Клонирование генов, функциональная идентификация, структурный и экспрессионный анализ сахарозосинтазы Cistanche Tubulosa Ⅲ

4. Анализ экспрессии CtSus в различных частях Cistanche Tubeulosa и системе клеточных культур в условиях стресса, вызванного засухой.

4.1 Анализ экспрессии CtSus в различных частях Cistanche Tubeulosa

Эксперименты по трансформации целых клеток in vitro и эксперименты по ферментативно-каталитическим реакциям подтвердили, что белок, кодируемый геном CtSus, может катализировать синтез УДФ-глюкозы. Для дальнейшего изучения корреляции между этим геном и биосинтезом гликозидных соединений у цистана трубчатого был проанализирован уровень экспрессии этого гена в различных частях цистанха трубчатого.

ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННАЯ ГЕРБА ЦИСТАНКА С 10-98% ЭХИНАКОЗИДА

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>надземная часть; среди них содержание эхинакозида в гаусториях самое высокое.

Количественную флуоресцентную ПЦР в реальном времени проводили с использованием кДНК из разных частей Cistanche Tubeulosa в качестве матриц, результаты анализировали методом 2–ΔΔCT и проводили дифференциальный анализ. Результаты показаны на рисунке 4А. Уровень экспрессии гена CtSus в гаусториях был самым высоким - в 1,5 раза выше, чем в надземной части, а уровень экспрессии в подземной части - значительно выше, чем в надземной части, что согласуется с закономерностью накопления фенилэтаноидных гликозидов. представлен эхинакозидом в разных частях Cistanche Tubeulosa.

Рисунок 4. Относительные уровни экспрессии CtSus в различных частях C. Tubeulosa и суспензионных клетках, обработанных PEG6000. А: Относительный уровень экспрессии CtSus в разных частях C. Tubeulosa; B: Относительный уровень экспрессии CtSus в суспензионных клетках C. Tubeulosa, обработанных PEG6000, в разные моменты времени. n=3, 𝑥̅± с.*P ＜ 0,05, *** P ＜ 0,001

4.2 Анализ экспрессии CtSus в суспензионных клетках Cistanche Deserticola в условиях стресса, вызванного засухой

Предварительные исследования в рамках проекта показали, что стресс от засухи, вызванный ПЭГ6000, может значительно увеличить накопление фенилэтанолгликозидов в суспензионных клетках Cistanche Deserticola. Через 3–9 дней после индукции содержание эхинацеазида значительно увеличивалось. С 12-го по 15-е сутки скорость роста содержания эхинакозида замедлялась и достигла максимального значения на 15-е сутки. Затем, по мере увеличения времени культивирования, содержание эхинакозида значительно увеличивалось. Содержание фруктозида постепенно снижалось [24]. Основываясь на этом исследовании, в этой статье использовалась кДНК необработанных суспензионных клеток Cistanche Deserticola и ПЭГ6000--индуцированных суспензионных клеток Cistanche Deserticola в качестве матриц для проведения количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени для изучения гена CtSus в суспензионных клетках Cistanche Deserticola под стрессовые условия засухи. Изменения уровня экспрессии. Результаты показаны на рисунке 4B. В суспензионных клетках Cistanche Deserticola, индуцированных ПЭГ6000, экспрессия CtSus значительно увеличивалась на 6-й день после индукции, достигала максимального значения на 9-й день, а затем снова падала до уровня контроля. Группы одного уровня. Приведенные выше результаты показывают, что стресс засухи может значительно увеличить экспрессию гена CtSus в суспензионной клеточной линии Cistanche Deserticola, что соответствует характеру накопления эхинацеазида при стрессе засухи. Однако пик экспрессии гена CtSus появляется раньше, чем пик содержания эхинацеазида, поскольку активный донор гликозила, синтезируемый катализом CtSus, является важным предшественником, необходимым для многоступенчатой ​​реакции гликозилирования на последующем пути биосинтеза эхинацеазида. Предполагается, что после стресса, вызванного засухой, организмы будут преимущественно мобилизовать гены, связанные с первичным метаболизмом, для достижения накопления активных доноров, а затем достигать важного вторичного метаболизма, накопления продуктов метаболизма.

5 Исследование трехмерной структуры белка CtSus и анализ ключевых активных центров

На основании функции CtSus в катализе продукции гликозильного донора UDP-глюкозы были дополнительно изучены структурные основы каталитической активности CtSus. Онлайн-инструмент SOPMA использовался для прогнозирования вторичной структуры белка. Результаты показали, что вторичная структура CtSus содержит 55,28% -спиралей, 25,47% случайных витков, 12,80% удлиненных нитей и 6,46% -витков (рис. 5А), что указывает на то, что -спирали являются наиболее важными вторичными структурными единицами в белке CtSus. за которыми следуют случайные клубки, на которые также приходится большая часть белка. Удлиненные нити и -витки распределены по всему белку. Согласно существующим исследованиям, сахарозосинтаза обычно существует в форме тетрамера, который считается ее активной формой. Поэтому в этой статье дополнительно использовался AlphaFold2 для предсказания структуры белка CtSus и была получена его трехмерная структура тетрамеров белка. Сравнение базы данных PDB (Protein Data Bank) показало, что сходство последовательностей сахарозосинтазы AtSus1 Arabidopsis thaliana (PDBID 3S28) и CtSus может достигать 77,93%. Предсказанная структура CtSus была сравнена с трехмерной структурой AtSus1, и значение среднеквадратического отклонения (RMSD) после суперпозиции белков составило 1,11 Å, что указывает на то, что пространственные структуры обоих очень согласуются (рис. 5B).

Рисунок 5. Структурное исследование CtSus. A: Прогнозируемая вторичная структура CtSus с использованием SOPMA.Blue: спираль; Фиолетовый: случайная катушка; Красный: удлиненная прядь; Зеленый: лист. B: Выравнивание трехмерной структуры AtSus1 (синий цвет) и CtSus (зеленый цвет). Оба были показаны как тетрамеры. C: Ключевые остатки в субстратсвязывающем кармане AtSus1 (синий цвет) и CtSus (зеленый цвет с мечеными остатками); D: Выравнивание связывающих конформаций UDP и фруктозы в AtSus1 (синий цвет) и CtSus (зеленый цвет); E: Взаимодействия между UDP и CtSus, показанные на двухмерной диаграмме, проанализированной клиентом Discovery Studio.

Сообщаемая структура кристаллического комплекса белок-лиганд AtSus1 Arabidopsis с UDP и фруктозой (PDBID3S29) была использована в качестве матрицы [16] для анализа способа связывания CtSus с UDP и фруктозой. Результаты молекулярного стыковки показаны на рисунке 5C. Можно заметить, что субстратсвязывающие карманы AtSus1 и CtSus очень похожи с точки зрения типа аминокислот, пространственного распределения и конфигурации, а перекрытие велико, что доказывает, что последовательность сахарозосинтазы высоко консервативна у растений. Конформации двух лигандов, UDP и фруктозы, в кармане связывания белкового субстрата показаны на рисунке 5D. Наиболее выгодная конформация молекулярного докинга UDP и CtSus хорошо перекрывается с конформацией UDP в кристаллическом комплексе AtSus1-UDP, что доказывает точность результатов молекулярного докинга. Взаимодействие между UDP и ключевыми аминокислотными остатками в кармане связывания белка-субстрата показано на рисунке 5E. UDP и CtSus в основном связаны между собой водородными связями и гидрофобными взаимодействиями. Ключевые аминокислотные остатки в кармане связывания субстрата включают Leu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 и Glu681.

Обсуждение

Модификация гликозилирования является одним из важных способов улучшения физических свойств и биологической активности натуральных продуктов или предшественников лекарств. По сравнению с традиционными химическими методами ферментативная модификация гликозилирования имеет преимущества мягких условий реакции, высокой селективности и экологичности. Однако реакция гликозилирования гликозилтрансфераз требует большого количества доноров УДФ-сахаров, которые дороги и труднодоступны, в результате чего гликозилтрансферазы не могут найти широкого применения в промышленном производстве. Сахарозосинтаза может катализировать обратимую реакцию: сахароза + УДФ ⇌ УДФ-глюкоза + фруктоза и может образовывать возобновляемый цикл УДФ-глюкоза посредством реакции сочетания с гликозилтрансферазой. Цистанхе трубчатая богата множеством гликозидных соединений разных структурных типов, представленных гликозидными соединениями фенилэтанола, что позволяет предположить, что активный путь синтеза гликозильных доноров в ее организме с участием сахарозосинтазы имеет сильный метаболизм, но соответствующая сахарозосинтаза из растений цистанхе не имеет сообщалось. В этом исследовании ген сахарозосинтазы CtSus был впервые клонирован из Cistanche Tubeulosa. Белок, кодируемый этим геном, содержит консервативный домен растительной сахарозосинтазы. При сравнении последовательности сахарозосинтаз других растений установлено, что сходство аминокислотных последовательностей между ней и сахарозосинтазами растений того же порядка составляет более 90%, что указывает на высокую степень консервативности последовательности сахарозосинтаз растений. Анализ молекулярной эволюции показал, что CtSus принадлежит к ветви сахарозосинтазы двудольных растений и наиболее тесно связан с сахарозосинтазой PrSus из P. ramosa семейства Orobanchaceae.

Чтобы изучить каталитическую активность CtSus, это исследование объединило гликозилтрансферазу UGT71BD1, активность которой была ранее подтверждена исследовательской группой, для создания системы совместной экспрессии двух плазмид. Посредством каталитических экспериментов на цельных клетках условия были достигнуты без добавления дополнительных доноров УДФ-сахара. Реакция гликозилирования соединения кумарина корицы и соединения стильбена ресвератрола. По сравнению с контрольной группой добавление CtSus значительно увеличивало скорость конверсии реакций гликозилирования, катализируемых UGT71BD1-. На этом основании в этом исследовании дополнительно была сконструирована рекомбинантная экспрессирующая плазмида CtSus и достигнута растворимая экспрессия рекомбинантного белка в E. coli. In vitro ферментативно-каталитические реакции показывают, что в присутствии сахарозы и УДФ CtSus может катализировать генерацию УДФ-глюкозы, а после удаления аффинной метки триггерного фактора, содержащейся в рекомбинантном белке, продукт CtSus, катализирующий генерацию УДФ - получена глюкоза. Скорость значительно улучшилась. Результаты трансформации цельных клеток и ферментативно-каталитических реакций in vitro подтвердили активность CtSus как каталитически активного донора сахарозосинтазы УДФ-глюкозы. Для дальнейшего изучения корреляции между геном CtSus и биосинтезом гликозидов в Cistanche tuberosum экспрессия CtSus в различных частях Cistanche tuberosum была проанализирована с помощью экспериментов по количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени. Результаты показали, что этот ген экспрессируется в гаусториях Cistanche tuberosum. Высший уровень экспрессии. Cistanche Deserticola является паразитическим растением и не может получать питательные вещества, необходимые для роста и развития, посредством фотосинтеза. Следовательно, ему необходимо паразитировать на корнях растения-хозяина и полагаться на растение-хозяин для получения питательных веществ для поддержания роста. У растений сахароза в основном является донором энергии и углерода [12]. Однако сахароза не может быть использована непосредственно клетками и требует дальнейшего разложения. Гаустория является мостом, соединяющим Cistanche Deserticola и растение-хозяин, и играет жизненно важную роль в процессе его роста. ключевой

[25], поэтому высокая экспрессия сахарозосинтазы в гаусториях Cistanche Deserticola вполне объяснима. Высокая экспрессия CtSus в гаусториях также согласуется с характером большого накопления фенилэтаноидных гликозидов в гаусториях. Кроме того, с помощью флуоресцентного количественного ПЦР-анализа изменений уровня экспрессии генов CtSus в суспензионных клетках Cistanche Deserticola в разные моменты времени в условиях стресса засухи было обнаружено, что стресс засухи может значительно повысить экспрессию генов CtSus в суспензионной клеточной линии, что в соответствии с echinaceaside. Характер накопления в суспензионных клеточных линиях в условиях стресса, вызванного засухой, является постоянным. Приведенные выше результаты позволяют предположить, что CtSus участвует в биосинтетическом пути фенилэтаноидных гликозидов, представленных эхинацеей у Cistanche tulipis in vivo. Это один из многих путей биосинтеза. Реакция гликозилирования первой стадии обеспечивает активный донор гликозила УДФ-глюкозу. Короче говоря, это исследование

Исследование идентифицировало новый ген сахарозосинтазы у Cistanche Deserticola, который позволил осуществлять ферментативный синтез in vitro активных гликозильных доноров и предоставил новые генетические элементы для создания инженерных бактерий для биосинтеза гликозидов Cistanche Deserticola.

Вклад авторов: Тянь Вэйшэн отвечал за биоинформатический анализ, анализ экспрессии, анализ активности ферментов и написание первого проекта гена CtSus; Ян Яру отвечал за скрининг и клонирование генов; Цуй Сяосюэ и Хуан Вэньцянь участвовали в биоинформатическом анализе и анализе экспрессии; Ван Инся и Чжао Сайцзин участвовали в конструировании векторов и анализе активности ферментов; Ли Цзюнь и Ши Шепо в основном руководили анализом активности ферментов и анализом экспрессии; Ту Пэнфэй и Лю Сяо отвечали за разработку идеи статьи, руководство экспериментами, а также за написание и редактирование статьи. Все авторы участвовали в доработке статьи.

Ссылки

[1] Сун Ж., Лей Л., Ту П.Ф. Успехи в исследовании фармакологической активности растений CistancheHoffing. и ссылка [J]. Препараты на основе трав Чин Традит (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Лю WJ, Лю Y, Сонг QQ и др. Сравнение хемом культивируемой и дикой цистанчетубулозы с использованием 1H-ЯМР-спектроскопии [J]. Китай J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Сун Ю, Цзэн К., Цзян Ю и др. Cistanches Herba: от исчезающего вида до известного бренда китайской медицины [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.[4] Лю Ю, Ван Х, Ян М и др. Полисахариды Cistanche Deserticola защищают клетки PC12 от повреждений, вызванных OGD/RP [J]. Биомед Фармакотер, 2018, 99: 671-680.

[5] Инь Ю, Хуан Дж, Гу X и др. Эволюция растительных ферментов взаимного превращения нуклеотидов и сахаров [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Бар-Пелед М., О'Нил М.А. Образование растительных нуклеотидных сахаров, взаимное преобразование и утилизация путем переработки сахара [J]. Анну Рев Плант Биол, 2011, 62: 127-155.

[7] Го Х, Ли Л, Ван П.Г. Биохимическая характеристика UDP-GlcNAc/Glc4-эпимеразы Escherichia coli O86:B7 [J]. Биохимия, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Донг С., Чеснокова О.Н., Тернбоу К.Л. младший и др. Идентификация UDP-N-ацетилглюкозамин4-эпимеразы, участвующей в гликозилировании белка экзоспория у Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Ли Л.Н., Конг JQ. Полнотранскриптомная идентификация генов сахарозосинтазы у Ornithogalumcaudatum [J]. РСК Адв, 2016, 6: 18778-18792.

[10] Шмёльцер К., Гутманн А., Дирикс М. и др. Сахарозосинтаза: уникальная гликозилтрансфераза для развития процесса биокаталитического гликозилирования [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.[11]Кардини CE, Лелуар Л.Ф., Чирибога Дж. Биосинтез сахарозы [J]. J Biol Chem, 1955, 214: 149-155.