Morchella esculenta на меланогенез в клетках B16F10 и рыбках данио. Функц. питания 2018;9:5007-5015.

39. Чжан С., Ли З., Чжан С.И. и соавт. Молекулярные характеристики и биоактивностьполисахаридыиз люцерны (Medicago sativa L.). Питательные вещества. 2019;11:1181.

40. Кокони Линарес Н., Ди Фалько М., Бенуа-Гельбер И. и др. Присутствие микроэлементов значительно расширяет молекулярную реакцию Aspergillus niger на гуаровую смолу. Новая биотехнология. 2019;51:57-66.

41. Ма Х., Чжан К., Цзян К. и др. Характеристика растенияполисахаридыиз Dendrobium officinale с помощью нескольких хроматографических и масс-спектрометрических методов. J Хроматогр А. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. Структурная характеристика и иммунологическая активность двух экстрактов, экстрагируемых холодной водой.полисахаридыизЦистанхе пустыннаяЮК Ма. Карбогид Рез. 2007;342:1343-1349.

43. Сломинский А.Т., Змиевский М.А., Плонка П.М. и соавт. Как ультрафиолетовый свет воздействует на мозг и эндокринную систему через кожу и почему. Эндокринология. 2018;159:1992-2007.

44. Schalke S. Новые данные о нарушениях гиперпигментации. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31(Приложение 5):18-21.

45. Глассман С.Дж. Витилиго, активные формы кислорода и Т-клетки. Клин науч. 2011;120:99-120.

46. ​​Ристоу М. Раскрывая правду об антиоксидантах: митогормезис объясняет преимущества для здоровья, вызванные АФК. Нат Мед. 2014;20:709-711.

47. Балогун Э., Хок М., Гонг П. и др. Куркумин активирует ген оксигеназы гема-1 посредством регуляции Nrf2 и антиоксидант-реактивного элемента. Биохим Дж. 2003; 371: 887-895.

48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. Сигнализация

гемоксигеназа-1 и ее противовоспалительный терапевтический потенциал.

Биохим Фармакол. 2010;80:1895-1903.

49. Сломински А., Паус Р., Шадендорф Д. Меланоциты как «сенсорные» и регуляторные клетки эпидермиса. Дж Теор Биол. 1993;164:103-120.

50. Сломинский Р.М., Змиевский М.А., Сломинский АТ. Роль пигмента меланина в меланоме. Опыт Дерматол. 2015;24:258-259.

51. Сломинский А., Ким Т.К., Брозина А.А. и соавт. Роль меланогенеза в регуляции поведения меланомы: меланогенез приводит к стимуляции экспрессии HIF-1альфа и HIF-зависимых сопутствующих путей. Арх Биохим Биофиз. 2014;563:79-93.